Выражение ангиотензин II рецептора и отношение к Helicobacter Pylori инфекции в желудке монгольской песчанки

экспрессия рецептора ангиотензина II и отношение к Helicobacter Pylori
-infection в желудке монгольской песчанки
Аннотация
Справочная информация
Роль ренин-ангиотензиновой системы в желудочном физиологии и болезни, как до сих пор редко исследовал. Первая цель исследования состояла в том, чтобы исследовать базовое наличие и расположение рецепторов ангиотензина II (AT1R и AT2R) в желудке монгольской песчанки. Вторая цель состояла в том, чтобы выяснить, является ли наличие хеликобактерной
инфекции связаны с изменениями в экспрессии этих рецепторов.
Методы
H. Pylori
-отрицательное и H. pylori- <бр> заражена (штамм SS1 или TN2GF4) самцов монгольских песчанок были исследованы. Желудки были рассмотрены на шесть или 12 месяцев после прививки с использованием иммуногистохимии, вестерн-блот и микроскопической морфометрии.
Результаты
AT1R и AT2R были расположены в различных клетках, в песчанки стенке желудка, в том числе субпопуляции эндокринные клетки в антральном слизистой оболочки и воспалительные клетки проникают H. Pylori
-infected желудки. Песчанок, инфицированных штаммом SS1 показал значительно увеличенную экспрессию белка антральных AT1R и повышенное количество проникающих полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ) в возрасте 12 месяцев. Выражение AT1R белковой коррелировали с числом ПЯЛ и антрального экспрессии миелопероксидазы.
Выводы
рецепторов ангиотензина II, присутствуют в различных клетках, в желудочной стенке монгольской песчанки. Полученные результаты указывают на влияние зависимого от штамма H. пилори
на экспрессию AT1R желудка и взаимосвязи между желудочной экспрессии AT1R и слизистых оболочек PMNS инфильтрации.
Справочная информация
Роль ренин-ангиотензиновой системы (РАС) в желудочном физиологии и болезни, как до сих пор слабо изучены. Некоторые исследования показали действие ангиотензина II (Ang II) на слизистую оболочку кровотока, секреции кислоты и сокращения гладких мышц [1-3]. Другие замешаны влияние РАН в вызванной стрессом желудка травмы и повреждения при ишемии /реперфузии слизистой оболочки желудка [4, 5].
Классическая эндокринные характер РАН хорошо известен его влияние на регулирование гемодинамического и жидкости организма гомеостаза. Меньше известно о регулирующего воздействия ткани на основе локального РАН, что было продемонстрировано в ряде органов, например мозг, поджелудочной железы, пищевода и толстой кишки [6-8]. Интерстициальные производство Ang II может произойти после местного производства ангиотензиногена (AGT), ACE и ренина, или с помощью альтернативных путей, включая расщепление циркулирующей AGT другими локально выраженными ферментами, такими, как катепсина D и химазы [9]. Анг II работает главным образом с помощью двух рецепторов, обозначенный анг II рецептора типа 1 (AT1R) и анг II типа 2 рецептора (AT2R). Следовательно, отображение выражение и расположение рецепторов Ang II имеет большое значение в изучении потенциальной сигнализации Ang II в различных физиологических и патологических условиях. В последние годы РАН было показано, участвует в различных патологических состояниях, таких как воспаление, заживление ран и канцерогенез [10, 11]. Эпидемиологические исследования также показали связь между связанной РАН полиморфизма генов (SNP) и развития язвенной болезни и рака желудка [12, 13]. Тем не менее, не сообщалось ассоциации между экспрессией ткани рецепторов Ang II и Helicobacter Pylori
инфекции. Потенциал РАН модулировать местные воспалительные реакции делает его интерес исследовать его отношение к четко определенной гастрита вызванной H. Pylori
.
В настоящем исследовании мы исследовали экспрессию рецепторов Ang II в неинфицированных и H. Pylori
-infected монгольской песчанки. Эта животная модель интересна тем, что она легко может быть заражен с H. Pylori
, давая хронический активный воспаление с патологическими изменениями, которые имитируют большинство повреждений, обнаруженных в организме человека, в том числе язвы желудка, желудочно-кишечной метаплазией и раком желудка, как картинка [14]. Ли H. Pylori
инфекции в одиночку вызывает рак желудка у монгольских песчанок остается предметом споров [15].
A Первая цель исследования состояла в том, чтобы исследовать базовое присутствие и расположение AT1R и AT2R в желудке монгольской песчанки. Вторая цель состояла в том, чтобы выяснить, является ли наличие хеликобактерной
инфекции связаны с изменениями в экспрессии этих рецепторов.
Методы
Животные
Эксперименты были одобрены Комитетом по этике экспериментов по Животные, университет Гетеборга. Тридцать специфических патогенов (SPF) Самцов монгольских песчанок (Charles River, Упсала, Швеция), семь-недельного возраста, были использованы. Они были случайным образом разделены на три группы одинакового размера, состоящих из одной контрольной группы и две группы, которые должны были быть инфицированы H. Pylori
. Пять животных содержали в каждую клетку, и в комнате регулировалась по температуре (18-22 ° С), влажность (около 55%) и цикличностью свет /темнота (12 /12H). Песчанок имели свободный доступ к пище (2016F, Харлан Tek. Lab, терна, Англия) и питьевой воды. Им разрешили одну неделю акклиматизации перед прививкой.
Бактериальные штаммы и прививка
Два разных H. Pylori
штаммы, используемые для прививки, штамм TN2GF4 [16] и Сидней штамм 1 (SS1) [ ,,,0],17]. Оба штамма, как известно, вызывают хроническое активное воспаление в песчанки антрального отдела желудка и телесное слизистой оболочки. Бактерии выращивали на Columbia пластинах. Эти культуры затем использовали для инокуляции 500 мл Brucella бульона, содержащего 5% сыворотки новорожденного теленка, 10 мкг /мл ванкомицина и 5 мкг /мл trimetoprim. Колбы инкубируют в течение 24 ч при микро аэробных условиях при 37 ° С. Бактерии были исследованы с помощью фазово-контрастной микроскопии, прежде чем вводили животным. Песчанок заражали 0,5 мл бактериальной суспензии или Brucella бульоном (контроль) с помощью иглы подачи. Жизнеспособные отсчеты были сделаны в суспензии для определения фактических инфекционных доз, которые были 7 × 10 7 единиц и 4 × 10 7 единиц для SS1 и TN2GF4 соответственно.
Временной ход и жертвуют
после 24-часовой период голодания с бесплатным доступом к питьевой воде, пять животных из каждой группы были умерщвлены шесть или 12 месяцев после прививки. Животных анестезировали с помощью интраперитонеальной инъекции medetomodin (0,5 мг /кг) и кетамина (75 мг /кг). Средняя линия была выполнена лапаротомия и желудки были затем удалены и открыта вдоль большой кривизны. Одна половина была использована для культуры, и образцы были собраны из другой половины для гистологических анализов и Вестерн-блот-анализа. Животных забивали путем сердечной надреза. Гистопатологические и бактериологического состояния сообщалось ранее [14].
Immunohistochemistry
Полные экземпляры стены (Антрум и корпусная) были собраны сразу после открытия желудках, зафиксированной в Histofix (продукты Histolab AB, Гетеборг, Швеция ) при комнатной температуре (RT) в течение ночи, а затем промывали в PBS в течение 24 часов. Образцы были затем обезвожены, заливали в парафин, разрезали на 5-х
толстых секций и установлены на стеклах. Перед тем как immunohistocemical окрашиванием срезы депарафинировали и кипятили в буфере лимонной кислоты (0,01 М, рН 6,0, 10 мин). Система Immunocruz ТМ Окрашивание (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, США) использовали для протокола иммуногистохимии. После ингибирования эндогенной активности пероксидазы, неспецифического связывания вторичных антител блокировали путем инкубации с нормальной козьей сывороткой в ​​течение 30 мин при комнатной температуре. Следующие два поликлональных первичных антител, разбавление и время инкубации были затем использованы: кролика с анти-AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech, 1: 100 в PBS, 2 ч при комнатной температуре) и кролика с анти-AT2R (Н-143, Санта Cruz Biotech, 1: 100 в PBS, 2 ч при комнатной температуре). После инкубации с первичными антителами, срезы промывали три раза в PBS и зондируют с биотинилированным вторичным антителом; комплекс был обнаружен с помощью пероксидазой хрена (HRP) -streptavidin и цвет был разработан с использованием 3,3'-диаминобензидина (DAB).
неожиданную, сильное окрашивание клеток с типичной внешностью эндокринных клеток было отмечено, после иммуногистохимического окрашивания с помощью этого метода, основанного пероксидазы. Immunoflourescens маркировки было сделано для дальнейшего исключает возможность того, что это окрашивание является результатом эндогенного биотина, эндогенной пероксидазной активности или неспецифическое связывание вторичного антитела. Использовали следующий протокол: после кипячения в буфере Кребса, неспецифического связывания вторичных антител блокировали путем инкубации с нормальной козьей сывороткой (SC-2043, Santa Cruz Biotech) в течение 30 мин при комнатной температуре. Срезы инкубировали с первичными антителами, как описано выше. Затем предметные стекла три раза промывали в PBS и зондируют с вторичным антителом Alexa Flour 488 конъюгированные козьи антитела против кроличьего IgG (А-11034, Molecular Probes Inc., Юджин, Орегон, США), разведенной 1: 400 в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Срезы затем промывали в три раза в PBS и смонтированный с флуоресцентной монтажной средой (DakoCytomation, Glostrup, Дания), после чего изображения были сняты с помощью флуоресцентного микроскопа. Чтобы подтвердить расположение AT1R в эндокринных клетках, двойное иммунное окрашивание проводили с использованием описанного выше протокола пероксидазы, основанный на AT1R и описанный выше протокол immunoflorescens маркировки для первичного антитела, направленного против Хромогранин A (C-20, Santa Cruz Biotech, 1: 100 в PBS, 2 ч при комнатной температуре). Неспецифическое связывание вторичного антитела (Alexa Мука 568-конъюгированные осла анти-козел IgG, А-11057, Molecular Probes Inc., 1: 800 в PBS, 1 час при комнатной температуре) блокировали путем инкубации с нормальной осле сыворотки (SC-2044 , Santa Cruz Biotech). Preabsorpion с избытком (5 ×) блокирующего пептида (SC-1173P, Santa Cruz Biotech) проводили в качестве контроля специфичности AT1R антитела, в то время как первичное антитело было опущено для AT2R.
Песчанки AT1R и AT2R есть > 90% идентична аминокислотной последовательности гомологии с человека, крысы и мыши Ang II рецепторов [18, 19]. В песчанок, как и у крыс и мышей, есть два AT1R подтипов (AT1aR и AT1bR), которые кодируются разными генами, но с 95% гомологии аминокислотной последовательности. Эти подтипы рецепторов, как известно, дифференциально локализованы и регулируется, но имеют схожую аффинность к Ang II. Из-за высокой гомологии аминокислотной последовательности между песчанки AT1aR и AT1bR, мы предположили, равное связывающее сродство к AT1R подтипов для AT1R антитела, используемого в настоящем исследовании. Кроме того, антитела, используемые для рецепторов Ang II окрашивания устанавливаются производителем в мышей, крыс и человека. Поэтому, чтобы подтвердить специфичность этих антител у песчанок, секции из залитых парафином блоков нормального песчанок и надпочечниках человека окрашивали, как описано выше (за исключением того, что оба первичных антител разводили в соотношении 1:50 в PBS), и схемы распределения для Ang II были изучены антитела к рецептору. Исследования распределения надпочечниковой показали, что анти-AT1R антител преимущественно окрашенных надпочечниковой клеток коры головного мозга в клубочковой зоны (окрашивание капсулы, окружающей железу, клеток гладких мышц сосудов (VSMCs) и эндотелиальных клеток было также отмечено) в обоих песчанки и человеческих секций. Противовоспалительные AT2R антител окрашенных клеток мозгового вещества надпочечников и клетки клубочковой зоны в песчанки и надпочечника человека (окрашивание VSMCs и эндотелиальных клеток, было также отмечено, с использованием этого антитела). Эти результаты согласуются с ранее опубликованных исследований [20], а также сильное сходство окрашивания образцов в песчанки и надпочечника человека поддерживают общую полезность антител в тканях песчанок.
Вестерн-блот
После открытия желудки, образцы антральных стенные полную толщину были немедленно собирали, замораживали в жидком азоте и хранили при -70 ° с. Образцы гомогенизируют на льду (Polytron, ПТ-MR 2100, Kinematica, Швейцария) в буфере А (10% глицерина, 20 мМ Трис-HCl, рН 7,3, 100 мМ NaCl, 2 мМ фенилметилсульфонилфторида, 2 мМ ЭДТА, 2 нМ EGTA , 10 мМ ортованадат натрия, 10 мкг /мл лейпептина и 10 мкг /мл апротинина) [21], и центрифугировали при 30000 г в течение 30 мин при температуре 4 ° С. Осадок ресуспендировали в буфере В (1% NP-40 [Sigma-Aldrich, Стокгольм, Швеция] в буфере А) и перемешивают при температуре 4 ° С в течение 1 часа перед центрифугированием при 30000 г в течение 30 мин при температуре 4 ° С. Супернатанты анализировали на содержание белка с помощью метода Брэдфорда [21] и хранили при -70 ° C до дальнейшего анализа. Образцы были разбавлены в SDS буфере и нагревают при 70 ° С в течение 10 мин перед погрузкой на NuPAGE 10% BisTris геле (Invitrogen, Carlsbad, CA, США). Одна полоса была загружена с предварительно окрашенные стандарты молекулярного веса (SeeBlue ™, Invitrogen AB, Lidingo, Швеция) и лизатов целых клеток РС-12 (для AT1R; подкожно-2250, Santa Cruz Biotech), HEP G2 (для AT2R; SC- 2227, Santa Cruz Biotech) и HL60 (для миелопероксидазы (МРО), 12-354, Upstate Лейк-Плэсид, штат Нью-Йорк, США) использовали в качестве положительного контроля. Polyvinyldifluoride мембраны (Amersham, Buckinghamshire, UK), инкубировали с поликлональными кроличьими антителами, направленными против AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech), AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech) или MPO (07-496, Upstate). Щелочной фосфатазы, конъюгированного козьего антитела против кроличьего антитела (SC-2007, Santa Cruz Biotech для AT1R и AT2R антител, и IgG-12-448, Upstate, для антитела MPO) и CDP-Star субстрат (Tropix, Бедфорд, штат Массачусетс, США ) были использованы для определения иммунореактивных белков с помощью chemiluminescense. Изображения были захвачены охлаждаемой ПЗС-камерой (LAS-1000, Fujifilm, Токио, Япония). И полузасушливых Количественное было сделано путем сравнения образцов до положительного контроля с помощью индикатора 3.3 программного обеспечения (Fujifilm, Токио, Япония)
Микроскопическое морфометрии <бр> Тканевые образцы из антрального стенки были зафиксированы в Histofix (Histolab Products AB) и заливали в парафин. Four-х
толстые секции были смонтированы на закодированных стеклах и регулярно окрашивали гематоксилином /эозином (H &Amp; E). Степень проникновения через слизистую оболочку мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов изучали в световом микроскопе. Собственной пластинке слизистой оболочки будет иметь тенденцию к увеличению в объеме в результате притока воспалительных клеток. Таким образом, относительный объем собственной пластинке слизистой оболочки оценивали с помощью морфометрии, чтобы отразить инфильтрацию мононуклеарных обоих и полиморфно-ядерных лейкоцитах. Это было осуществлено с помощью H.F.H. в световой микроскоп, с 10 × 10-квадратной сетки, вставленного в окуляр и × 25 линзы объектива. С помощью метода точечного подсчета [22], объемная плотность собственной пластинке слизистой оболочки была определена и выражена в процентах слизистой оболочки (в данном случае определяется как область между поверхностью слизистой оболочки и дно желез). Слизистые объем здесь определяется как эпителиального слоя + собственной пластинке слизистой оболочки. Слизистая инфильтрация полиморфно лейкоцитов (PMNs) оценивали по P.H. в световой микроскоп, с 10 × 10-квадратной сетки, вставленного в окуляр, × 50 иммерсионным объективом с (1.4), Н.А. и смазочным иммерсионной линзой верхней части конденсатора (1,4 Н.А.). PMNs были идентифицированы как примерно круглые клетки в собственной пластинке слизистой оболочки с темно окрашенного multilobulated или bilobulated ядра. Количество ПЯЛ в квадратной области слизистой оболочки была определена, как это было общее количество квадратов, в собственной пластинке слизистой оболочки; количество ПЯЛ выражается на 1 мм 2 собственной пластинке слизистой оболочки. Отсчет начался со дна желез и закончилась после того, как оценки одного до семи полных валках слизистой оболочки, в результате чего как минимум 0,077 мм 2lamina Propria анализировались на секцию. Систематическая выборка со случайным стартом был использован для выбора областей, которые будут изучены в обоих анализах. Районы с лимфоидных фолликулов не были включены.
Статистический анализ
Испытание Крускала-Уоллиса и Манна-Уитни U-тест оценивается значение в различиях экспрессии белка между контролем, TN2GF4-инфицированных и SS1-инфицированных группы. Манна-Уитни U-тест оценивали значение в различиях в слизистой оболочке инфильтрации воспалительных клеток между TN2GF4-инфицированных и SS1-инфицированных песчанок. Линейная зависимость между AT1R-белком и ПЯЛ, и линейная зависимость между AT1R и п (MPO) в антральном слизистой оболочки, были протестированы с корреляции Пирсона. Все тесты были двусторонними, и статистическая значимость была установлена ​​на уровне р &ЛТ; 0.05. Все статистические анализы проводились с использованием программы SPSS, версия 15.0 (SPSS Inc. Чикаго, штат Иллинойс).
Результаты
Локализация AT1R и белка AT2R
иммунореактивности к AT1R и AT2R белков наблюдалась во всех песчанок исследованных образцах, и ни окрашивания не было замечено в контрольных участках. Антитело AT1R в целом индуцировала более отчетливое окрашивание, чем AT2R антитела.
Несколько отсеков тканей как у свода и антрального, независимо от наличия или отсутствия антихеликобактерной
инфекции, выставлены иммунореактивности к обоим Ангиотензин II подтипы рецепторов (см таблицу 1 для обзора результатов и рисунке 1 для представительных секций см. также Дополнительный файл 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15 изображений с высоким разрешением). Таким образом, иммунореактивности как к AT1R и AT2R были обнаружены в эндотелиальных клетках сосудов, расположенных в собственной пластинке слизистой оболочки, Подслизистой (Фигура 1В) и мышечная, а также в клетках гладких мышц мышечной слизистыми оболочками и мышечная (рис 1С и 1С), а в некоторых мезенхимальных клетках, расположенных в собственной пластинке слизистой оболочки и подслизистой. Слабое окрашивание обоих рецепторов было также отмечено, главным образом в базисной части большинства эпителиальных клеток. Отдельное окрашивание интрамуральными нервных структур не наблюдалось. Иммунореактивности только AT1R наблюдалась в сосудистых гладкомышечных клетках сосудов в подслизистой, в мышечная и серозной как самого корпуса и антрального отделов желудка (рис 1А и 1G). Интересно отметить, что сильное иммунное для AT1R появился в субпопуляции клеток, главным образом, в базе антральных желез. Эти клетки показали типичный внешний вид эндокринную клеток, то есть они были достаточно малы, с клеточных тел, близких к базальной мембране; наблюдалась узкая нитка цитоплазмы в некоторых случаях (рис 1G, 1H и 1I). Такое AT1R окрашивание не могли быть найдены в эндокринных-подобных клеток в слизистой оболочке oxyntic. Двойной иммунное для AT1R и пан-эндокринного маркера Хромогранин A [23] подтвердили расположение AT1R в субпопуляции эндокринных клеток в слизистой оболочке антрального песчанка (рис 1М и 1n) .table 1 Локализация AT1R и AT2R белка в желудочном стена монгольской песчанки
Tissue отсеками

<й>
типа клеток

AT1R

AT2R

Слизистая
Эпителий
Большинство эпителиальные клетки
+ в основном в базальных частях
+ преимущественно в базальных деталейПредлагаем
Малый эпителиальных клеток в основании желез
+++ не в некоторых эндокринных как клетки в антральном
нет
Propria
Lamina васкулатура
+ в эндотелий
+ в эндотелий
Нервные структуры не
не
нет <бр> мезенхимальные клетки
++ в некоторых клетках;
++ в лейкоцитах в H. Pylori
-infected
+ в некоторых клетках;
++ в лейкоцитах в H. Pylori
-infected
мышечной слизистая
Гладкие мышечные клетки
++
+
Подслизистая
васкулатура
+ в эндотелий;
++ в VSMCs
+ в эндотелий;
нет в VSMCs
Нервные структуры не
нет
нет
мезенхимальные клетки
Информация ++ в некоторых клетках;
++ в лейкоцитах в H. Pylori
-infected
+ в некоторые клетки;
++ в лейкоцитах в H. Pylori
-infected

мышечная гладкомышечных клеток
++
+
васкулатура
+ в эндотелий;
++ в VSMCs
+ в эндотелий;
нет в VSMCs
Нервные структуры
Н.О.
Н.О.
серозной
васкулатура
Н.О. в эндотелий;
++ в VSMCs не
не
нет: не наблюдается (или неспецифического) иммунореактивности
+: слабая иммунореактивность, но с отчетливым адресом
++: легко распознать иммунореактивности
+ ++: сильный иммунореактивности
VSMCs: сосудистые клетки гладких мышц
Рисунок 1 Демонстрация иммуногистохимическое расположение AT1R и AT2R в желудке монгольской песчанки. A-F показывает разделы из антрального областью SS1-инфицированной песчанки, через 12 месяцев после прививки. А) клеток гладких мышц сосудов (VSMC) в артерии, расположенной в серозной пятно положительным для белка AT1R (зеленый цвет). B) эндотелиальные клетки (окончание) и неустановленные мезенхимальные клетки (м), расположенные в подслизистой показывая иммунореактивности для белка AT2R. C) Гладкие мышечные клетки в мышечный слой мышечная пятно положительным для белка AT2R. D) Отрицательный контроль (последовательный раздел в А) с предварительно пропитанный блокирующего пептида для AT1R антитела, показывая желтый аутофлюоресценция из эритроцитов. E &Amp; F) Отрицательные контроли для AT2R антитела, последовательно к секциям в B &усилителя; С, соответственно. G, H показывает разделы из антрального области контрольного животного через 6 месяцев после прививки и в разделе (I) находится из TN2GF4-инфицированных песчанки, через 12 месяцев после прививки. Сильно иммуногистохимическое AT1R был обнаружен в клетках с типичным возникновением эндокринных клеток (е). Слизистая мышечная (мм), мышечная (МП) и клеток гладких мышц сосудов (VSMC) также окрашивали позитивно для AT1R. Метод, основанный пероксидаза (коричневый цвет) использовали для окрашивания AT1R в G, H и иммунофлюоресценции (зеленый цвет) использовали для окрашивания AT1R в (I). J, K и L) Последовательные секции из антрального области в TN2GF4-инфицированных песчанки, через 6 месяцев после прививки. J) иммуногистохимическое AT1R (зеленый цвет) показывает агрегаты лейкоциты (лея), выражающая белок AT1R. K) Отрицательный контроль раздел в J, показывая желтый аутофлюоресценция из эритроцитов. L) Последовательная раздел раздел в K, обычно окрашивали H &Amp; E, подтверждение того, что агрегаты лейкоциты. M и N показывает двойное иммунное окрашивание для AT1R (коричневый цвет в M) и пан-эндокринного маркера Хромогранин A (красный цвет в N) от антрального участка контрольного животного. Белая стрелка в М и N точек в ячейке в базе антрального железы, которая окрашена позитивно для обоих AT1R и Хромогранин А. Несколько Хромогранин А положительных клеток не были иммунопозитивных к AT1R. Раздел O демонстрирует нейтрофилы (PMNs) в антральном слизистой оболочки SS1-инфицированных песчанки, через 12 месяцев после прививки.
Интенсивность и распределение иммунореактивности, описанного выше, похоже, не будет отличаться между H. пилори
-отрицательное и H. пилори
-infected животных или между животными умерщвляли через шесть или 12 месяцев после прививки. Тем не менее, одна очевидная разница была отмечена между H. Pylori
-отрицательные и H. Pylori
-infected животных: в отличие от неинфицированных песчанок, участки как антральном и своде зараженных животных показали обилие воспалительных клеток в собственной пластинке слизистой оболочки с иммунореактивности как к AT1R и AT2R. В одной из TN2GF4-инфицированных животных, умерщвленных в возрасте шести месяцев, агрегаты воспалительных клеток были также замечены в мышечная (рис 1J, 1K и 1L). Нет очевидных различий в характере окрашивания или интенсивности были замечены между животными, инфицированными штаммом TN2GF4 или штамма SS1, или между животных умерщвляли через шесть или 12 месяцев после прививки.
Количественное AT1R и AT2R белка и относительно воспалительных клеток <бр> из-за подобной иммуногистохимического появление рецепторов ангиотензина II в корпусе и антрального (за исключением AT1R, выражающей субпопуляции эндокринных клеток, упомянутых выше) в обоих шести и 12 месяцев, количественные оценки были ограничены антральных образцов в течение 12 месяцев после прививки .
Оба AT1R и AT2R белки были идентифицированы с помощью Вестерн-блоттинга во всех образцах (рис 2). Через 12 месяцев после заражения, экспрессия белка AT1R был в SS1-инфицированных животных значительно выше, чем в контрольной группе в то время (рисунок 3). Никаких существенных различий в экспрессии белка AT2R не были найдены между различными группами песчанок (не показано). Рисунок 2 Образцовый образ западных помарки. Верхняя панель: иммунореактивности против AT1R на 41 кДа в PC-12 лизата клеток (положительный контроль) и в антральных образцах полной стенки. Нижняя панель: иммунореактивности против AT2R что указывает на слабую полосу в 44 кДа в Hep G2 (положительный контроль) и полос в антральных образцах полной стенки Рисунок 3
Boxplot показывает экспрессию белка AT1R 12 месяцев после прививки у песчанок, инфицированных H.pylori. штаммы TN2GF4 и SS1 и в контрольной группе. Экспрессия белка AT1R была значительно выше в SS1-инфицированных животных по сравнению с контрольной группой (тест Крускала-Уоллиса и теста Манна-Уитни U). уровни белка представлены в виде оптической плотности (OD). Средние значения обозначены поперечной линии внутри коробки, диапазон межквартильного по вертикальной протяженности коробки и общего диапазона вискерами.
Учитывая, что H. Pylori
-infected животных показали обилие AT1R выражения воспалительных клеток в их слизистой оболочке желудка и повышенная экспрессия антральных AT1R, количественный анализ воспалительных клеток в слизистой оболочке было сделано, чтобы оценить, был ли связывал повышающая регуляция белка AT1R в SS1-инфицированных песчанок к слизистым инфильтрацию воспаленных клеток.
степень проникновения через слизистую оболочку обоих мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов (отраженной от объемной плотности собственной пластинки) не отличались между SS1-инфицированных и TN2GF4-инфицированных песчанок. Тем не менее, через слизистую оболочку инфильтрация полиморфно лейкоцитами (PMNs) был в SS1-инфицированных животных значительно выше, чем у TN2GF4 инфицированных животных через 12 месяцев после прививки (таблица 2). В PMNs в H. Pylori
-infected слизистой состояла почти исключительно из нейтрофилов (рис 1O); лишь немногие эозинофильный и никакие базофильные клетки могут быть идентифицированы в microscope.Table 2 Количественный анализ воспалительных клеток в слизистой оболочке антрального песчанок после 12 месяцев хеликобактерной
инфекции
<й>
Control

TN2GF4

SS1

Слизистые инфильтрации мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов (отражение объемной плотности (%) от собственной пластинке слизистой оболочки) <бр> 26,7 ± 2,4
47,1 ± 2,2
41,3 ± 2,4
Мукозные инфильтрация полиморфно лейкоцитов (PMNs /мм2 собственная пластинка слизистой оболочки)
198 ± 37
± 169 1892
4166 ± 275 * *
Значения представляют собой среднее ± стандартная ошибка среднего значения
** р &л.; 0,01, по сравнению с SS1 TN2GF4. Манна-Уитни U-тест
линейную зависимость (г = 0,75, р &ЛТ; 0,01) наблюдалось между экспрессией AT1R белка в антральном и числа нейтрофильных лейкоцитов в антральном отделе слизистой оболочке после 12 месяцев антихеликобактерной
инфекция (Рисунок 4). Эта связь была поддержана логарифмической корреляции между антрального выражением AT1R и экспрессии миелопероксидазы (г = 0,58, р &ЛТ; 0,05) (рисунок 5). Миелопероксидазы (МРО) представляет собой фермент, который в большом количестве экспрессируется в нейтрофилах и в меньшей степени в моноцитов и некоторых типов макрофагов [24]. Следовательно, уровни ткани МРО служил в качестве белковых маркеров инфильтрацией нейтрофилов в данном исследовании. Если аномальное значение помечен треугольником на рисунке 5 исключен из анализа (не показано на отдельном рисунке) отношения между AT1R и MPO становится заметно сильнее (г = 0,86 и р &лт; 0,01). Рисунок 4 Взаимосвязь между экспрессией AT1R в антральном и количество polymorphnuclear лейкоцитов (ПЯЛ) в антральном слизистой оболочке после 12 месяцев хеликобактерной инфекции.
Рисунок 5 Взаимосвязь между выражением AT1R и выражения миелопероксидазы (МРО) в антральном слизистой оболочке после 12 месяцев хеликобактерной инфекции. Если аномальное значение помечен треугольником исключен из анализа (не показан) отношения между AT1R и MPO становится заметно сильнее (г = 0,86 и р &Лт; 0,01).
Обсуждение
Настоящее исследование исследовал базовую линию наличие и расположение рецепторов ангиотензина II в антральном и телесное стенки монгольской песчанки и показал, что AT1R и AT2R были выражены различными клетками. Нахождение особый интерес в том, что субпопуляции эндокринных клеток в антральном слизистой оболочки показали заметное выражение AT1R. Обоснованность иммуногистохимического процедуры, используемой в настоящем исследовании, была подтверждена различными способами. Антитела рецептора Ang II были обнаружены с использованием двух различных методик, а специфичность первичных антител, используемых как для вестерн-блоттинга и иммуногистохимии проверялась путем сравнения Окрашивание образцы песчанки с теми надпочечника человека и путем предварительной абсорбции с блокированием пептид ( AT1R).
повсеместное распространение рецепторов Ang II в желудке сообщили здесь в согласовании с тем, что сообщалось ранее в толстой кишке [7]. Авторадиография желудка крысы также показали, что AT1R, и низкие числа AT2R, присутствуют во всех слоях [4] желудка. Тем не менее, точное местоположение AT1R и AT2R в желудке пока лишь слабо изучены. Мацуо и др
. используемым иммуногистохимии, чтобы определить местонахождение AT1R в человеческом антральном и обнаружили, что в клетках гладких мышц сосудов (VSMCs), мезенхимальных клеток и клеток гладких мышц в мышечной слоев слизистой оболочки и мышечная [25]. Кроме того, Bregonzio и др
.

• хеликобактерной инфекции индуцированных рак желудка; Продвижение в желудочном исследования стволовых клето…
• Оценка и клиническое значение возрастной модели желудка для оценки старения в желудке многоцентровое исслед…