Angiotensin II receptor-ekspression og relation til Helicobacter pylori-infektion i maven af ​​den mongolske gerbil

Angiotensin II receptor udtryk og relation til Helicobacter pylori
-Infektion i maven af ​​den mongolske gerbil
Abstract
Baggrund
rollen af ​​renin-angiotensinsystemet i gastrisk fysiologi og sygdom er der hidtil ikke blevet sparsomt udforsket. Det første formål med undersøgelsen var at undersøge baseline tilstedeværelse og placering af angiotensin II-receptorer (AT1R og AT2R) i maven af ​​den mongolske hoppemus. Et andet mål var at belyse, om tilstedeværelsen af ​​H. pylori
infektion er forbundet med ændringer i ekspressionen af ​​disse receptorer.
Metoder
H. pylori
ekskluderet og H. pylori
inficeret (stamme SS1 eller TN2GF4) mongolske hanhoppemus blev undersøgt. Maverne blev undersøgt på seks eller 12 måneder efter inokulering ved anvendelse af immunhistokemi, western blot og mikroskopisk morfometri.
Resultater Salg AT1R og AT2R blev placeret i en række celler i hoppemus mavevæggen, herunder en subpopulation af endokrine celler i antral slimhinde og inflammatoriske celler infiltrerer H. pylori
inficerede maver. Hoppemus inficeret med SS1 stamme viste en signifikant øget antral AT1R proteinekspression og et øget antal infiltrerende polymorfonukleære leukocytter (PMN'er) ved 12 måneder. Den AT1R proteinekspressionsplasmider korreleret med antallet af PMN'er og antrale ekspression af myeloperoxidase.
Konklusioner
angiotensin II-receptorer er til stede i en række celler i den gastriske væg mongolske hoppemus. Resultaterne indikerer en indflydelse afhængig af H. pylori
pres på mavens AT1R udtryk og et forhold mellem gastrisk AT1R ekspression og mucosalt PMN'er infiltration.
Baggrund
rolle af renin-angiotensin-systemet (RAS) i gastrisk fysiologi og sygdom er endnu blevet sparsomt udforsket. Nogle undersøgelser har rapporteret virkninger af angiotensin II (Ang II) på slimhinden blodgennemstrømning, syresekretion og glat muskelsammentrækning [1-3]. Andre har impliceret indflydelse af RAS i stress induceret gastrisk skade og iskæmi /reperfusionsskade af maveslimhinden [4, 5].
Klassiske endokrine karakter RAS er kendt for dens virkninger på hæmodynamisk regulering og homeostase kropsvæske. Mindre viden om de lovgivningsmæssige konsekvenser af væv baseret lokale RAS, der er blevet påvist i en række organer, f.eks hjernen, pancreas, spiserør og tyktarm [6-8]. Interstitiel produktion af Ang II kan forekomme efter lokal produktion af angiotensinogen (AGT), ACE og renin, eller ved alternative veje, herunder spaltning af cirkulerende AGT af andre lokalt udtrykte enzymer, såsom cathepsin D og chymase [9]. Ang II virker primært ved to receptorer, betegnet Ang II type 1 receptor (AT1R) og angiotensin II type 2 receptor (AT2R). Følgelig kortlægning ekspressionen og placering af Ang II-receptorer er af stor betydning i at udforske potentiale Ang II signalering i forskellige fysiologiske og patologiske indstillinger. I de senere år RAS er blevet vist at være involveret i forskellige patologiske tilstande, såsom inflammation, sårheling og carcinogenese [10, 11]. Epidemiologiske undersøgelser har også vist associationer mellem RAS relateret genpolymorfisme (SNPs) og udvikling af mavesår og gastrisk cancer [12, 13]. Imidlertid er ikke blevet rapporteret associationer mellem væv ekspression af Ang II-receptorer og Helicobacter pylori
infektion. Potentialet af RAS at modulere lokale inflammatoriske reaktioner gør det af interesse at undersøge dens relation til veldefineret gastritis fremkaldt af H. pylori
.
I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi ekspressionen af ​​Ang II-receptorer i inficerede og H. pylori
inficerede mongolsk gerbil. Denne dyremodel er interessant, fordi den let kan inficeres med H. pylori
, hvilket giver en kronisk aktiv inflammation med patologiske forandringer, som efterligner de fleste af læsionerne fundet i mennesker, herunder mavesår, gastrisk intestinal metaplasi og en gastrisk cancer-lignende billede [14]. Om H. pylori
infektion alene forårsager gastrisk cancer hos mongolske hoppemus forbliver under debat [15].
En første formål med undersøgelsen var at undersøge baseline tilstedeværelse og placering af AT1R og AT2R i maven af mongolsk gerbil. Et andet mål var at belyse, om tilstedeværelsen af ​​H. pylori
infektion er forbundet med ændringer i ekspressionen af ​​disse receptorer.
Metoder
Dyr
Forsøgene blev godkendt af den etiske komité af forsøg på Dyr, Göteborgs Universitet. Tredive specifikke patogenfri (SPF) mongolske hanhoppemus (Charles River, Uppsala, Sverige), syv uger gamle, blev anvendt. De blev tilfældigt opdelt i tre lige store grupper, der består af én kontrolgruppe og to grupper, der var inficeret med H. pylori
. Fem dyr blev holdt i hvert bur og værelset blev reguleret med hensyn til temperatur (18-22 ° C), fugtighed (ca. 55%) og lys /mørke-cyklus (12 /12h). De ørkenrotter havde fri adgang til mad (2016F, Harlan Tek. Lab, Blackthorn, England) og drikkevand. De fik lov en uges akklimatisering før podning.
Bakteriestammer og podning
To forskellige H. pylori
stammer blev anvendt til podning, den TN2GF4 stammen [16] og Sydney stammen en (SS1) [ ,,,0],17]. Begge stammer er kendt for at forårsage en kronisk aktiv inflammation i hoppemus gastrisk antral og korporal slimhinde. Bakterierne blev dyrket på Columbia-plader. Disse kulturer blev derefter anvendt til podning af 500 ml Brucella-bouillon indeholdende 5% nyfødt kalveserum, 10 ug /ml vancomycin og 5 ug /ml trimetoprim. Kolberne blev inkuberet i 24 timer under mikro aerobe betingelser ved 37 ° C. Bakterierne blev undersøgt ved fasekontrastmikroskopi, inden de blev indgivet til dyrene. De hoppemus blev inficeret med 0,5 ml af den bakterielle suspension eller Brucella-bouillon kun (kontroller) ved anvendelse af en fodringsnål. Kimtal blev foretaget i suspensionen at bestemme den faktiske infektiøse doser, som var 7 × 10 7 enheder og 4 × 10 7 enheder til SS1 og TN2GF4 henholdsvis.
Tidsforløb og ofrer
efter en 24-timers fasteperiode med fri adgang til drikkevand, blev fem dyr fra hver gruppe ofret seks eller 12 måneder efter podning. Dyrene blev bedøvet ved intraperitoneal injektion af medetomodin (0,5 mg /kg) og ketamin (75 mg /kg). En midtlinie laparotomi blev udført, og maverne blev derefter fjernet og åbnet langs den store krumning. Den ene halvdel blev brugt til kultur og prøver blev indsamlet fra den anden halvdel til histologiske analyser og western blot analyse. Dyrene blev aflivet ved hjertepunktur indsnit. Histopatologiske fund og bakteriologisk status er blevet rapporteret tidligere [14].
Immunhistokemi
Den fuld mur prøver (antrum og corpus) blev indsamlet umiddelbart efter åbningen af ​​maver, fastsat i Histofix (Histolab produkter AB, Göteborg, Sverige ) ved stuetemperatur (RT) natten over og derefter skyllet i PBS i 24 timer. Prøver blev efterfølgende dehydreret, indlejret i paraffin, skåret i 5-u
tykke sektioner og monteret på objektglas. Før immunohistocemical farvning blev snit afparaffineret og kogt i citronsyre-puffer (0,01 M, pH 6,0, 10 min). Den Immunocruz TM Staining System (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) blev anvendt til immunhistokemi protokollen. Efter inhibering af endogen peroxidaseaktivitet, blev ikke-specifik binding af sekundære antistoffer blokeret ved inkubation med normalt gedeserum i 30 minutter ved stuetemperatur. Følgende to polyklonale primære antistoffer, fortyndinger og inkubationstider blev derefter anvendt: kanin anti-AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech, 1: 100 i PBS, 2 timer ved stuetemperatur) og kanin-anti-AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech, 1: 100 i PBS, 2 timer ved stuetemperatur). Efter inkubation med primære antistoffer, snit blev vasket tre gange i PBS og probet med et biotinyleret sekundært antistof; komplekset blev påvist under anvendelse peberrodsperoxidase (HRP) -streptavidin og farven blev udviklet ved anvendelse af 3,3'-diaminobenzidin (DAB).
En uventet, stærk farvning af celler med en typisk udseende endokrine celler blev bemærket efter immunhistokemisk farvning med denne peroxidase metode. Immunoflourescens mærkning blev udført for yderligere at udelukke, at dette farvningen var et resultat af endogen biotin, af endogen peroxidaseaktivitet eller af uspecifik binding af det sekundære antistof. Den følgende protokol blev anvendt: efter kogning i citronsyre-buffer, blev ikke-specifik binding af sekundære antistoffer blokeret ved inkubation med normalt gedeserum (sc-2043, Santa Cruz Biotech) i 30 minutter ved stuetemperatur. Snit blev inkuberet med primære antistoffer som ovenfor. Objektglassene blev derefter vasket tre gange i PBS og probet med et sekundært antistof ifølge Alexa Flour 488 konjugeret gede anti-kanin IgG (A-11034, Molecular Probes Inc, Eugene, OR, USA), fortyndet 1: 400 i PBS i 1 time ved stuetemperatur. Objektglassene blev dernæst vasket tre gange i PBS og monteret med Fluorescensmonteringsmedium (DakoCytomation, Glostrup, Danmark), hvorefter billederne blev taget med et fluorescensmikroskop. For at bekræfte placeringen af ​​AT1R i endokrine celler, blev dobbelt immunfarvning udført ved hjælp af den ovenfor beskrevne peroxidase baseret protokol for AT1R og de ovenfor beskrevne immunoflorescens mærkning protokol for et primært antistof rettet mod Chromogranin A (C-20, Santa Cruz Biotech, 1: 100 i PBS, 2 timer ved stuetemperatur). Ikke-specifik binding af det sekundære antistof (Alexa Flour 568-konjugeret æsel-anti-gede-IgG, A-11057, Molecular Probes Inc, 1: 800 i PBS, 1 time ved stuetemperatur) blev blokeret ved inkubering med normal æsel serum (sc-2044 Santa Cruz Biotech). Preabsorpion med et overskud (5 ×) blokerende peptid (sc-1173P, Santa Cruz Biotech) blev udført som en kontrol for specificitet AT1R antistof, mens det primære antistof blev udeladt for AT2R.
Gerbil AT1R og AT2R have > 90% aminosyrehomologi sekvensidentitet med human, rotte og mus Ang II-receptorer [18, 19]. I hoppemus, som i rotter og mus, er der to AT1R undertyper (AT1aR og AT1bR), der kodes af forskellige gener, men med 95% aminosyresekvenshomologi. Disse receptorsubtyper vides at være differentielt lokaliseret og reguleret, men har en lignende affinitet for Ang II. På grund af høj aminosyresekvenshomologi mellem hoppemus AT1aR og AT1bR, antog vi lig affinitet til AT1R undertyper for AT1R antistof, der anvendes i den foreliggende undersøgelse. Endvidere er antistofferne anvendt til farvning Ang II-receptorer etableret af fabrikanten i mus, rotter og mennesker. Derfor, for at bekræfte specificiteten af ​​disse antistoffer i ørkenrotter, blev sektioner fra paraffin indlejrede blokke af normal gerbil og menneskelige binyrerne farvet som ovenfor (bortset fra at både primære antistoffer blev fortyndet 1:50 i PBS) og spredningsmønstre for Ang II receptor-antistoffer blev undersøgt. Adrenal fordeling undersøgelser viste, at anti-AT1R antistof- overvejende farvede adrenale corticale celler i zona glomerulosa (farvning af kapslen omkring kirtel, blev vaskulære glatte muskelceller (VSMC) og endotelceller også bemærket) i både hoppemus og menneskelige sektioner. De anti-AT2R antistof-farvede adrenale medulla og celler i zona glomerulosa i hoppemus og human binyre (farvning af VSMC og endotelceller blev også bemærket under anvendelse dette antistof). Disse resultater stemmer med tidligere rapporterede undersøgelser [20], og den stærke lighed mellem farvningsmønstre i hoppemus og de menneskelige binyrerne støtte en generel anvendelighed af antistofferne i gerbil væv.
Western blot-
Efter åbning af maver, fuld tykkelse antrale væg prøver blev straks opsamlet, frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -70 ° C. Prøverne blev homogeniseret på is (Polytron, PT-MR 2100, Kinematica, Schweiz) i puffer A (10% glycerol, 20 mM Tris-HCI pH 7,3, 100 mM NaCl, 2 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 2 mM EDTA, 2 nM EGTA , 10 mM natriumorthovanadat, 10 ug /ml leupeptin og 10 pg /ml aprotinin) [21] og centrifugeret ved 30.000 g i 30 minutter ved 4 ° C. Pellets blev resuspenderet i puffer B (1% NP-40 [Sigma-Aldrich, Stockholm, Sverige] i puffer A) og omrørt ved 4 ° C i 1 time før centrifugering ved 30.000 g i 30 minutter ved 4 ° C. Supernatanterne blev analyseret for proteinindhold ved metoden ifølge Bradford [21] og opbevaret ved -70 ° C indtil yderligere analyse. Prøver blev fortyndet i SDS-buffer og opvarmet ved 70 ° C i 10 minutter, inden de blev sat på en NuPage 10% BisTris gel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Én bane blev fyldt med prestained molekylvægtstandarder (SeeBlue ™, Invitrogen AB, Lidingo, Sverige), og hele cellelysater af PC-12 (for AT1R, sc-2250, Santa Cruz Biotech), HEP G2 (for AT2R; SC- 2227, Santa Cruz Biotech) og HL60 (for myeloperoxidase (MPO) blev 12-354, Upstate Lake Placid, NY, USA), der anvendes som positive kontroller. Polyvinyldifluorid membraner (Amersham, Buckinghamshire, UK) blev inkuberet med polyklonale kanin-antistoffer rettet mod AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech), AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech) eller MPO (07-496, Upstate). En alkalisk phosphatase-konjugeret gede-anti-kanin-antistof (sc-2007 Santa Cruz Biotech for AT1R og AT2R antistoffer og IgG 12-448, Upstate, for MPO antistof) og CDP-Star-substrat (Tropix, Bedford, MA, USA ) blev anvendt til at identificere immunreaktive proteiner ved Chemiluminescens. Billeder blev taget til fange af en afkølet CCD-kamera (LAS-1000, Fujifilm, Tokyo, Japan). Og semi kvantificering blev gjort ved at sammenligne prøver til positive kontroller ved hjælp af Gauge 3.3 software (Fujifilm, Tokyo, Japan)
Mikroskopisk morfometri
Vævsprøver fra antral væg fastsat i Histofix (Histolab Products AB) og indlejret i paraffin. Fire-u
tykke snit blev monteret på kodede objektglas og rutinemæssigt farvet med hæmatoxylin /eosin (H &E). Graden af ​​mucosale infiltration af mononukleære og polymorfonukleære leukocytter blev undersøgt i lysmikroskop. Lamina propria vil have tendens til at stige i volumen som følge af tilstrømningen af ​​inflammatoriske celler. Derfor blev den relative mængde af lamina propria vurderet ved morfometri at afspejle infiltration af både mononukleære og polymorfonukleære leukocytter. Dette blev udført af H.F.H. i et lysmikroskop, med en 10 x 10-kvadratnet indsat i okularet og en × 25 objektivlinse. Brug af point optælling metoden [22], blev densiteten af ​​lamina propria volumen bestemmes og udtrykkes i procent af slimhinden (i dette tilfælde defineret som området mellem slimhindeoverfladen og bunden af ​​kirtler). Slimhinde volumen defineres her som epitel lag + lamina propria. Den mucosale infiltration af polymorfonukleære leukocytter (PMN'er) blev vurderet ved P.H. i et lysmikroskop, med en 10 × 10-kvadratnet indsat i okularet, a × nedsænkning 50 olie objektiv (N.A. 1.4) og en fordybelse olie øverste linse kondensatoren (N.A. 1.4). PMN'er blev identificeret som groft runde celler i lamina propria med en mørktfarvede multilobulated eller bilobulated kerne. Antallet af PMN'er i et kvadratisk område af slimhinden blev bestemt, som var det samlede antal kvadrater over lamina propria; antallet af PMN'er udtrykkes pr 1 mm 2 lamina propria. Optællingen startede fra bunden af ​​kirtler og endte efter vurdering af en til syv fulde skår af slimhinden, hvilket resulterer i et minimum af 0,077 mm 2lamina propria analyseret i afsnit. Systematisk sampling med en tilfældig start ved udvælgelse af de områder, der skal undersøges i begge analyser. Områder med lymfoide follikler er ikke medtaget.
Statistisk analyse
Kruskal-Wallis test og Mann-Whitney U-test vurderes betydning i forskellene i proteinekspression mellem kontrol, TN2GF4-inficerede og SS1-inficerede grupper. Mann-Whitney U-test bedømmes betydning i forskelle i mucosale infiltration af inflammatoriske celler mellem TN2GF4-inficerede og SS1-inficerede hoppemus. En lineær sammenhæng mellem AT1R-protein og PMN'er, og en lineær relation mellem AT1R og ln (MPO) i antrale slimhinde, blev testet med Pearson korrelation. Alle tests blev to-tailed, og statistisk signifikans blev sat til p < 0,05. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS version 15.0 (SPSS Inc. Chicago, Illinois).
Resultater
Lokalisering af AT1R og AT2R protein
immunreaktivitet til AT1R og AT2R proteiner observeret i alle gerbil prøver studeret, og ingen farvning blev set i kontrol sektioner. Den AT1R antistof generelt inducerede en mere distinkt farvning end AT2R antistof.
Adskillige vævsrum i både corpus og antrum, uafhængigt af tilstedeværelsen eller fraværet af H. pylori
infektion, udviste immunoreaktivitet til begge Ang II receptor-undertyper (se tabel 1 for en oversigt over resultaterne og figur 1 for repræsentative sektioner. se også Supplerende fil 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 og 15 for billeder i høj opløsning). Således blev immunoreaktivitet til både AT1R og AT2R findes i endotelceller af fartøjer placeret i lamina propria, submucosa (figur 1B) og muscularis propria, såvel som i glatte muskelceller i muscularis slimhinder og muscularis propria (fig 1C og 1G) og i nogle mesenchymale celler placeret i lamina propria og submucosa. Svag farvning af begge receptorer blev også bemærket, hovedsagelig i den basale del af de fleste epitelceller. Tydelig farvning af murene neurale strukturer blev ikke observeret. Immunoreaktivitet kun AT1R blev observeret i de vaskulære glatte muskelceller for fartøjerne i submucosa, muscularis propria og serosa af både corpus og antrale dele af mavesækken (figur 1A og 1G). Interessant, en stærk immunfarvning for AT1R optrådt i en undergruppe af celler hovedsageligt i bunden af ​​antrale kirtler. Disse celler viste en typisk endokrine celle udseende, dvs. de var helt små, med cellelegemer tæt basalmembranen; en smal streng af cytoplasma blev observeret i nogle tilfælde (fig 1G, 1H og 1I). Sådan AT1R farvning kunne ikke findes i hormonlignende celler i oxyntic mucosa. Dobbelt immunfarvning for AT1R og for det pan-endokrine markør Chromogranin A [23] bekræftede placeringen af ​​AT1R i en subpopulation af endokrine celler i gerbil antrale slimhinde (Figur 1M og 1n) .table 1 Lokalisering af AT1R og AT2R protein i den gastriske væg af den mongolske gerbil
Tissue Rum

Celletype
AT1R

AT2R
mucosa
epitel
fleste epitelceller
+ hovedsageligt i basale dele
+ hovedsageligt i basale dele
Små epitelceller i bunden af ​​kirtler
+++ i nogle endokrine lignende celler i antrum
ingen
Lamina propria
karrene
+ i endotel
+ i endotel
Nerve strukturer
ingen
nej
mesenchymceller
++ i nogle celler;
++ i leukocytter i H. pylori
inficerede
+ i nogle celler;
++ i leukocytter i H. pylori
inficerede
muscularis slimhinder
Glatte muskelceller
++
+
Submucosa
karrene
+ i endotel;
++ i VSMC'er
+ i endotel;
nej i VSMC'er
Nerve strukturer
ingen
ingen
mesenchymceller
++ i nogle celler;
++ i leukocytter i H. pylori
inficerede
+ i nogle celler;
++ i leukocytter i H. pylori
inficerede
muscularis propria
glatte muskelceller
++
+
karrene
+ i endotel;
++ i VSMC'er
+ i endotel;
nej i VSMC'er
Nerve strukturer
N.O.
N.O.
serosa
kar
N.O. i endotel;
++ i VSMC'er
nej nej
: ikke observeret (eller uspecifik) immunoreaktivitet
+: svag immunoreaktivitet men med tydelig placering
++: let genkendes immunoreaktivitet
+ ++: stærk immunoreaktivitet
VSMC'er: vaskulære glatte muskelceller
Figur 1 Demonstration den immunhistokemiske placering AT1R og AT2R i maven af ​​den mongolske hoppemus. A-F viser sektioner fra antrale region af et SS1-inficeret gerbil, 12 måneder efter inokulering. A) Vaskulære glatte muskelceller (VSMC) i en arterie beliggende i serosa pletten positive for AT1R protein (grøn farve). B) Endotelceller (slut) og uidentificerede mesenkymale celler (m) placeret i submucosa viser immunoreaktivitet for AT2R proteinet. C) Glatte muskelceller i den muskulære lag af muscularis propria pletten positive for AT2R protein. D) En negativ kontrol (fortløbende til sektionen i A) præabsorberet med den blokerende peptid for AT1R antistof, der viser gul autofluorescens fra erythrocytter. E & F) Negative kontroller for AT2R antistof, på hinanden følgende til afsnittene i B & C. G, H viser sektioner fra antrale region et kontroldyr 6 måneder efter inokulering og afsnittet i (I) er fra en TN2GF4-inficerede gerbil, 12 måneder efter inokulering. Stærk immunfarvning for AT1R blev fundet i celler med en typisk udseende endokrine celler (e). Muscularis slimhinder (mm), muscularis propria (mp) og vaskulære glatte muskelceller (VSMC) farves også positiv for AT1R. En peroxidase metode (brun farve) blev anvendt til farvning af AT1R i G, H og immunofluorescens (grøn farve) blev anvendt til farvning af AT1R i (I). J, K og L) på hinanden følgende sektioner fra antrale region af et TN2GF4-inficeret gerbil, 6 måneder efter podning. J) Immunfarvning for AT1R (grøn farve) viser aggregater af leukocytter (leu), der udtrykker den AT1R protein. K) En negativ kontrol til afsnittet i J, der viser gul autofluorescens fra erythrocytter. L) Den fortløbende sektion til afsnittet i K, rutinemæssigt farvet med H &E, der bekræfter, at aggregaterne er leukocytter. M og N viser dobbelt immunfarvning for AT1R (brun farve i M) og for den pan-endokrine markør Chromogranin A (rød farve i N) af en antral sektion af et kontroldyr. Den hvide pil i M og N punkter på en celle i bunden af ​​en antral kirtel, der farves positive for både AT1R og Chromogranin A. Flere af Chromogranin A positive celler ikke var immunpositive til AT1R. Afsnit O demonstrerer neutrofiler (PMN'er) i antrale slimhinde af en SS1-inficeret gerbil, 12 måneder efter podning.
Intensitet og fordeling af immunoreaktiviteten ovenfor beskrevne ikke synes at være forskellige mellem H. pylori
-negativ og H. pylori
inficerede dyr eller mellem dyrene aflivet ved seks eller 12 måneder efter podning. Dog blev en tydelig forskel bemærket mellem H. pylori
-negative og H. pylori
inficerede dyr: i modsætning til i de inficerede ørkenrotter, afsnittene i både antrum og corpus af inficerede dyr viste en overflod af inflammatoriske celler i lamina propria med immunoreaktivitet til både AT1R og AT2R. I en af ​​de TN2GF4-inficerede dyr aflivet efter seks måneder blev aggregater af inflammatoriske celler også ses i muscularis propria (fig 1J, 1K og 1L). Ingen tydelige forskelle i farvede mønstre eller intensitet blev set mellem dyr inficeret med TN2GF4 stamme eller SS1 stammen, eller mellem dyrene aflivet ved seks eller 12 måneder efter podning.
Kvantificering af AT1R og AT2R protein og relation til inflammatoriske celler
på grund af den tilsvarende immunhistokemisk udseende af angiotensin II-receptorer i corpus og antrum (med undtagelse af AT1R udtrykkende subpopulation af endokrine celler nævnt ovenfor) ved begge seks og 12 måneder blev kvantitative vurderinger begrænset til antrale prøver ved 12 måneder efter inokulering .
Både AT1R og AT2R proteiner blev identificeret ved western blotting i alle prøver (figur 2). Efter 12 måneders infektion, den AT1R proteinekspression var signifikant højere i SS1-inficerede dyr end i kontrol på det tidspunkt (figur 3). Ingen signifikante forskelle i AT2R proteinekspression blev fundet mellem de forskellige grupper af hoppemus (ikke vist). Figur 2 Eksemplarisk billede af Western blotting. Topplade: Immunoreaktivitet mod AT1R ved 41 kDa i PC-12-cellelysat (positiv kontrol) og i antrale fuld væg prøver. Bundplade: Immunoreaktivitet mod AT2R indikerer et svagt bånd ved 44 kDa i Hep G2 (positiv kontrol) og bånd i antrale fuld væg prøver
figur 3 Boxplot viser AT1R proteinekspression 12 måneder efter inokulering i hoppemus inficeret med H. pylori. stammerne TN2GF4 og SS1 og i kontrol. Den AT1R proteinekspression var signifikant højere i SS1-inficerede dyr sammenlignet med kontrollerne (Kruskal-Wallis test og Mann-Whitney U test). Proteinniveauer er vist som optisk tæthed (OD). Medianværdier er angivet med den tværgående linie inden i kassen, det interkvartile område ved den lodrette udstrækning af boksen og det samlede spekter af whiskers.
Eftersom H. pylori Salg -inficerede dyr viste en overflod af AT1R udtrykkende inflammatoriske celler i deres gastriske mucosa og en forøget antral AT1R ekspression blev en kvantitativ analyse af de inflammatoriske celler i slimhinden gjort at vurdere, om opregulering af AT1R protein i SS1-inficerede hoppemus var relateret til mucosale infiltration af inflammatoriske celler.
graden af ​​slimhinde infiltration af både mononukleære og polymorfonukleære leukocytter (afspejlet i volumen tæthed af lamina propria) ikke variere mellem SS1-inficerede og TN2GF4-inficerede ørkenrotter. Men det mucosale infiltration af polymorfonukleære leukocytter (PMN'er) var signifikant højere i de SS1-inficerede dyr end i TN2GF4-inficerede dyr 12 måneder efter inokulering (tabel 2). De PMN i H. pylori
-inficerede slimhinde bestod næsten udelukkende af neutrofiler (figur 1O); kun få eosinofil og ingen basofile celler kunne identificeres i microscope.Table 2 Kvantitativ analyse af inflammatoriske celler i gerbil antral slimhinde efter 12 måneders Helicobacter pylori
infektion

Kontrol
TN2GF4
SS1
slimhinder infiltration af mononukleære og polymorfonukleære leukocytter (afspejlet i volumen densitet (%) af lamina propria)
26,7 ± 2,4
47,1 ± 2,2
41,3 ± 2,4
slimhinder infiltration af polymorfkernede leukocytter (PMN /mm2 lamina propria)
198 ± 37
1892 ± 169
4166 ± 275 * *
Værdierne er gennemsnit ± standardfejl af middelværdi
** p <.; 0,01, SS1 versus TN2GF4. Mann-Whitney U-test
et lineært forhold (r = 0,75, p < 0,01) blev set mellem AT1R proteinekspression i antrum og antallet af polymorfkernede leukocytter i antrale slimhinde efter 12 måneders H. pylori
infektion (figur 4). Dette forhold blev støttet af den logaritmiske sammenhæng mellem antrale ekspression af AT1R og ekspressionen af ​​myeloperoxidase (r = 0,58, p < 0,05) (figur 5). Myeloperoxidase (MPO) er et enzym, der er rigeligt udtrykt i neutrofiler og i mindre grad i monocytter og visse typer af makrofager [24]. Derfor vævsniveauer af MPO tjente som proteinmarkører af neutrofil infiltration i denne undersøgelse. Hvis outlier værdi markeret med en trekant i figur 5 er udelukket fra analysen (ikke vist i en separat figur) forholdet mellem AT1R og MPO bliver mærkbart stærkere (r = 0,86 og p < 0,01). Figur 4 Forholdet mellem AT1R udtryk i antrum og antallet af polymorphnuclear leukocytter (PMN) i antral slimhinde efter 12 måneders H. pylori-infektion.
Figur 5 Forholdet mellem AT1R udtryk og myeloperoxidase (MPO) udtryk i antrale slimhinde efter 12 måneder af H. pylori-infektion. Hvis outlier værdi markeret med en trekant er udelukket fra analysen (ikke vist) forholdet mellem AT1R og MPO bliver mærkbart stærkere (r = 0,86 og p < 0,01).
Diskussion
Den foreliggende undersøgelse udforskede baseline tilstedeværelse og placering af angiotensin II-receptorer i antral og korporal væg af den mongolske hoppemus og viste, at AT1R og AT2R blev udtrykt af en række celler. Konstateringen af ​​særlig interesse var, at en delpopulation af endokrine celler i antral slimhinde viste en markant udtryk for AT1R. Gyldigheden af ​​den immunhistokemiske procedure anvendes i den foreliggende undersøgelse blev bekræftet på forskellige måder. Ang II receptor antistoffer blev påvist under anvendelse af to forskellige teknikker, og specificiteten af ​​de primære antistoffer, der anvendes til både western blotting og immunohistokemi blev kontrolleret ved at sammenligne farvningsmønstrene for gerbil med dem af det menneskelige binyrerne og ved præabsorption med blokerende peptid ( AT1R).
allestedsnærværende fordeling af Ang II-receptorer i maven rapporteret her er i konkordans med hvad der er blevet rapporteret tidligere i tyktarmen [7]. Autoradiografi af rotte maven har også oplyst, at AT1R, og lavt antal af AT2R, er til stede i alle lag af maven [4]. Men den præcise placering af AT1R og AT2R i maven er endnu kun blevet sparsomt udforsket. Matsuo et al
. brugte immunhistokemi at lokalisere AT1R i human antrum og fandt det i vaskulære glatte muskelceller (VSMC), mesenchymale celler og glatte muskelceller i muskulære lag af slimhinden og muscularis propria [25]. Endvidere Bregonzio et al
.

• Helicobacter pylori infektion induceret gastrisk cancer; avancere i gastrisk stamcelleforskning og de resterende udfordringer
• Evaluering og kliniske betydning af maven alder model for vurdering ældning af maven-et multicenter studie i Kina