Angiotensin II expression du récepteur et de la relation à Helicobacter pylori infection dans l'estomac de la gerbille de Mongolie

Angiotensin II expression du récepteur et de la relation à Helicobacter pylori
-infection dans l'estomac de la gerbille de Mongolie
Résumé de l'arrière-plan
Le rôle du système rénine-angiotensine dans la physiologie gastrique et la maladie a encore été peu explorée. Le premier objectif de l'étude était d'étudier la présence de base et l'emplacement de l'angiotensine II récepteurs (AT1R et AT2R) dans l'estomac de la gerbille de Mongolie. Un deuxième objectif était d'élucider si la présence de H. pylori
infection est associée à des changements dans l'expression de ces récepteurs.
Méthodes
H. pylori
séronégatifs et H. pylori
infecté (souche SS1 ou TN2GF4) gerbilles de Mongolie mâles ont été étudiés. Les résultats de l'estomac ont été examinés à six ou 12 mois après l'inoculation par l'utilisation de l'immunohistochimie, western blot et morphométrie microscopique.
AT1R et AT2R étaient situés dans une variété de cellules dans la paroi gastrique gerbille, y compris une sous-population de les cellules endocrines de la muqueuse antrale et des cellules inflammatoires infiltrant H. pylori d'estomac infectés par. Les gerbilles infectés par la souche SS1 a montré une expression de la protéine AT1R antrale augmenté de manière significative et un nombre accru de infiltrant polynucléaires (PMN) à 12 mois. L'expression de la protéine AT1R corrélée avec le nombre de PMN et l'expression antrale de la myéloperoxydase. Conclusions de
Angiotensin II récepteurs sont présents dans une variété de cellules dans la paroi gastrique du gerbille de Mongolie. Les résultats indiquent une influence dépend de la pylori
souche H. sur l'expression de AT1R gastrique et une relation entre l'expression de AT1R gastrique et la muqueuse PMN infiltration.
Contexte
Le rôle du système rénine-angiotensine (SRA) en physiologie gastrique et la maladie a encore été peu exploré. Certaines études ont rapporté des actions de l'angiotensine II (Ang II) sur le débit sanguin de la muqueuse, la sécrétion d'acide et de contraction des muscles lisses [1-3]. D'autres ont mis en cause l'influence de la RAS du stress induit lésions gastriques et des lésions d'ischémie /reperfusion de la muqueuse gastrique [4, 5].
Le caractère endocrinien classique de RAS est bien connu pour ses effets sur la régulation hémodynamique et fluide corporel homéostasie. On connaît moins l'impact de la réglementation des tissus à base de RAS locale qui a été démontrée dans un certain nombre d'organes, par exemple le cerveau, le pancréas, de l'œsophage et du côlon [6-8]. production interstitielle d'Ang II peut se produire suite à la production locale de l'angiotensinogène (AGT), ACE et la rénine, ou par des voies alternatives, y compris le clivage de faire circuler l'AGT par d'autres enzymes exprimées localement telles que la cathepsine D et chymase [9]. Ang II travaille principalement à travers deux récepteurs, désigné Ang II récepteur de type 1 (AT1R) et Ang II de type 2 récepteur (AT2R). Par conséquent, la cartographie de l'expression et la localisation des récepteurs Ang II est d'une grande importance dans l'exploration de la signalisation potentielle Ang II dans différents contextes physiologiques et pathologiques. Ces dernières années, RAS a été montré être impliqué dans divers états pathologiques tels que l'inflammation, la cicatrisation des plaies et la carcinogenèse [10, 11]. Des études épidémiologiques ont également démontré des associations entre les polymorphismes du gène RAS lié (SNP) ainsi que le développement de l'ulcère gastro-duodénal et le cancer gastrique [12, 13]. Toutefois, les associations entre l'expression tissulaire des récepteurs Ang II et l'infection de Helicobacter pylori n'a été signalé. Le potentiel de RAS pour moduler les réactions inflammatoires locales rend intéressant d'étudier sa relation avec la gastrite bien définie évoquée par H. pylori
.
Dans la présente étude, nous avons examiné l'expression des récepteurs Ang II dans le non infectées et gerbille de Mongolie infecté par H. pylori. Ce modèle animal est intéressant car il peut facilement être infecté par H. pylori
, ce qui donne une inflammation chronique active avec les changements pathologiques qui imitent la plupart des lésions trouvées chez l'homme, y compris les ulcères gastriques, la métaplasie intestinale gastrique et un cancer gastrique semblable image [14]. Que H. pylori
infection seul provoque le cancer gastrique chez des gerbilles de Mongolie reste en débat [15].
Un premier but de l'étude était d'étudier la présence de base et l'emplacement du AT1R et AT2R dans l'estomac du gerbille de Mongolie. Un deuxième objectif était d'élucider si la présence de H. pylori
infection est associée à des changements dans l'expression de ces récepteurs.
Méthodes
Animaux
Les expériences ont été approuvées par le Comité d'éthique des expériences sur Animaux, Université de Göteborg. Trente libres (SPF) gerbilles spécifiques de pathogènes mâles de Mongolie (Charles River, Uppsala, Suède), sept semaines d'âge, ont été utilisés. Ils ont été séparés au hasard en trois groupes de taille égale, consistant en un groupe témoin et deux groupes qui ont été infectés par H. pylori
. Cinq animaux ont été maintenus dans chaque cage et la chambre était réglementée par rapport à la température (18-22 ° C), l'humidité (environ 55%) et cycle lumière /obscurité (12 /12h). Les gerbilles avaient libre accès à la nourriture (2016F, Harlan Tek. Lab, Blackthorn, Angleterre) et de l'eau potable. Ils ont été autorisés une semaine d'acclimatation avant l'inoculation.
Souches bactériennes et inoculation
Deux différentes H. pylori
souches ont été utilisées pour l'inoculation, la souche TN2GF4 [16] et la souche Sydney 1 (SS1) [ ,,,0],17]. Les deux souches sont connues pour provoquer une inflammation chronique active dans la muqueuse antrale et corporelle gastrique gerbille. Les bactéries ont été cultivées sur des plaques Columbia. Ces cultures ont ensuite été utilisées pour inoculer 500 ml de bouillon Brucella contenant 5% de sérum de veau nouveau-né, 10 pg /ml de vancomycine et 5 ug /ml de triméthoprime. Les fioles ont été incubées pendant 24 heures dans des conditions aérobies micro à 37 ° C. Les bactéries ont été examinées par microscopie à contraste de phase avant d'être administrés aux animaux. Les gerbilles ont été infectées avec 0,5 ml de la suspension bactérienne ou un bouillon Brucella seulement (témoins) à l'aide d'une aiguille d'alimentation. Comptages viables ont été faites dans la suspension pour déterminer les doses infectieuses réels, qui étaient 7 × 10 7 unités et 4 × 10 7 unités pour SS1 et TN2GF4, respectivement.
cours Temps et le sacrifice
après une période de jeûne de 24 heures avec un accès libre à l'eau potable, cinq animaux de chaque groupe ont été sacrifiés six ou 12 mois après l'inoculation. Les animaux ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale de medetomodin (0,5 mg /kg) et de kétamine (75 mg /kg). Une laparotomie médiane a été effectuée et les estomacs ont été ensuite retiré et ouvert le long de la grande courbure. Une moitié a été utilisée pour la culture, et des échantillons ont été prélevés dans l'autre moitié pour des analyses histologiques et l'analyse western blot. Les animaux ont été sacrifiés par une incision cardiaque. Les résultats histopathologiques et statut bactériologique ont été rapportés précédemment [14].
immunohistochimie
Les échantillons de mur complets (antre et corpus) ont été recueillis immédiatement après l'ouverture de l'estomac, fixé à Histofix (produits Histolab AB, Göteborg, Suède ) à la température ambiante (TA) pendant une nuit, puis rincées dans du PBS pendant 24 heures. Les échantillons ont ensuite été déshydratés, inclus dans la paraffine, coupés en sections épaisses de 5 p et montées sur des lames de verre. Immunohistocemical avant la coloration, les coupes ont été déparaffinées et bouillies dans un tampon d'acide citrique (0,01 M, pH 6,0, 10 minutes). Le système Immunocruz TM Coloration (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) a été utilisé pour le protocole d'immunohistochimie. Après l'inhibition de l'activité de peroxydase endogène, la liaison non spécifique des anticorps secondaires a été bloquée par incubation avec du sérum de chèvre normal pendant 30 minutes à température ambiante. Ci-dessous deux anticorps primaires polyclonaux, des dilutions et des temps d'incubation ont ensuite été utilisés: anticorps de lapin anti-AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech, 1: 100 dans du PBS, 2 h à température ambiante) et de lapin anti-AT2R (H-143 Santa Cruz Biotech, 1: 100 dans du PBS, 2 h à température ambiante). Après incubation avec les anticorps primaires, les coupes ont été lavées trois fois dans du PBS et sondées avec un anticorps secondaire biotinylé; le complexe a été détectée en utilisant la peroxydase de raifort (HRP) -streptavidin et la couleur a été développée en utilisant la 3,3'-diaminobenzidine (DAB).
Une inattendue, une forte coloration des cellules avec un aspect typique des cellules endocrines a été notée après coloration immunohistochimique avec cette méthode à base de peroxydase. Immunoflourescens marquage a été effectué pour écarter davantage la possibilité que cette coloration est le résultat de la biotine endogène de l'activité de peroxydase endogène ou de la liaison non spécifique de l'anticorps secondaire. Le protocole suivant a été utilisé: après avoir fait bouillir dans un tampon d'acide citrique, la liaison non spécifique des anticorps secondaires a été bloquée par incubation avec du sérum normal de chèvre (sc-2043, Santa Cruz Biotech) pendant 30 min à température ambiante. Les sections ont été incubées avec des anticorps primaires comme ci-dessus. Les lames ont ensuite été lavées trois fois dans du PBS et sondées avec un anticorps secondaire Alexa Flour 488 chèvre conjugué IgG anti-lapin (A-11034, Molecular Probes Inc, Eugene, OR, USA), dilué à 1: 400 dans du PBS pendant 1 heure à la température ambiante. Les lames ont ensuite été lavées trois fois dans du PBS et montées avec un milieu de montage de fluorescence (DakoCytomation, Glostrup, Danemark), après quoi les images ont été prises avec un microscope à fluorescence. Pour confirmer l'emplacement de AT1R dans les cellules endocrines, double immunocoloration a été réalisée en utilisant le décrit la peroxydase protocole ci-dessus sur la base de AT1R et le protocole d'étiquetage des immunoflorescens décrit ci-dessus pour un anticorps primaire dirigé contre chromogranine A (C-20, Santa Cruz Biotech, 1: 100 dans du PBS, 2 h à température ambiante). Non liaison de l'anticorps secondaire (Alexa Flour 568 conjugué d'âne anti-IgG de chèvre, A-11057, Molecular Probes Inc., 1: 800 dans du PBS, 1 heure à température ambiante) spécifique a été bloquée par incubation avec du sérum d'âne normale (sc-2044 , Santa Cruz Biotech). Preabsorpion avec un excès (5 x) peptide bloquant (sc-1173P, Santa Cruz Biotech) a été réalisée en tant que contrôle pour la spécificité de l'anticorps AT1R, tandis que l'anticorps primaire a été omis pour la AT2R.
Le gerbille et AT1R AT2R ont > 90% d'acides aminés d'homologie de séquence avec une identité humaine, de rat et de la souris Ang II récepteurs [18, 19]. Gerbilles, comme chez le rat et la souris, il existe deux sous-types AT1R (AT1aR et AT1bR) qui sont codées par des gènes différents, mais avec 95% de séquence d'acides aminés d'homologie. Ces sous-types de récepteurs sont connus pour être localisée et régulée de manière différentielle, mais ont une affinité similaire pour l'Ang II. Raison de la forte homologie de séquence d'acides aminés entre la gerbille et AT1aR AT1bR, nous avons supposé que l'affinité de liaison correspondant aux sous-types de AT1R pour l'anticorps AT1R utilisé dans la présente étude. En outre, les anticorps utilisés pour la coloration des récepteurs Ang II sont établies par le fabricant dans les souris, les rats et les humains. Par conséquent, afin de confirmer la spécificité de ces anticorps dans des gerbilles, des sections de paraffine normale des blocs de gerbilles et les surrénales humaines ont été colorées comme ci-dessus (sauf que les deux anticorps primaires ont été dilués à 1:50 dans du PBS) et les modèles de distribution de l'angiotensine II anticorps anti-récepteur ont été étudiés. Les études de distribution surrénale ont montré que l'anticorps anti-AT1R cellules corticosurrénales principalement colorées dans la zone glomérulée (coloration de la capsule entourant la glande, cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) et des cellules endotheliales a également été noté) dans les deux gerbilles et les sections humaines. Les anticorps anti-AT2R colorées et des cellules médullaires surrénales dans la zone glomérulée de gerbille et la glande surrénale humaine (coloration des CMLV et des cellules endothéliales a également été noté en utilisant cet anticorps). Ces résultats concordent avec les études précédemment rapportées [20], et la forte similitude des profils de coloration dans la gerbille et les glandes surrénales humaines soutiennent une utilité générale des anticorps dans les tissus gerbille.
Western blot Après avoir ouvert les estomacs, pleine épaisseur échantillons de mur de antrale ont immédiatement été collectés, congelés dans l'azote liquide et stockés à -70 ° C. Les échantillons ont été homogénéisés sur de la glace (Polytron PT-MR 2100, Kinematica, Suisse) dans du tampon A (10% de glycerol, 20 mM Tris-HCl pH 7,3, NaCl 100 mM, fluorure de phénylméthylsulfonyle 2 mM, EDTA 2 mM, 2 nM EGTA , 10 mM d'orthovanadate de sodium, 10 pg /ml de leupeptine et 10 pg /ml d'aprotinine) [21] et on centrifuge à 30 000 g pendant 30 min à 4 ° C. Les culots ont été remis en suspension dans du tampon B (1% de NP-40 [Sigma-Aldrich, Stockholm, Suède] dans le tampon A) et on a agité à 4 ° C pendant 1 h avant centrifugation à 30 000 g pendant 30 min à 4 ° C. Les surnageants ont été analysés pour déterminer la teneur en protéines par la méthode de Bradford [21] et stockés à -70 ° C jusqu'à analyse ultérieure. Les échantillons ont été dilués dans du tampon SDS et chauffé à 70 ° C pendant 10 minutes avant d'être chargé sur un NuPage 10% BisTris gel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Une voie a été chargé avec les normes précolorés poids moléculaire (SeeBlue ™, Invitrogen AB, Lidingo, Suède), et lysats de cellules entières de PC-12 (pour AT1R; sc-2250, Santa Cruz Biotech), HEP G2 (pour AT2R; sc- 2227, Santa Cruz Biotech) et HL60 (pour myéloperoxydase (MPO); 12-354, Upstate Lake Placid, NY, USA) ont été utilisés comme témoins positifs. membranes Polyvinyldifluoride (Amersham, Buckinghamshire, Royaume-Uni) ont été incubées avec des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech), AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech) ou MPO (07-496, Upstate). Un anticorps anti-lapin de la phosphatase alcaline de chèvre conjugué (sc-2007, Santa Cruz Biotech pour les anticorps AT1R et AT2R et IgG 12-448, Upstate, pour l'anticorps MPO) et le substrat CDP-Star (Tropix, Bedford, MA, USA ) ont été utilisées pour identifier les protéines immunoréactives par chimioluminescence. Les images ont été capturées par une caméra CCD refroidie (LAS-1000, Fujifilm, Tokyo, Japon). Quantification et demi a été effectuée en comparant des échantillons témoins positifs à l'aide du logiciel jauge 3,3 (Fujifilm, Tokyo, Japon)
morphométrie Microscopique
les échantillons de tissus de la paroi antrale ont été fixées dans Histofix (Histolab Products AB) et noyés dans de la paraffine. des sections épaisses de quatre um ont été montées sur des lames de verre et codées de façon routinière colorées à l'hématoxyline /éosine (H & E). Le degré d'infiltration de la muqueuse des mononucléaires et polynucléaires leucocytes a été étudié dans le microscope optique. Le chorion aura tendance à augmenter de volume en raison de l'afflux de cellules inflammatoires. Par conséquent, le volume relatif de la lamina propria a été évaluée par morphométrie pour tenir compte de l'infiltration des leucocytes mononucléaires deux et polynucléaires. Ceci a été réalisé par H.F.H. dans un microscope optique, avec une grille de 10 × 10 carrés inséré dans l'oculaire et un objectif × 25. En utilisant le procédé point de comptage [22], la densité volumique de la lamina propria a été déterminée et exprimée en pourcentage de la muqueuse (dans ce cas défini comme étant la région située entre la surface de la muqueuse et le fond des glandes). le volume muqueux est définie ici comme couche épithéliale + lamina propria. L'infiltration de la muqueuse polynucléaires (PMN) a été évaluée par P.H. dans un microscope optique, avec une grille de 10 × 10 carrés inséré dans l'oculaire, un objectif × 50 immersion d'huile (N.A. 1.4) et une lentille supérieure à immersion d'huile du condenseur (N.A. 1.4). PMN ont été identifiées comme des cellules plus ou moins rondes dans la lamina propria avec un noyau multilobulated ou bilobulated sombrement taché. Le nombre de PMN dans une région carrée de la muqueuse a été déterminée, tout comme le nombre total de places sur la lamina propria; le nombre de PMN est exprimée par 1 mm 2 lamina propria. Le dépouillement a commencé à partir du bas des glandes et a pris fin après évaluation de un à sept pans complets de la muqueuse, ce qui entraîne un minimum de 0.077 mm 2lamina propria analysé par section. L'échantillonnage systématique avec un départ aléatoire a été utilisé pour la sélection des zones à étudier dans les deux analyses. Les zones où les follicules lymphoïdes ne sont pas inclus.
Analyse statistique
Le test de Kruskal-Wallis et Mann-Whitney U-test de signification évaluée dans les différences d'expression de protéines entre le contrôle, l'TN2GF4 infectés et la SS1-infectés groupes. Le U-test de Mann-Whitney a évalué l'importance des différences dans l'infiltration de cellules inflammatoires de la muqueuse entre les gerbilles TN2GF4 infectés et SS1 infectés. Une relation linéaire entre la protéine et AT1R PMN, et une relation linéaire entre AT1R et ln (FTU) dans la muqueuse antrale, ont été testées avec corrélation de Pearson. Tous les tests ont été deux à queue, et la signification statistique a été fixé à p < 0,05. Résultats de Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel SPSS version 15.0 (SPSS Inc. Chicago, Illinois).
Localisation de AT1R et de protéines AT2R
immunoréactivité à la AT1R et les protéines AT2R a été observée dans tous les gerbille spécimens étudiés et aucune coloration a été observée dans les sections de contrôle. L'anticorps induit AT1R généralement une coloration plus distincte que l'anticorps AT2R.
Plusieurs compartiments de tissus à la fois dans le corps et de l'antre, indépendamment de la présence ou de l'absence d'une infection à H. pylori
, exposée immunoréactivité à la fois de l'angiotensine II sous-types de récepteurs (voir le tableau 1 pour une vue d'ensemble des résultats et la figure 1 pour des sections représentatives. Voir aussi complémentaires fichier 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 et 15 pour des images haute résolution). Ainsi, l'immunoréactivité à la fois au AT1R et AT2R ont été trouvés dans les cellules endothéliales des vaisseaux situés dans la lamina propria, la sous-muqueuse (figure 1B) et la musculeuse, ainsi que dans les cellules musculaires lisses de la muscularis mucosae et la musculeuse (fig 1C et 1G) et dans certaines cellules mésenchymateuses situées dans la lamina propria et la sous-muqueuse. Faible coloration des deux récepteurs a également été noté, principalement dans la partie basale de la plupart des cellules épithéliales. Distinct coloration des structures neuronales intra-muros n'a pas été observée. Immunoréactivité seulement AT1R a été observée dans les cellules musculaires lisses vasculaires des navires dans la sous-muqueuse, la musculeuse et la séreuse des deux corpus et des parties antraux de l'estomac (figure 1A et 1G). Fait intéressant, une forte coloration immunologique pour AT1R est apparu dans un sous-ensemble de cellules principalement dans la base des glandes antraux. Ces cellules ont montré un aspect des cellules endocrines typique, à savoir qu'ils étaient assez petites, avec les corps cellulaires à proximité de la membrane basale; une chaîne étroite de cytoplasme a été observée dans certains cas (figure 1G, 1H et 1I). Une telle coloration AT1R n'a pu être trouvée dans les cellules endocrines comme dans la muqueuse pariétale. Double immunomarquage pour AT1R et pour le marqueur pan-endocrinien chromogranine A [23] a confirmé la localisation de AT1R dans une sous-population de cellules endocrines de la muqueuse gerbille antrale (Figure 1M et 1N) .Table 1 Localisation de AT1R et AT2R protéines dans l'estomac paroi de la gerbille de Mongolie
compartiment de tissus

Type de cellule
AT1R

AT2R
Muqueuse
Epithelium
la plupart des cellules épithéliales
+ principalement dans les régions basales
+ principalement dans les petites cellules épithéliales de pièces de base dans la base de glandes
+++ dans certains endocrinien comme les cellules en antrum
pas
Lamina propria
Vascularisation
+ dans l'endothélium
+ dans l'endothélium
structures nerveuses
pas
pas
les cellules mésenchymateuses
++ dans certaines cellules;
++ dans les leucocytes dans H. pylori

+ infecté par certaines cellules;
++ dans les leucocytes dans H. pylori

Musculeuse infecté par les muqueuses
cellules musculaires lisses
++
+
Submucosa
Vascularisation
+ dans l'endothélium;
++ dans CMLV
+ dans l'endothélium;
pas dans les structures nerveuses de CMLV
pas
pas de cellules mésenchymateuses
++ dans certaines cellules;
++ dans les leucocytes dans H. pylori

+ dans infecté par certaines cellules;
++ dans les leucocytes dans H. pylori

infecté par musculeuse
muscle lisse des cellules
++
+
Vascularisation
+ dans l'endothélium;
++ dans CMLV
+ dans l'endothélium;
pas dans les structures nerveuses de CMLV
n.ö.
n.ö.
Séreuse
Vascularisation
n.ö. dans l'endothélium;
++ dans CMLV
pas
no: non observée (ou non spécifique) immunoréactivité
+: faible immunoréactivité mais avec un emplacement distinct
++: facilement reconnaissable immunoréactivité
+ ++: forte immunoréactivité
CMLV: cellules musculaires lisses vasculaires
Figure 1 Démontrer l'emplacement immunohistochimique de AT1R et AT2R dans l'estomac de la gerbille de Mongolie. A-F montre des sections de la région antrale d'une gerbille SS1 infectées, 12 mois après l'inoculation. A) Les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) dans une artère située dans la tache de séreuse positif pour la protéine AT1R (couleur verte). B) Des cellules endothéliales (fin) et des cellules mésenchymateuses non identifiées (m) situé dans la sous-muqueuse montrant une immunoréactivité pour la protéine AT2R. C) Les cellules musculaires lisses dans la couche musculaire de la musculeuse tache positive pour la protéine AT2R. D) Un contrôle négatif (consécutive à la section A) préabsorbé avec le peptide de blocage pour l'anticorps AT1R, montrant autofluorescence jaune d'érythrocytes. E & F) Les contrôles négatifs pour l'anticorps AT2R, consécutifs aux sections B & C, respectivement. G, H montre les sections de la région antrale d'un animal témoin 6 mois après l'inoculation et la section (I) est d'une gerbille TN2GF4 infectées, 12 mois après l'inoculation. Forte immunocoloration pour AT1R a été trouvé dans les cellules avec un aspect typique des cellules endocrines (e). Muscularis mucosae (mm), musculeuse (mp) et les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) également colorées positif pour le AT1R. Une méthode à la peroxydase base (couleur marron) a été utilisé pour la coloration des AT1R dans G, H et immunofluorescence (de couleur verte) a été utilisé pour la coloration des AT1R dans (I). J, K et L) des sections consécutives de la région antrale d'une gerbille TN2GF4 infectées, 6 mois après l'inoculation. J) immunocoloration pour AT1R (couleur verte) montre des agrégats de leucocytes (UFE) exprimant la protéine AT1R. K) Un contrôle négatif à la section J, montrant autofluorescence jaune d'érythrocytes. L) La section consécutive à la section K, régulièrement colorées avec H & E, confirmant que les agrégats sont leucocytes. M et N montre à double immunocoloration pour AT1R (couleur brun M) et pour le marqueur pan-endocrinien chromogranine A (couleur rouge N) d'une section antrale d'un animal témoin. La flèche blanche dans M et N points d'une cellule dans la base d'une glande antrale qui maculait positive pour AT1R et chromogranine A. Plusieurs des cellules positives Chromogranin A ne sont pas immunopositives à AT1R. Section O démontre neutrophiles (PMN) dans la muqueuse antrale d'une gerbille SS1 infectées, 12 mois après l'inoculation.
L'intensité et la distribution de l'immunoréactivité décrit ci-dessus ne semble pas être différente entre H. pylori
-négatif et H. pylori
animaux infectés par le ou entre les animaux sacrifiés à six ou 12 mois après l'inoculation. Cependant, une différence évidente a été notée entre pylori
animaux infectés par le séronégatifs et H. H. pylori: contrairement aux gerbilles non infectées, les sections des deux l'antre et du corps des animaux infectés ont montré une abondance de cellules inflammatoires dans la lamina propria, avec immunoréactivité à la fois au AT1R et AT2R. Dans l'un des animaux TN2GF4 infectés sacrifiés à six mois, des agrégats de cellules inflammatoires ont également été observées dans la musculeuse (figure 1J, 1K et 1L). Aucune différence notable dans les habitudes ou l'intensité de coloration n'a été observée entre les animaux infectés par la souche TN2GF4 ou la souche SS1, ou entre les animaux sacrifiés à six ou 12 mois après Quantification de l'inoculation. De AT1R et AT2R protéines et relation avec les cellules inflammatoires
en raison de l'aspect immunohistochimique similaire des récepteurs de l'angiotensine II dans le corpus et de l'antre (à l'exception de l'AT1R exprimant sous-population de cellules endocrines mentionnées ci-dessus) aux deux six et 12 mois, les évaluations quantitatives ont été limitées aux spécimens antraux à 12 mois après l'inoculation .
deux AT1R et les protéines ont été identifiées AT2R par transfert de type western dans tous les échantillons (Figure 2). Après 12 mois de l'infection, l'expression de la protéine AT1R était significativement plus élevée chez les animaux SS1 infectés que chez les témoins à ce moment (Figure 3). Aucune différence significative dans AT2R expression de la protéine n'a été observée entre les différents groupes de gerbilles (non représentés). Figure 2 image exemplaire des western blots. Panneau supérieur: immunoréactivité contre AT1R à 41 kDa dans PC-12 lysat cellulaire (contrôle positif) et dans des échantillons pleine paroi antraux. Panneau inférieur: immunoréactivité contre AT2R indiquant une faible bande à 44 kDa dans Hep G2 (contrôle positif) et des bandes dans des échantillons pleine paroi antraux
Figure 3 Boxplot montrant AT1R expression de la protéine de 12 mois après l'inoculation chez les gerbilles infectés par H. pylori. souches TN2GF4 et SS1 et dans les contrôles. L'expression de la protéine AT1R était significativement plus élevée chez les animaux infectés par SS1 par rapport aux témoins (essai de Kruskal-Wallis et test de Mann-Whitney U). Les teneurs en protéines sont présentées sous forme de densité optique (OD). Les valeurs médianes sont indiquées par la ligne transversale dans la boîte, la gamme interquartile par l'étendue verticale de la boîte et la gamme totale par les moustaches.
Étant donné que H. pylori
animaux infectés par le montraient une abondance de AT1R exprimant des cellules inflammatoires dans la muqueuse gastrique et une expression accrue de AT1R antrale, une analyse quantitative des cellules inflammatoires dans la muqueuse a été faite pour déterminer si la régulation à la hausse de la protéine AT1R chez les gerbilles SS1 infectées était liée à la muqueuse infiltration de cellules inflammatoires.
le degré d'infiltration de la muqueuse à la fois les leucocytes mononucléaires et polynucléaires (reflétée par la densité volumique de la lamina propria) ne diffère pas entre les gerbilles infectées SS1 et TN2GF4 infectées. Cependant, l'infiltration de la muqueuse polynucléaires (PMN) était significativement plus élevée chez les animaux infectés par SS1 que chez les animaux infectés par TN2GF4 12 mois après l'inoculation (tableau 2). Les PMN dans la muqueuse infectée par le H. pylori se composait presque exclusivement de neutrophiles (figure 1O); seulement quelques éosinophiles et pas de cellules basophiles ont pu être identifiées dans le microscope.Table 2 Analyse quantitative des cellules inflammatoires dans la muqueuse antrale gerbille après 12 mois de l'infection de Helicobacter pylori

contrôle
TN2GF4
SS1
muqueux infiltration de mononucléaires et polynucléaires leucocytes (reflétée par la densité volumique (%) de la lamina propria)
26,7 ± 2,4 47,1 ± 2,2

41,3 ± 2,4
muqueux infiltration des leucocytes polynucléaires (PMN /mm2 lamina propria)
198 ± 37
1892 ± 169
4166 ± 275 * *
Les valeurs sont la moyenne ± erreur type de la moyenne
** p <. 0,01, SS1 contre TN2GF4. Mann-Whitney U test
une relation linéaire (r = 0,75, p < 0,01) a été observée entre l'expression de la protéine AT1R dans l'antre et le nombre de polynucléaires dans la muqueuse antrale au bout de 12 mois de H. pylori
l'infection (Figure 4). Cette relation a été soutenue par la corrélation logarithmique entre l'expression antrale de AT1R et l'expression de la myéloperoxydase (r = 0,58, p < 0,05) (Figure 5). Myéloperoxydase (MPO) est une enzyme qui est abondamment exprimé dans les neutrophiles et, dans une moindre mesure, dans les monocytes et certains types de macrophages [24]. Par conséquent, les taux de MPO tissulaires ont servi de marqueurs protéiques d'infiltration neutrophile dans cette étude. Si la valeur aberrante marqué par un triangle sur la figure 5 est exclu de l'analyse (non représenté sur une figure à part) la relation entre la MPO AT1R et devient nettement plus forte (r = 0,86 et p < 0,01). Figure 4 Relation entre l'expression de AT1R dans l'antre et le nombre de leucocytes polymorphnuclear (PMN) dans la muqueuse antrale après 12 mois de l'infection à H. pylori.
Figure 5 Relation entre l'expression de AT1R et myéloperoxydase (MPO) expression dans la muqueuse antrale après 12 mois de H. pylori infection. Si la valeur des valeurs aberrantes marqué d'un triangle est exclu de l'analyse (non représenté) la relation entre AT1R et MPO devient nettement plus forte (r = 0,86 et p < 0,01). Rapport de
La présente étude a exploré la ligne de base présence et la localisation de l'angiotensine II récepteurs dans la paroi antrale et caporal de la gerbille de Mongolie et ont démontré que AT1R et AT2R ont été exprimées par une variété de cellules. Une constatation d'un intérêt particulier est qu'une sous-population de cellules endocrines dans la muqueuse antrale a montré une expression marquée de AT1R. La validité de la procédure immunohistochimique utilisée dans la présente étude a été confirmé dans diverses manières. Les anticorps du récepteur de l'angiotensine II ont été détectés en utilisant deux techniques différentes, et la spécificité des anticorps primaires utilisés à la fois par transfert de Western et immunohistochimie a été vérifiée en comparant les schémas de coloration de la gerbille avec ceux de la glande surrénale humaine et par pré-absorption avec blocage peptide ( AT1R).
la distribution omniprésente des récepteurs Ang II dans l'estomac rapportée ici est en concordance avec ce qui a été rapporté plus tôt dans le côlon [7]. Autoradiographie de l'estomac de rat a également indiqué que AT1R, et un faible nombre de AT2R, sont présents dans toutes les couches de l'estomac [4]. Cependant, l'emplacement précis de AT1R et AT2R dans l'estomac n'a encore été que peu explorée. Matsuo et al
. immunohistochimie utilisé pour localiser AT1R dans l'antre humaine et l'a trouvé dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), des cellules mésenchymateuses et des cellules musculaires lisses dans les couches musculaires de la muqueuse et la musculeuse [25]. En outre, Bregonzio et al
.

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