Angiotensiini II-reseptorin ilmentymisen ja suhteessa helikobakteeri-infektion vatsassa mongoliangerbiili

Angiotensiini II-reseptorin ilmentymisen ja suhteessa helikobakteeri
infektio mahassa on mongoliangerbiili
tiivistelmä
tausta
rooli reniini-angiotensiini-järjestelmän mahalaukun fysiologiassa ja tauti on vielä ollut harvaan tutkittu. Ensimmäinen tavoite oli tutkia perustason läsnäolo ja sijainti angiotensiini II reseptorien (AT1R ja AT2R) vatsassa on mongoliangerbiili. Toinen tavoite oli valaista onko läsnäolo H. pylori
infektio liittyy muutoksiin ilmaisua näiden reseptorien. Tool Menetelmät
helikobakteeri
-negatiivinen ja H. pylori
tartunnan (kanta SS1 tai TN2GF4) uros Mongolian gerbiilit tutkittiin. Vatsat tutkittiin kuusi tai 12 kuukausi ymppäyksen jälkeen käyttäen immunohistokemiaa, Western blot ja mikroskooppiset morfometria.
Tulokset
AT1R ja AT2R oli sijoitettu eri solujen antilooppirottamallissa mahalaukun seinämän, mukaan lukien alapopulaatio endokriiniset solut antral limakalvon ja tulehdussolujen soluttautuminen helikobakteeri
infektoiduista vatsat. Gerbiilit tartunnan SS1 kanta oli merkittävästi lisääntynyt antral AT1R proteiinin ilmentymisen ja lisääntynyt määrä infiltroituvien liuskatumaisten leukosyyttien (PMN) 12 kuukauden kohdalla. AT1R proteiinin ekspressio korreloi määrä PMN: ien ja antrumin ilmaisun myeloperoksidaasin.
Päätelmät
angiotensiini II reseptoreita on läsnä erilaisissa soluissa mahalaukun seinämän mongoliangerbiili. Tulokset osoittavat vaikutusta riippuvainen H. pylori
rasitusta mahalaukun AT1R ilmaisun ja suhde mahan AT1R ilmaisun ja limakalvojen PMN infiltraatio.
Tausta
rooli reniini-angiotensiinijärjestelmän (RAS) mahalaukun fysiologian ja tauti vielä ole harvaan tutkittu. Jotkut tutkimukset ovat raportoineet angiotensiini II (Ang II) limakalvojen veren virtausta, erityksen ja sileän lihaksen supistumisen [1-3]. Toiset ovat sekaantuneet vaikutuksen RAS stressin aiheuttama mahalaukun vammoja ja iskemia /reperfuusiovaurio mahalaukun limakalvon [4, 5].
Klassinen hormonaaliset luonne RAS on tunnettu sen vaikutuksia hemodynaamisia sääntelyä ja kehon nesteen homeostaasin. Vähemmän tiedetään vaikutus säätelyyn kudoksessa paikallisen RAS joka on osoitettu useissa elimissä, esim. aivoissa, haimassa, ruokatorvessa ja paksusuolen [6-8]. Interstitial tuotanto Ang II saattaa esiintyä paikallisen tuotannon angiotensinogeenia (AGT), ACE ja reniinin, tai vaihtoehtoista tietä myös pilkkominen verenkierrossa AGT muut paikallisesti ilmaistuna entsyymejä, kuten katepsiini K ja kymaasia [9]. Ang II toimii pääasiassa kahden reseptorin, nimetyt Ang II tyypin 1 -reseptorin (AT1R) ja Ang II tyypin 2 reseptorin (AT2R). Niinpä kartoitus ilmaisun ja sijainti Ang II reseptorien on suuri merkitys tutkimaan mahdollisia Ang II signalointi eri fysiologisten ja patologisten asetukset. Viime vuosina RAS on osoitettu olevan osallisena erilaisissa patologisissa tiloissa, kuten tulehdus, haavan paranemista ja karsinogeneesin [10, 11]. Epidemiologiset tutkimukset ovat myös osoittaneet assosiaatioita RAS liittyvien geenin polymorfismi (SNP) ja kehittäminen mahahaavan ja mahasyövän [12, 13]. Kuitenkin järjestöjen välillä kudosilmentämisen Ang II reseptorien ja helikobakteeri
infektiota ei ole raportoitu. Potentiaali RAS moduloida paikallisia tulehdusreaktioita tekee kiinnostavaa tutkia sen suhteen hyvin määriteltyjä gastriitti herättämän helikobakteeri
.
Tässä tutkimuksessa selvitimme ilmaus Ang II reseptorien infektoimattomat ja helikobakteeri
infektoiduista mongoliangerbiili. Tämä eläinmalli on mielenkiintoinen, koska se voidaan helposti H. pylori -infektio
, jolloin krooninen aktiivinen tulehdus patologisia muutoksia, jotka jäljittelevät useimmat vaurioita todettu ihmisillä, mukaan lukien mahahaavat, mahalaukun suoliston metaplasia ja mahasyövän, kuten kuva [14]. Olipa Helikobakteeri
infektio yksin aiheuttaa mahasyövän Mongolian gerbiilit jää alle keskustelua [15].
Ensimmäinen tavoite oli tutkia perustason läsnäolo ja sijainti AT1R ja AT2R vatsassa ja mongoliangerbiili. Toinen tavoite oli valaista onko läsnäolo H. pylori
infektio liittyy muutoksiin ilmaisua näiden reseptorien. Tool Menetelmät
Eläimet
Kokeet hyväksynyt eettinen komitea Kokeet Eläimet, Göteborgin yliopisto. Kolmekymmentä erityisiä patogeenittomia (SPF) uros Mongolian gerbiilit (Charles River, Uppsala, Ruotsi), seitsemän viikon iässä, käytettiin. Ne jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään samankokoiseen, joka koostuu yhteen verrokkiryhmään ja kahteen ryhmään, jotka oli määrä tartunta helikobakteeri
. Viisi eläimiä pidettiin kussakin häkissä ja huone säädettiin lämpötilan suhteen (18-22 ° C), kosteutta (noin 55%) ja valo /pimeä sykli (12 /12h). Gerbiilit oli vapaa pääsy ruokaan (2016F, Harlan Tek. Lab, Blackthorn, Englanti) ja juomavettä. He saivat viikon akklimatisaatio ennen rokotus.
Bakteerikannat ja rokotus
Kaksi eri H. pylori
kantoja käytettiin inokulaation TN2GF4 kanta [16] ja Sydney kannan 1 (SS1) [ ,,,0],17]. Molemmat kannat ovat tiedetään aiheuttavan krooninen aktiivinen tulehdus gerbiilin mahalaukun antrumin ja ruumiillisen limakalvolle. Bakteereja kasvatettiin Columbia levyillä. Näitä viljelmiä käytettiin sitten 500 ml: Brucella liemi, joka sisälsi 5% vastasyntyneen vasikan seerumia, 10 ug /ml vankomysiiniä ja 5 ug /ml trimetoprim. Pulloja inkuboitiin 24 tuntia mikro aerobisissa olosuhteissa 37 ° C: ssa. Bakteerit tutkittiin faasikontrastimikroskoopilla ennen annettiin eläimille. Gerbiilit infektoitiin 0,5 ml Bakteerisuspension tai Brucella liemi vain (valvonta) käyttäen ruokintaneulan. Elävien bakteerien tehtiin suspension määritellä todellista tarttuvaa annokset, jotka olivat 7 × 10 7 yksikköä ja 4 x 10 7 yksikköä SS1 ja TN2GF4, vastaavasti.
Ajan myötä ja uhrata
sen jälkeen 24 tunnin paasto on vapaa pääsy juomaveden, viisi eläintä kustakin ryhmästä lopetettiin kuusi tai 12 kuukautta istutuksen jälkeen. Eläimet nukutettiin injektoimalla vatsaonteloon medetomodin (0,5 mg /kg) ja ketamiinia (75 mg /kg). Keskiviivan laparotomia suoritettiin ja mahat poistettiin sitten ja avattiin pitkin suuri kaarevuus. Puolet käytettiin kulttuuriin, ja näytteet kerättiin toisen puolen histologista analyysejä ja western blot-analyysi. Eläimiä tapettiin sydämen viilto. Histopatologiset löydökset ja bakteriologinen status on raportoitu aiemmin [14].
Immunohistokemia
koko seinän yksilöt (antrumiin ja corpus) kerättiin heti avaamisen jälkeen vatsat, vahvistettu Histofix (Histolab tuotteet AB, Göteborg, Ruotsi ) huoneenlämpötilassa (RT) yli yön ja sitten huuhdottiin PBS: ssä 24 tunnin ajan. Näytteet olivat tämän jälkeen kuivattu, upotettiin parafiiniin, leikattiin 5-μ
paksummat kohdat ja asetettiin lasilevyille. Ennen immunohistocemical värjäys, kohdat poistettiin parafiini ja keitettiin sitruunahappopuskuriin (0,01 M, pH 6,0, 10 min). Immunocruz TM Värjäys System (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) käytettiin immunohistokemian protokollaa. Sen jälkeen, kun esto endogeenisen peroksidaasin aktiivisuuden, ei spesifinen sitoutuminen sekundäärisiä vasta-aineita estettiin inkuboimalla vuohen normaalia seerumia 30 min RT: ssa. Seuraavat kaksi polyklonaalisia primaarisilla vasta-aineilla, laimennuksia ja inkubointiajat käytettiin sitten: kanin anti-AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech, 1: 100 PBS: ssä, 2 h RT: ssa) ja kanin anti-AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech, 1: 100 PBS: ssä, 2 h RT: ssa). Inkuboinnin jälkeen primaarisilla vasta-aineilla, leikkeet pestiin kolme kertaa PBS: ssä ja tutkittiin biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen; monimutkainen havaittiin käyttäen piparjuuren peroksidaasi (HRP) -streptavidin ja väri kehitettiin käyttäen 3,3'-diaminobentsidiiniä (DAB).
odottamattoman voimakas solujen värjäys tyypillinen ulkonäkö endokriinisten solujen todettiin sen jälkeen, kun immunohistokemiallisella värjäyksellä tämän peroksidaasipohjaista menetelmällä. Immunoflourescens merkinnät tehtiin edelleen sulkea pois sitä mahdollisuutta, että tämä värjäytyminen johtui endogeenisen biotiinin, endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus tai epäspesifinen sitoutuminen toissijaisen vasta-aineen. Seuraavaa menettelyä käytettiin: keittämisen jälkeen sitruunahappopuskuria, ei spesifinen sitoutuminen sekundäärisiä vasta-aineita estettiin inkuboimalla normaalia vuohen seerumia (sc-2043, Santa Cruz Biotech) 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Leikkeitä inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla kuten edellä. Levyjä pestiin sitten kolme kertaa PBS: llä ja tutkittiin sekundaarisen vasta-aineen Alexa Jauhot 488 konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä (A-11034, Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA), laimennettuna 1: 400 PBS: ssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Objektilasit pestiin seuraavaksi kolme kertaa PBS: ssä ja kiinnitettiin fluoresenssi kiinnitysväliaine (DakoCytomation, Glostrup, Tanska), jonka jälkeen kuvat otettiin kiinni fluoresenssimikroskoopilla. Vahvista sijainti AT1R hormonaalisten soluissa, immunohistokemiallisen suoritettiin käyttäen edellä kuvattua peroksidaasipohjaista protokolla AT1R ja edellä kuvatun immunoflorescens merkintöjä protokolla ensisijainen ainetta, joka kohdistetaan Kromograniini A (C-20, Santa Cruz Biotech, 1: 100 PBS, 2 h RT: ssa). Epäspesifisen sitoutumisen sekundaarisen vasta-aineen (Alexa Jauhot 568-konjugoidulla aasin anti-vuohi lgG: llä, A-11057, Molecular Probes Inc, 1: 800 PBS: ssä, 1 h RT: ssa) estettiin inkuboimalla normaalin aasi seerumin (sc-2044 , Santa Cruz Biotech). Preabsorpion ylimäärän kanssa (5 x) estävän peptidin (sc-1173P, Santa Cruz Biotech) suoritettiin kontrollina spesifisyyden AT1R vasta-aineen, kun taas ensisijainen vasta-aine oli jätetty pois AT2R.
Gerbiilin AT1R ja AT2R on > 90%: aminohappohomologia identtisyys ihmisen, rotan ja hiiren Ang II-reseptoreja [18, 19]. Gerbiileillä, kuten rotat ja hiiret, on kaksi AT1R alatyyppiä (AT1aR ja AT1bR), joita koodaavat eri geenit, mutta 95%: n aminohapposekvenssihomologia. Näiden reseptorialatyyppien tiedetään differentiaalisesti paikallisia ja säädellä, mutta on samanlainen affiniteetti Ang II. Koska korkeat aminohapposekvenssin välistä homologiaa hamsterin AT1aR ja AT1bR, me oletetaan vastaavan sitoutumisaffiniteetti AT1R alatyyppejä varten AT1R käytetty vasta-aine esillä olevassa tutkimuksessa. Lisäksi vasta-aineita käytetään värjäyksessä Ang II reseptorit valmistajan laatimien hiirillä, rotilla ja ihmisillä. Siksi spesifisyyden varmistamiseksi näiden vasta-aineiden gerbiilit, osastoja parafiiniin lohkot normaalin gerbiilin ja ihmisen lisämunuaisen värjättiin kuten edellä (paitsi että molemmat ensisijainen vasta-aineet laimennettiin 1:50 PBS: ssä) ja jakelun kaavoja Ang II reseptorin vasta tutkittiin. Lisämunuaisen jakelu tutkimukset osoittivat, että anti-AT1R-vasta pääasiassa värjätään lisämunuaiskuoren solujen zona glomerulosa (värjäys kapselin ympärillä rauhanen, sileän lihaksen soluissa (VSMCs) ja endoteelisoluissa ilmoitettu) sekä gerbiilin ja ihmisen osaan. Anti-AT2R-vasta värjätään lisämunuaisytimessä soluja ja solujen zona glomerulosa vuonna gerbiilin ja ihmisen lisämunuaisen (värjäys VSMCs ja endoteelisolujen Havaittiin myös käyttämällä tätä vasta-aine). Nämä tulokset samaa mieltä aiemmin raportoidussa tutkimuksessa [20], ja voimakas samankaltaisuus värjäyshahmojen antilooppirottamallissa ja ihmisen lisämunuaisen tukevat yleistä käyttökelpoisuutta vasta-aineiden gerbil kudoksissa.
Western blot
avaamisen jälkeen mahat, koko paksuudeltaan antral seinän näytteet kerättiin välittömästi talteen, pakastettiin nestetypessä ja säilytettiin -70 ° C: ssa. Näytteet homogenisoitiin jäällä (Polytron PT-MR 2100, Kinematica, Sveitsi) puskurissa A (10% glyseroli, 20 mM Tris-HCL, pH 7,3, 100 mM NaCl, 2 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 2 mM EDTA, 2 nM EGTA , 10 mM natriumortovanadaatti, 10 ug /ml leupeptiiniä ja 10 ug /ml aprotiniini) [21] ja sentrifugoitiin 30000 g: llä 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Pelletit suspendoitiin uudelleen puskuriin B (1% NP-40 [Sigma-Aldrich, Tukholma, Ruotsi] puskurissa A) ja sekoitettiin 4 ° C: ssa 1 tunnin ajan, ennen kuin sentrifugoimalla 30000 g: llä 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantit analysoitiin proteiinipitoisuus Bradfordin menetelmällä [21] ja niitä säilytettiin -70 ° C: ssa lisäanalyyseihin saakka. Näytteet laimennettiin SDS-puskuriin ja kuumennettiin 70 ° C: ssa 10 minuutin ajan ennen kuin ne ladattiin NuPage 10% Bistris geeli (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Yksi kaista ladattiin edeltä käsin värjätty Molekyylipainostandardien (SeeBlue ™, Invitrogen AB, Lidingö, Ruotsi), ja kokosolulysaateista PC-12 (AT1R, sc-2250, Santa Cruz Biotech), HEP G2 (for AT2R; SC- 2227, Santa Cruz Biotech) ja HL60 (varten myeloperoksidaasi (MPO), 12-354, Upstate Lake Placid, NY, USA) käytettiin positiivisina verrokkeina. Polyvinyylifluoridista kalvoja (Amersham, Buckinghamshire, UK) inkuboitiin polyklonaalisella kanin vasta-aineita vastaan ​​AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech), AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech) tai MPO (07-496, Upstate). Alkalinen fosfataasi konjugoitua vuohen anti-kani-vasta-ainetta (sc 2007, Santa Cruz Biotech, että AT1R ja AT2R vasta-aineita, ja IgG-12-448, Upstate, että MPO-vasta-aine) ja CDP-Star substraattia (Tropix, Bedford, MA, USA ) käytettiin tunnistamaan immunoreaktiivisia proteiineja chemiluminescense. Kuvat otettiin vangiksi jäähdytettyä CCD-kamera (LAS-1000, Fujifilm, Tokio, Japani) ja puolittain määrällisesti tehtiin vertaamalla näytteitä positiivisia kontrolleja Mittari 3.3 ohjelmisto (Fujifilm, Tokio, Japani).
Microscopic morfometria
Tissue yksilöitä antral seinästä kiinnitettiin Histofix (Histolab Products AB) ja upotettiin parafiiniin. Neljän μ
paksut leikkeet kiinnitettiin koodattu lasilevyille ja rutiininomaisesti värjättiin hematoksyliinillä /eosiinilla (H &E). Aste limakalvon soluttautumisen mononukleaaristen ja liuskatumaisten leukosyyttien tutkittiin valomikroskoopilla. Lamina propria kasvattaa helposti volyymin seurauksena tulva tulehdussolujen. Siksi suhteellinen tilavuus lamina propria arvioitiin morfometria vastaamaan tunkeutuminen sekä mononukleaaristen ja liuskatumaisten leukosyyttien. Tämä toteutettiin H.F.H. kevyt mikroskooppi, jossa on 10 x 10 neliön verkon työnnetään okulaari ja × 25 objektiivilinssin. Osoittamalla laskentamenetelmän [22], tilavuusdensiteetistä lamina proprian määritettiin ja ilmaistiin prosentteina limakalvon (tässä tapauksessa määritelty välisellä alueella limakalvon pintaan ja pohjaan rauhaset). Limakalvon tilavuus määritellään tässä epiteelin kerros + lamina propria. Limakalvon soluttautuminen liuskatumaisten leukosyyttien (PMN) arvioitiin P.H. kevyt mikroskooppi, jossa on 10 x 10 neliön verkon työnnetään okulaari, a × 50 immersioöljyobjektiivilinssillä (N.A. 1,4) ja öljyssä top linssi lauhduttimen (N.A. 1,4). PMN: t tunnistettiin suunnilleen pyöreä soluja lamina propriassa kanssa tummiksi värjäytyneet multilobulated tai bilobulated tumassa. Lukumäärä PMN neliön alueella limakalvon määritettiin, kuten kokonaismäärä neliöiden yli lamina propria; lukumäärää PMN ilmaistaan ​​per 1 mm 2 lamina propria. Laskenta alkoi pohjasta rauhasten ja päättyi arvioinnin jälkeen yhdestä seitsemän täysimittaista Leikkuut limakalvon, jolloin vähintään 0,077 mm 2lamina propria analysoitiin per jakso. Järjestelmällisesti näytteitä satunnainen alku valinnassa on käytetty alueiden tutkittava molemmissa analyyseissä. Alueet, joilla imukeräsissä kuulumattomana.
Tilastollinen analyysi
Kruskal-Wallisin testiä ja Mann-Whitneyn U-testi arvioidaan merkitystä erot proteiinin ilmentymisen välillä hallinnassa, TN2GF4-tartunnan ja SS1-tartunnan ryhmiä. Mann-Whitneyn U-testi arvioidaan merkitys eroja limakalvon tulehdussolujen välillä TN2GF4-tartunnan ja SS1-tartunnan gerbiilit. Lineaarinen suhde AT1R-proteiinin ja PMN, ja lineaarinen suhde AT1R ja ln (MPO) on antral limakalvon testattiin Pearsonin korrelaatio. Kaikki testit kaksisuuntaisia, ja tilastollinen merkitsevyys asetettiin p < 0,05. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin SPSS, versio 15.0 (SPSS Inc. Chicago, Illinois).
Tulokset
lokalisaatio AT1R ja AT2R proteiinin
immunoreaktiivisuus on AT1R ja AT2R proteiineihin havaittiin kaikissa gerbil näytteet tutkitaan, ja mitään värjäytymistä ei havaittu Ohjausosuudet. AT1R vasta-aine on yleensä indusoi selvemmin värjäytymistä kuin AT2R vasta-aine.
Useita kudoslokerojen sekä korpuksen ja antrum, riippumaton läsnäolon tai puuttumisen H. pylori
-infektio, esillä immunoreaktiivisuus sekä Ang II -reseptorin alatyyppejä (katso taulukko 1 on yhteenveto tuloksista ja kuvio 1 edustavien osiin. Katso myös muihin tiedosto 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ja 15 korkean resoluution kuvia). Siten immunoreaktiivisuus sekä AT1R ja AT2R havaittiin endoteelisoluissa alusten sijaitsee lamina propria, The submukoosassa (kuvio 1 B) ja muscularis propria, samoin kuin sileän lihaksen soluissa muscularis limakalvojen ja muscularis propria (kuvio 1C ja 1G) ja joissakin mesenkyymisolujen sijaitsevat lamina propriassa ja submukoosassa. Heikko värjäytyminen Molempien reseptorien myös huomattava, pääasiassa pohjapinta osa useimpien epiteelisolujen. Distinct värjäys sisäiset hermo rakenteita ei havaittu. Immunoreaktiivisuus vain AT1R havaittiin verisuonten sileän lihaksen soluissa alusten submucosa, muscularis propria ja herakalvojen sekä korpuksen ja antral osaa mahan (kuva 1A ja 1G). Mielenkiintoista on, että vahva immuunivärjäykseen AT1R ilmestyi solujen alijoukon, pääasiassa pohjan antral rauhaset. Nämä solut osoittivat tyypillisen hormonitoimintaa solujen ulkonäkö, eli ne olivat melko pieniä, solun elinten lähellä tyvikalvon; kapea merkkijono solulimassa havaittiin joissakin tapauksissa (kuvio 1G, 1H ja 1I). Tällaiset AT1R värjäystä ei löytynyt hormonaalisten kaltaisten solujen oxyntic limakalvolla. Double immuunivärjäykseen AT1R ja yleiseurooppalaisen hormonitoimintaa merkki kromograniini a [23] vahvistettiin sijainti AT1R vuonna alipopulaatio hormonitoimintaa solujen antilooppirottamallissa antral limakalvon (kuvio 1M ja 1N) .table 1 sijainnilla AT1R ja AT2R proteiinin mahan seinän mongoliangerbiili
Kudososastojen

Cell type
AT1R

AT2R
Mucosa
epiteelin Dating epiteelisolujen
+ lähinnä pohjapinta osissa
+ lähinnä pohjapinta osissa
Pieni epiteelisolujen pohjassa rauhaset
+++ joissakin hormonitoimintaa, kuten soluja antrumissa
ei
Products proprialle
verisuonistossa
+ vuonna endoteelin
+ vuonna endoteelin
Nerve rakenteita
no
no
mesenkyymisolujen
++ joissakin soluissa;
++ leukosyyttien in helikobakteeri
infektoiduista
+ joissakin soluissa;
++ leukosyyttien in helikobakteeri
infektoiduista
muscularis limakalvojen
sileät lihassolut
++
+
submukoosassa
verisuonistossa
+ vuonna endoteelin;
++ vuonna VSMCs
+ vuonna endoteelin;
no vuonna VSMCs
Nerve rakenteita
no
no
mesenkyymisolujen
++ joissakin soluissa;
++ leukosyyttien in helikobakteeri
infektoiduista
+ vuonna jotkin solut;
++ leukosyyttien in helikobakteeri
infektoiduista
muscularis proprialle
sileät lihassolut
++
+
verisuonistossa
+ vuonna endoteelin;
++ in VSMCs
+ vuonna endoteelin;
no vuonna VSMCs
Nerve rakenteita
N.O.
N.O.
herakalvojen
verisuonistossa
N.O. vuonna endoteelin;
++ in VSMCs
no
no: ei havaittu (tai epäspesifisesti) immunoreaktiivisuus
+: heikko immunoreaktiivisuus mutta erilliset sijainti
++: tunnistaa helposti immunoreaktiivisuus
+ ++: voimakas immunoreaktiivisuus
VSMCs: sileän lihaksen soluissa
Kuvio 1 osoittaminen immunohistokemiallinen sijainti AT1R ja AT2R vatsassa on mongoliangerbiili. A-F esitetään kohdissa päässä antral alueeseen SS1-tartunnan gerbiilille, 12 kuukauden kuluttua inokulaation. A) sileän lihaksen soluissa (VSMC) valtimoon sijaitsee herakalvojen tahra positiivinen AT1R proteiinin (vihreä väri). B) endoteelisoluja (pää) ja tunnistamattomat mesenkyymisolujen (m) sijaitsee submukoosassa osoittaa immunoreaktiivisuus varten AT2R proteiinia. C) Sileän lihaksen solut lihasten kerros muscularis propria tahra positiivinen AT2R proteiinia. D) Negatiivinen kontrolli (perättäinen osio A) esiabsorboitiin kanssa esto peptidi varten AT1R vasta-osoittaen keltainen autofluoresenssin erytrosyyteistä. E & F) Negatiiviset kontrollit varten AT2R vasta-, peräkkäistä osiot B & C, vastaavasti. G, H esittää osia siitä antrumin alueella verrokkieläimeen 6 kuukautta inokulaation jälkeen ja osio (I) on peräisin TN2GF4-tartunnan hamsterin 12 kuukausi ymppäyksen jälkeen. Vahva immuunivärjäykseen AT1R havaittiin soluissa, joilla on tyypillinen ulkonäkö endokriinisten solujen (e). Muscularis limakalvoille (mm), muscularis propria (mp) ja sileän lihaksen soluissa (VSMC) myös värjätään positiivisia AT1R. Peroksidaasia perustuva menetelmä (ruskea väri) käytettiin värjäykseen AT1R G, H ja immunofluoresenssilla (vihreä väri) käytettiin värjäykseen AT1R in (I). J, K ja L) peräkkäistä leikettä päässä antrumin alue, joka TN2GF4-tartunnan hamsterin 6 kuukausi ymppäyksen jälkeen. J) immuunivärjäytyminen AT1R (vihreä) näyttää aggregaatit leukosyyttien (leu) ilmentävät AT1R proteiinia. K) Negatiivinen kontrolli osioon J osoittaen keltainen autofluoresenssin erytrosyyteistä. L) Peräkkäiset osan osan K, rutiininomaisesti värjättiin H &E, joka vahvistaa, että aggregaatit ovat valkosolut. M ja N osoittaa kaksinkertainen immuunivärjäykseen AT1R (ruskea väri M) ja yleiseurooppalaisen hormonitoimintaa merkki Kromograniini A (punainen väri N), jonka antral osan verrokkieläimeen. Valkoisen nuolen M ja N pisteitä solun tyven antral rauhanen, joka värjätään positiivinen sekä AT1R ja Kromograniini A. Useat Kromograniini Positiivinen soluja ei immunopositiivista sen AT1R. § O osoittaa neutrofiilien (PMN) on antral limakalvolla sellaisen SS1-tartunnan gerbiilille, 12 kuukautta istuttamisen jälkeen.
Voimakkuus ja jakautuminen immunoreaktiivisuus edellä kuvatun ei näyttänyt olevan erilaiset helikobakteeri
-negatiivisilla ja H. pylori
infektoiduista eläimistä tai eläinten välisestä lopetettiin kuusi tai 12 kuukautta istutuksen jälkeen. Kuitenkin yksi selvä ero välillä todettiin helikobakteeri
-negatiivinen ja helikobakteeri
infektoiduista eläimistä toisin infektoitumattomassa gerbiilit, osat sekä antrum ja korpus tartunnan saaneiden eläinten osoittivat runsaasti tulehdussolujen lamina propria kanssa immunoreaktiivisuus sekä AT1R ja AT2R. Yhdessä TN2GF4-tartunnan saaneet eläimet lopetettiin kuuden kuukauden aggregaatteja tulehdussolujen havaittiin myös muscularis propriassa (kuvio 1J, 1K ja 1L). Ei ilmeisiä eroja värjäyskuviot tai intensiteetissä havaittiin välillä tartunnan saaneiden eläinten kanssa TN2GF4 kanta tai SS1 kannan välillä tai eläimet lopetettiin kuusi tai 12 kuukautta istuttamisen jälkeen.
Kvantifiointi AT1R ja AT2R proteiinia ja suhteessa tulehdussolujen
Koska samanlaisia ​​immunohistokemiallinen ulkonäkö angiotensiini II reseptorien corpus ja antrum (lukuun ottamatta, että AT1R ilmentävien alaryhmästä endokriinisten solujen mainittu edellä) sekä kuusi ja 12 kuukautta, kvantitatiivisia arvioita tehtiin rajoitettu antral yksilöitä 12 kuukautta inokulaation jälkeen .
sekä AT1R ja AT2R proteiinit tunnistettiin western blot kaikissa näytteissä (kuvio 2). 12 kuukauden kuluttua on infektio, AT1R proteiinin ekspressio oli merkittävästi suurempi SS1-tartunnan saaneista eläimistä kuin kontrolleilla tuolloin (kuvio 3). Ei merkittäviä eroja AT2R proteiinin ilmentyminen havaittiin eri ryhmien gerbiilit (ei esitetty). Kuva 2 Esimerkkejä kuvan Western blot. Ylälevy: immunoreaktiivisuus vastaan ​​AT1R 41 kDa PC-12 solulysaattina (positiivinen kontrolli) ja antral koko seinän näytteitä. Pohjalevy: immunoreaktiivisuus vastaan ​​AT2R osoittaa heikko bändi 44 kDa Hep G2 (positiivinen kontrolli) ja bändejä antral koko seinän näytteitä.
Kuvio 3 Boxplot osoittaa AT1R proteiinin ilmentymisen 12 kuukautta inokulaation antilooppirotilla tartunnan helikobakteeri kantoja TN2GF4 ja SS1 ja valvontaa. AT1R proteiinin ilmentymiseen oli merkitsevästi korkeampi SS1-tartunnan saaneiden eläinten kontrolleihin verrattuna (Kruskal-Wallisin testiä ja U-testi). Proteiini tasot on esitetty optinen tiheys (OD). Mediaaniarvot on osoitettu poikittaisen linjan sisällä ruutuun kvartiiliväli pystysuoran laajuus ruutuun ja koko alue, jonka viikset.
Koska helikobakteerin
infektoiduista eläimistä tuli runsaasti AT1R ilmentävien tulehdussolujen niiden mahan limakalvoa ja lisääntynyt antral AT1R ilme, määrällinen analyysi tulehdussolujen limakalvolla tehtiin arvioida, säätely ylöspäin AT1R proteiinin SS1-tartunnan gerbiilit liittyi limakalvon tulehdussolujen.
aste limakalvon tunkeutumisen sekä mononukleaaristen ja liuskatumaisten leukosyyttien (heijastama tilavuusdensiteetistä lamina propria) ei ollut eroa SS1-tartunnan ja TN2GF4-tartunnan gerbiilit. Kuitenkin limakalvon tunkeutumisen polymorfonukleaaristen leukosyyttien (PMN: t) oli merkitsevästi korkeampi SS1-tartunnan saaneista eläimistä kuin TN2GF4-tartunnan saaneista eläimistä 12 kuukautta inokulaation jälkeen (taulukko 2). PMN: t on H. pylori
infektoiduista limakalvon koostui lähes yksinomaan neutrofiilien (kuva 1O); vain muutama eosinofiilinen eikä basofiilisiä soluja voitiin tunnistettu microscope.Table 2 kvantitatiivinen analyysi tulehduksellisten solujen antilooppirottamallissa antral limakalvolla 12 kuukauden kuluttua Helicobacter pylori
infektion

Ohjaus
TN2GF4
SS1
Limakalvorokotteita soluttautumista mononukleaaristen ja liuskatumaisten leukosyyttien (heijastama äänenvoimakkuuden tiheys (%) lamina propria)
26,7 ± 2,4
47,1 ± 2,2
41,3 ± 2,4
Limakalvorokotteita infiltraatio liuskatumaisten leukosyyttien (PMN /mm2 lamina propria) B 198 ± 37
1892 ± 169
4166 ± 275 * *
Arvot ovat keskiarvo ± keskivirhettä.
** p < 0,01, SS1 versus TN2GF4. Mann-Whitneyn U-testi
lineaarinen suhde (r = 0,75, p < 0,01) havaittiin välinen AT1R proteiinin ilmentymistä antrumiin ja määrä polymorfonukleaarisista valkosolujen vähäisyys antral limakalvolla 12 kuukauden kuluttua H.pylorin
infektio (kuva 4). Tämä suhde tukivat logaritminen korrelaatio antrumin ilmentymisen AT1R ja ilmaisu myeloperoksidaasin (r = 0,58, p < 0,05) (kuvio 5). Myeloperoksidaasi (MPO) on entsyymi, joka on runsaasti ilmaistu neutrofiilien ja vähemmässä määrin monosyyttien ja tietyntyyppisten makrofagien [24]. Näin ollen, tasot kudoksissa MPO toimi proteiinin markkereita neutrofiilien tunkeutuminen Tässä tutkimuksessa. Jos harha arvo merkitty kolmiolla kuviossa 5 on jätetty analyysin (ei esitetty erillisessä kuvassa) suhde AT1R ja MPO muuttuu huomattavasti vahvempi (r = 0,86 ja p < 0,01). Kuva 4 suhde AT1R ilmentymistä antrum ja määrä liuskatumaisten leukosyyttien (PMN) on antral limakalvon jälkeen 12 kuukautta helikobakteeri-infektion.
Kuva 5 suhde AT1R ilmaisun ja myeloperoksidaasi (MPO) ilmaisun antral limakalvosta 12 kuukautta helikobakteeri-infektiota. Jos harha arvo merkitty kolmiolla on jätetty analyysin (ei kuvassa) suhdetta AT1R ja MPO muuttuu huomattavasti vahvempi (r = 0,86 ja p < 0,01).
Keskustelu
Tässä tutkimuksessa selvitettiin perustason läsnäolo ja sijainti angiotensiini II reseptorien antrumin ja ruumiillisen seinän mongoliangerbiili ja osoitti, että AT1R ja AT2R ilmaisivat erilaisia ​​soluja. Toteaminen erityisen kiinnostava oli, että alapopulaatio hormonitoimintaa solujen antral limakalvon osoitti selvästi ilmaus AT1R. Pätevyyden immunohistokemiallisella menettelyä käytetään esillä olevassa tutkimuksessa on vahvistettu eri tavoin. Ang II -reseptorin vasta-aineita havaittiin käyttäen kahta eri tekniikoita, ja spesifisyys ensisijaisen vasta käytetään sekä western-blottaus ja immunohistokemia tarkistettiin vertaamalla värjäytymiskuvioissa antilooppirottamallissa kanssa ihmisen lisämunuaisen ja preabsorption kanssa estävän peptidin ( AT1R).
arjen jakaminen Ang II reseptorien vatsassa raportoitu tässä yhdenmukaiset sen kanssa, mitä on raportoitu aikaisemmin paksusuolessa [7]. Autoradiografialla rotan mahan on ilmoittanut, että AT1R, ja pieniä määriä AT2R, esiintyy kaikissa kerroksissa vatsa [4]. Kuitenkin tarkka sijainti AT1R ja AT2R mahassa on toistaiseksi vasta harvaan tutkittu. Matsuo et ai
. käytetyt immunohistokemia paikantaa AT1R ihmisen antrumissa ja todennut sen sileän lihaksen soluissa (VSMCs), mesenkyymisolujen ja sileän lihaksen solujen lihasvoima kerrokset limakalvon ja muscularis propria [25]. Edelleen, Bregonzio et ai
.

• Helikobakteeri-infektion aiheuttama mahasyöpä; etukäteen mahalaukun kantasolututkimuksen ja loput challenges
• Arviointi ja kliininen merkitys vatsan iän malli arvioimiseksi ikääntymiseen mahan-monikeskustutkimuksessa in China