la expresión del receptor de la angiotensina II y la relación con la infección por Helicobacter pylori en el estómago de la expresión del receptor de la angiotensina II gerbil

de Mongolia y la relación con Helicobacter pylori
: infección en el estómago del jerbo de Mongolia
Resumen Antecedentes
el papel del sistema renina-angiotensina en la fisiología y la patología gástrica ha sido aún escasamente explorado. El primer objetivo del estudio fue investigar la presencia de línea de base y la ubicación de los receptores de la angiotensina II (AT1R y AT2R) en el estómago del jerbo de Mongolia. Un segundo objetivo fue determinar si la presencia de H. pylori
se asocia con cambios en la expresión de estos receptores.
Métodos
H. pylori
-negativo y H. pylori
infectadas (cepa SS1 o TN2GF4) se investigaron los jerbos mongoles machos. Los estómagos fueron examinados en seis o 12 meses después de la inoculación mediante el uso de inmunohistoquímica, transferencia de Western y morfometría microscópico.
Resultados
AT1R y AT2R se encuentran en una variedad de células en la pared gástrica gerbil, incluyendo una subpoblación de células endocrinas de la mucosa antral y células inflamatorias que infiltran H. pylori
estómagos infectados. Los jerbos infectados con la cepa SS1 mostraron una expresión de la proteína AT1R antral aumentado significativamente y un mayor número de infiltrarse en los leucocitos polimorfonucleares (PMNs) a los 12 meses. La expresión de proteínas AT1R correlacionado con el número de PMNs y la expresión antral de mieloperoxidasa.
Conclusiones
receptores de angiotensina II están presentes en una variedad de células de la pared gástrica del jerbo de Mongolia. Los resultados indican una influencia depende de la cepa pylori H.
en la expresión AT1R gástrico y una relación entre la expresión AT1R gástrica y la infiltración de la mucosa PMN.
Antecedentes Francia El papel del sistema renina-angiotensina (RAS) en la fisiología y la patología gástrica ha sido todavía escasamente explorado. Algunos estudios han informado de acciones de la angiotensina II (Ang II) en la mucosa del flujo sanguíneo, la secreción de ácido y la contracción del músculo liso [1-3]. Otros han implicado a la influencia de la SRA en las lesiones gástricas inducidas por el estrés y el daño por isquemia /reperfusión de la mucosa gástrica [4, 5]. Comentario El carácter endocrino clásico de la RAS es bien conocida por sus efectos en la regulación hemodinámica y la homeostasis de fluidos corporales. Se sabe menos sobre el impacto de la regulación de tejido a base de RAS local que se ha demostrado en una serie de órganos, por ejemplo, el cerebro, páncreas, esófago y colon [6-8]. producción intersticial de Ang II puede ocurrir después de la producción local de angiotensinógeno (AGT), ACE y renina, o a través de vías alternativas, incluida la escisión circulantes de AGT por otras enzimas expresadas localmente tales como la catepsina D y quimasa [9]. Ang II funciona principalmente a través de dos receptores, designado Ang II receptor de tipo 1 (AT1R) y Ang II receptor tipo 2 (AT2R). En consecuencia, el mapeo de la expresión y localización de receptores de Ang II es de gran importancia en la exploración de potencial de señalización Ang II en diferentes contextos fisiológicos y patológicos. En los últimos años RAS ha demostrado estar involucrados en diversas condiciones patológicas tales como la inflamación, la cicatrización de heridas y la carcinogénesis [10, 11]. Los estudios epidemiológicos también han demostrado asociaciones entre polimorfismo relacionado con RAS gen (SNPs) y el desarrollo de la úlcera péptica y cáncer gástrico [12, 13]. Sin embargo, no se han informado de la asociación entre la expresión de tejido de los receptores de Ang II y Helicobacter pylori
infección. El potencial de la RAS para modular las reacciones inflamatorias locales hace que sea de interés para investigar su relación con la gastritis bien definido evocada por H. pylori
.
En el presente estudio, hemos examinado la expresión de los receptores de Ang II en el no infectada y H. pylori
jerbo de Mongolia infectado con. Este modelo animal es interesante porque puede ser fácilmente infectado con H. pylori
, dando una inflamación crónica activa con los cambios patológicos que imitan la mayoría de las lesiones encontradas en seres humanos, incluyendo úlceras gástricas, metaplasia intestinal gástrica y una gástrico similar al cáncer foto [14]. El papel de H. pylori
la infección por sí sola causa cáncer gástrico en jerbos de Mongolia sigue siendo objeto de debate [15].
Un primer objetivo del estudio fue investigar la presencia de línea de base y la ubicación del AT1R y la AT2R en el estómago de la jerbo de Mongolia. Un segundo objetivo fue determinar si la presencia de H. pylori
se asocia con cambios en la expresión de estos receptores.
Métodos Animales

Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentos en animales de la Universidad de Gotemburgo. Treinta libres de patógenos (SPF) jerbos mongoles machos específicos (Charles River, Uppsala, Suecia), siete semanas de edad, fueron utilizados. Ellos fueron separados al azar en tres grupos de igual tamaño, que consiste en un grupo control y dos grupos que iban a ser infectados con H. pylori
. Cinco animales fueron mantenidos en cada jaula y la habitación estaba regulada con respecto a la temperatura (18-22 ° C), humedad (aproximadamente 55%) y ciclo de luz /oscuridad (12 /12h). Los jerbos tenían libre acceso a los alimentos (2016F, Harlan Tek. Lab, Blackthorn, Inglaterra) y agua potable. Se les permitió de una semana de aclimatación antes de la inoculación.
Cepas bacterianas y la inoculación sobre Two H. pylori
diferentes cepas se utilizaron para la inoculación, la cepa TN2GF4 [16] y la cepa Sydney 1 (SS1) [ ,,,0],17]. Ambas cepas son conocidos por causar una inflamación crónica activa en la mucosa antral y corporal gástrico jerbo. Las bacterias se cultivaron en placas de Columbia. Estos cultivos se utilizaron a continuación para inocular 500 ml de caldo de Brucella que contiene 5% de suero de ternero recién nacido, 10 mg /ml de vancomicina y 5 mg /ml trimetoprim. Los matraces se incubaron durante 24 horas en condiciones aeróbicas micro a 37 ° C. Las bacterias fueron examinadas por microscopía de contraste de fase antes de ser administrados a los animales. Los jerbos se infectaron con 0,5 ml de la suspensión bacteriana o caldo Brucella solamente (controles) usando una aguja de alimentación. Viable cuenta se hicieron en la suspensión para determinar las dosis infecciosas reales, que eran 7 × 10 7 unidades y 4 × 10 7 unidades para SS1 y TN2GF4, respectivamente.
Evolución temporal y sacrificar
tras un periodo de ayuno de 24 horas con acceso libre al agua potable, cinco animales de cada grupo se sacrificaron seis o 12 meses después de la inoculación. Los animales fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de medetomodin (0,5 mg /kg) y ketamina (75 mg /kg). Una laparotomía media se realizó y los estómagos se retiraron a continuación y se abrió a lo largo de la curvatura mayor. Una mitad se utiliza para la cultura, y las muestras se obtuvieron de la otra mitad para los análisis histológicos y análisis de Western blot. Los animales se sacrificaron por incisión cardiaca. Los hallazgos histopatológicos y el estado bacteriológico se ha informado anteriormente [14]. La inmunohistoquímica

Los especímenes completos de pared (antro y Corpus) se recogieron inmediatamente después de la apertura de los estómagos, se fijaron en Histofix (productos Histolab AB, Gothenburg, Suecia ) a temperatura ambiente (RT) durante la noche y luego se enjuagaron en PBS durante 24 horas. Las muestras fueron posteriormente deshidratado, embebido en parafina, corte en 5-mu
secciones gruesas y se montaron en portaobjetos de vidrio. Antes de la tinción immunohistocemical, las secciones se desparafinaron y se hirvieron en tampón de ácido cítrico (0,01 M, pH 6,0, 10 min). El Sistema de tinción Immunocruz TM (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) se utilizó para el protocolo de inmunohistoquímica. Después de la inhibición de la actividad de la peroxidasa endógena, no la unión de anticuerpos secundarios específica fue bloqueada por incubación con suero normal de cabra durante 30 min a TA. Los dos siguientes anticuerpos primarios policlonales, se utilizaron a continuación, diluciones y tiempos de incubación: de conejo anti-AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech, 1: 100 en PBS, 2 horas a RT) y de conejo anti-AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech, 1: 100 en PBS, 2 horas a RT). Después de la incubación con anticuerpos primarios, las secciones se lavaron tres veces en PBS y se sondearon con un anticuerpo secundario biotinilado; el complejo se detectó utilizando peroxidasa de rábano picante -estreptavidina (HRP) y el color se desarrolló utilizando 3,3'-diaminobencidina (DAB).
Una fuerte tinción inesperado, de células con un aspecto típico de las células endocrinas se observó después de la tinción inmunohistoquímica con este método basado en peroxidasa. Immunoflourescens de marcaje se realiza para descartar aún más la posibilidad de que esta tinción fue el resultado de biotina endógena, de la actividad de peroxidasa endógena o de la unión inespecífica del anticuerpo secundario. Se usó el siguiente protocolo: después de la ebullición en tampón de ácido cítrico, de no unión de anticuerpos secundarios específica fue bloqueada por incubación con suero normal de cabra (sc-2043, Santa Cruz Biotech) durante 30 min a RT. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios como anteriormente. Los portaobjetos se lavaron tres veces en PBS y se sondearon con un anticuerpo secundario de Alexa Harina 488 conjugado de cabra anti-IgG de conejo (A-11034, Molecular Probes Inc, Eugene, Oregón, EE.UU.), diluido 1: 400 en PBS durante 1 hora a TA. Los portaobjetos se lavaron siguiente tres veces en PBS y se montaron con medio de montaje de la fluorescencia (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca), después de lo cual las imágenes fueron capturadas con un microscopio de fluorescencia. Para confirmar la localización de AT1R en células endocrinas, doble inmunotinción se realizó usando el descrito protocolo anterior peroxidasa base para AT1R y el protocolo de etiquetado immunoflorescens descrito anteriormente para un anticuerpo primario dirigido contra cromogranina A (C-20, Santa Cruz Biotech, 1: 100 en PBS, 2 horas a RT). No unión del anticuerpo secundario (Alexa Flour 568 conjugado con burro IgG anti-cabra, A-11057, Molecular Probes Inc, 1: 800 en PBS, 1 h a RT) específica fue bloqueada por incubación con suero normal de burro (sc-2044 , Santa Cruz Biotech). Preabsorpion con un exceso (5 ×) bloquea péptido (sc-1173P, Santa Cruz Biotech) se realizó como un control para la especificidad del anticuerpo AT1R, mientras que el anticuerpo primario se omitió para la AT2R.
El jerbo AT1R y AT2R que > 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con una homología humano, rata y ratón receptores de Ang II [18, 19]. En jerbos, como en ratas y ratones, hay dos subtipos AT1R (AT1aR y AT1bR) que están codificadas por genes diferentes pero con 95% de ácido amino homología de secuencia. Se sabe que estos subtipos de receptores a ser diferencialmente localizada y regulada, pero tienen una afinidad similar por Ang II. Debido a la alta homología de secuencia de aminoácidos entre el jerbo AT1aR y AT1bR, se asumió igual afinidad de unión a los subtipos AT1R para el anticuerpo AT1R utilizado en el presente estudio. Por otra parte, los anticuerpos utilizados para la tinción de los receptores de Ang II son establecidos por el fabricante en ratones, ratas y seres humanos. Por lo tanto, para confirmar la especificidad de estos anticuerpos en jerbos, las secciones de los bloques incluidos en parafina de jerbo normal y glándulas adrenales humanos se tiñeron como anteriormente (excepto que ambos anticuerpos primarios fueron diluidos 1:50 en PBS) y los patrones de distribución para la Ang II se estudiaron los anticuerpos del receptor. Los estudios de distribución suprarrenales mostraron que el anticuerpo anti-AT1R predominantemente manchadas células corticales adrenales en la zona glomerular (tinción de la cápsula que rodea la glándula, también se observó células de músculo liso vascular (CMLV) y células endoteliales) tanto en jerbo y secciones humanos. Los anticuerpos anti-AT2R células teñidas médula adrenal y células en la zona glomerular en el jerbo y la glándula suprarrenal humana (tinción de CMLV y las células endoteliales se observó también usando este anticuerpo). Estos resultados concuerdan con estudios se informó anteriormente [20], y la gran similitud de los patrones de coloración en el jerbo y la glándula suprarrenal humanos apoyan la utilidad general de los anticuerpos en los tejidos jerbo.
Blot
Western Después de abrir los estómagos, especímenes de pared antral espesor total se recogieron inmediatamente, congelados en nitrógeno líquido y se almacenan a -70 ° C. Las muestras se homogeneizaron en hielo (Polytron, PT-MR 2100, Kinematica, Suiza) en tampón A (10% de glicerol, 20 mM Tris-HCl pH 7,3, NaCl 100 mM, 2 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo, EDTA 2 mM, 2 nM EGTA , ortovanadato de sodio 10 mM, 10 mg /ml de leupeptina y 10 mg /ml de aprotinina) [21] y se centrifugó a 30.000 g durante 30 min a 4 ° C. Los pellets se resuspendieron en tampón B (1% NP-40 [Sigma-Aldrich, Estocolmo, Suecia] en tampón A) y se agitó a 4 ° C durante 1 hora antes de la centrifugación a 30.000 g durante 30 min a 4 ° C. Los sobrenadantes se analizaron para el contenido de proteína por el método de Bradford [21] y se almacenaron a -70 ° C hasta su posterior análisis. Las muestras se diluyeron en tampón de SDS y se calentó a 70 ° C durante 10 min antes de ser cargado en un NuPage 10% BisTris gel (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Un carril se cargó con los estándares de peso molecular preteñidos (SeeBlue ™, Invitrogen AB, Lidingö, Suecia), y lisados ​​de células enteras de PC-12 (para AT1R; sc-2250, Santa Cruz Biotech), Hep G2 (por AT2R; SC- 2227, Santa Cruz Biotech) y HL60 (por mieloperoxidasa (MPO); 12-354, Upstate Lake Placid, NY, EE.UU.) se utilizaron como controles positivos. membranas polivinildifluoruro (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido) se incubaron con anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech), AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech) o MPO (07-496, Upstate). Un anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (sc-2007, Santa Cruz Biotech para los anticuerpos AT1R y AT2R, y IgG 12-448, Upstate, para el anticuerpo MPO) y el sustrato CDP-Star (Tropix, Bedford, MA, EE.UU. ) se utilizaron para identificar las proteínas inmunorreactivas por quimioluminiscencia. Las imágenes fueron capturadas por una cámara CCD enfriado (LAS-1000; Fujifilm, Tokio, Japón). Y semi cuantificación se realizó mediante la comparación de muestras de controles positivos usando el software Calibre 3.3 (Fujifilm, Tokio, Japón)
microscópica morfometría
las muestras de tejido de la pared del antro se fijaron en Histofix (Histolab Products AB) e incluidos en parafina. Cuatro mu
espesor secciones se montaron en portaobjetos de vidrio y codificadas de manera rutinaria teñidas con hematoxilina /eosina (H & E). El grado de infiltración de la mucosa de mononucleares y polimorfonucleares leucocitos se estudió en el microscopio óptico. La lámina propia tenderá a aumentar en volumen como resultado de la afluencia de células inflamatorias. Por lo tanto, el volumen relativo de la lámina propia se evaluó mediante morfometría para reflejar la infiltración de leucocitos mononucleares y ambos polimorfonucleares. Esto se llevó a cabo por H.F.H. en un microscopio de luz, con una cuadrícula de 10 x 10 metros cuadrados insertado en el ocular y una lente objetivo × 25. Utilizando el método de recuento de puntos [22], se determinó la densidad de volumen de la lámina propia y se expresa en por ciento de la mucosa (en este caso definida como la región entre la superficie de la mucosa y la parte inferior de las glándulas). volumen de la mucosa se define aquí como capa epitelial + lámina propia. La infiltración mucosal de leucocitos polimorfonucleares (PMNs) se evaluó por P.H. en un microscopio de luz, con una cuadrícula de 10 x 10 metros cuadrados insertado en el ocular, una lente objetivo de inmersión 50 × aceite (N. A. 1.4) y una lente de inmersión en aceite superior del condensador (N. A. 1.4). PMN se identificaron como células más o menos redondas en lámina propia con un núcleo multilobulada o bilobulated en color oscuro. Se determinó el número de PMNs en una región cuadrada de la mucosa, así como el número total de cuadrados más de la lámina propia; el número de PMN se expresa por cada 1 mm 2 de la lámina propia. El recuento comenzó a partir de la parte inferior de las glándulas y terminó después de la evaluación de uno a siete franjas completos de la mucosa, lo que resulta en un mínimo de 0.077 mm 2lamina propria analizaron por sección. Se utilizó un muestreo sistemático con arranque aleatorio para la selección de las áreas a ser estudiadas en ambos análisis. Las áreas con folículos linfoides no fueron incluidos.
El análisis estadístico Francia El test de Kruskal-Wallis y el significado evaluado de Mann-Whitney U-test en las diferencias de expresión de proteínas entre el control, el infectadas e infectadas-TN2GF4-SS1 la grupos. La prueba U de Mann-Whitney evaluó la significación de las diferencias en la infiltración de la mucosa de células inflamatorias entre los jerbos infectados con SS1 y TN2GF4 infectadas. Una relación lineal entre AT1R-proteína y PMNs, y una relación lineal entre AT1R y ln (MPO) en la mucosa antral, se pusieron a prueba con correlación de Pearson. Todas las pruebas fueron de dos colas, y la significación estadística se estableció en p < 0.05. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS, versión 15.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois).
Resultados
La localización de la proteína y AT1R AT2R
inmunorreactividad a la AT1R y las proteínas AT2R se observó en todos jerbo especímenes estudiados, y no se observó tinción en las secciones de control. El anticuerpo AT1R generalmente indujo una tinción más clara que el anticuerpo AT2R.
Varios compartimentos de tejido tanto en el corpus y el antro, independiente de la presencia o ausencia de infección por H. pylori
, exhibido inmunoreactividad a ambos de la Ang II subtipos de receptores (véase la Tabla 1 para un resumen de los resultados y la Figura 1 para las secciones representativas. Véase también el archivo adicional 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15 para imágenes de alta resolución). Por lo tanto, la inmunorreactividad tanto a la AT1R y la AT2R se encuentra en las células endoteliales de los vasos situados en la lámina propia, la submucosa (Figura 1B) y la muscularis propria, así como en las células musculares lisas de la muscularis mucosae y muscularis propia (Figura 1C y 1G) y en algunas células mesenquimales ubicadas en la lámina propia y submucosa. También se observó tinción débil de ambos receptores, principalmente en la parte basal de la mayoría de las células epiteliales. No se observó tinción distinta de las estructuras neurales intramuros. Inmunoreactividad sólo para AT1R se observó en las células del músculo liso vascular de los vasos de la submucosa, la muscular propia y la serosa tanto del corpus y partes del antro del estómago (Figura 1A y 1G). Curiosamente, una fuerte inmunotinción para AT1R apareció en un subconjunto de células principalmente en la base de las glándulas antrales. Estas células mostraron una apariencia celular típico endocrino, es decir, que eran bastante pequeñas, con los cuerpos de las células cerca de la membrana basal; se observó una cadena estrecha de citoplasma en algunos casos (Figura 1G, 1H y 1I). Tal tinción AT1R no se pudo encontrar en las células endocrinas-como en la mucosa oxíntica. inmunotinción doble para AT1R y para el marcador pan-endocrino cromogranina A [23], se confirmó la ubicación de AT1R en una subpoblación de células endocrinas de la mucosa antral jerbo (Figura 1M y 1N) .Tabla 1 localización de la proteína AT1R y AT2R en el gástrico pared del jerbo de Mongolia
compartimento tisular

tipo de célula
AT1R

AT2R
mucosa del epitelio

mayoría de las células epiteliales
+ principalmente en las partes basales
+ principalmente en las partes basales
pequeñas células epiteliales en la base de las glándulas
+++ de alguna endocrina como las células en el antro
sin
lámina propia
Vasculatura
+ en el endotelio
+ en el endotelio
estructuras nerviosas
sin ningún

Las células mesenquimales
++ en algunas células;
++ en leucocitos en H. pylori
infectado con
+ en algunas células;
++ en leucocitos en H. pylori
infectado con
muscular de la mucosa
Las células musculares lisas
++ +

submucosa
Vasculatura
+ en el endotelio;
++ en CMLV
+ en el endotelio;
sin en CMLV
estructuras nerviosas
sin
no hay células mesenquimales
++ en algunas células;
++ en leucocitos en H. pylori
infectado con
+ en algunas células;
++ en leucocitos en H. pylori
infectado con
muscular propia
células del músculo liso
++ +

Vasculatura
+ en el endotelio;
++ en CMLV
+ en el endotelio;
sin en CMLV
estructuras nerviosas
N.Ö.
N.Ö.
serosa
Vasculatura
N.Ö. en el endotelio;
++ en CMLV
sin
no: no observada (o no específica) inmunoreactividad
+: débil inmunorreactividad pero con distinta ubicación
++: fácil de reconocer inmunorreactividad
+ ++: fuerte inmunoreactividad
CMLV: células de músculo liso vascular
Figura 1 Demostración de la localización inmunohistoquímica de AT1R y AT2R en el estómago del jerbo de Mongolia. A-F muestra secciones de la región antral de un jerbo infectada con SS1, 12 meses después de la inoculación. A) vasculares células de músculo liso (VSMC) en una arteria situada en la mancha serosa positiva para la proteína AT1R (color verde). B) Las células endoteliales (finales) y células mesenquimales no identificados (m), situado en la submucosa que muestra inmunoreactividad para la proteína AT2R. C) Las células musculares lisas en la capa muscular de la mancha muscular propia positiva para la proteína AT2R. D) Un control negativo (consecutiva a la sección en A) preabsorbió con el péptido de bloqueo para el anticuerpo AT1R, que muestra autofluorescencia amarillo a partir de los eritrocitos. E & F) Los controles negativos para el anticuerpo AT2R, consecutivos a las secciones de B & C, respectivamente. G, H muestra secciones de la región antral de un animal de control 6 meses después de la inoculación y la sección en (I) es de un gerbil TN2GF4 infectados, 12 meses después de la inoculación. inmunotinción fuerte para AT1R se encuentra en las células con una apariencia típica de las células endocrinas (e). Muscular de la mucosa (mm), la muscular propia (MP) y las células del músculo liso vascular (CMLV) también se tiñeron positivo para el AT1R. Un método basado peroxidasa (color marrón) se utilizó para la tinción de AT1R en G, H e inmunofluorescencia (color verde) se utilizó para la tinción de AT1R en (I). J, K y L) secciones consecutivos de la región antral de un gerbil infectada por TN2GF4, 6 meses después de la inoculación. J) La inmunotinción para AT1R (color verde) muestra agregados de leucocitos (leu) que expresan la proteína AT1R. K) Un control negativo a la sección en J, que muestra autofluorescencia amarilla de los eritrocitos. L) La sección consecutiva a la sección K, de forma rutinaria teñidas con H & E, lo que confirma que los agregados son leucocitos. M y N muestran inmunotinción doble para AT1R (color marrón en M) y para el marcador pan-endocrino cromogranina A (color rojo en N) de una sección de antral de un animal de control. La flecha blanca en M y N puntos en una célula en la base de una glándula antral que tiñó positiva tanto para AT1R y cromogranina A. Varios de las células cromogranina A positivos no se immunopositive a AT1R. Sección O demuestra neutrófilos (PMN) en la mucosa del antro de un jerbo infectada con SS1, 12 meses después de la inoculación. México La intensidad y la distribución de la inmunorreactividad descrito anteriormente no parecen ser diferentes entre H. pylori
-negativo y H. pylori
animales infectados o entre los animales sacrificados a los seis o 12 meses después de la inoculación. Sin embargo, se observó una diferencia obvia entre H. pylori
pylori
animales infectados-negativos y H.: al contrario que en los jerbos no infectados, las secciones tanto del antro y cuerpo de animales infectados mostraron una abundancia de células inflamatorias en la lámina propia con inmunorreactividad tanto a la AT1R y la AT2R. En uno de los animales infectados por TN2GF4 sacrificados a los seis meses, los agregados de células inflamatorias también se observaron en la muscularis propia (Figura 1J, 1K y 1L). No hay diferencias obvias en los patrones de tinción o la intensidad se observaron entre los animales infectados con la cepa TN2GF4 o la cepa SS1, o entre los animales sacrificados a los seis o 12 meses después de la inoculación.
La cuantificación de proteínas AT1R y AT2R y su relación con las células inflamatorias
Debido a la aparición inmunohistoquímico similar de receptores de la angiotensina II en el corpus y el antro (con la excepción de la AT1R expresar subpoblación de células endocrinas mencionados anteriormente) en ambos seis y 12 meses, las evaluaciones cuantitativas se limitan a muestras antrales a los 12 meses después de la inoculación .
Tanto AT1R y proteínas AT2R fueron identificados por el Western Blot en todas las muestras (Figura 2). Después de 12 meses de la infección, la expresión de la proteína AT1R fue significativamente mayor en los animales infectados con SS1 que en los controles en ese momento (Figura 3). No se encontraron diferencias significativas en la expresión de la proteína AT2R entre los diferentes grupos de jerbos (no mostrados). Figura 2 imagen ejemplar de las transferencias Western. Panel superior: La inmunorreactividad contra AT1R a los 41 kDa en el PC-12 lisado celular (control positivo) y en muestras de pared completa antrales. Panel inferior: La inmunorreactividad contra AT2R que indica una banda débil a 44 kDa en Hep G2 (control positivo) y bandas en muestras de pared completa antrales
Figura 3 Diagrama de caja que muestra la expresión de proteínas AT1R 12 meses después de la inoculación en jerbos infectados con H. pylori. cepas TN2GF4 y SS1 y en los controles. La expresión de la proteína AT1R fue significativamente mayor en los animales infectados con SS1 en comparación con los controles (prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de Mann-Whitney). Los niveles de proteína se presentan como densidad óptica (OD). La mediana de los valores se indican con la línea transversal dentro de la caja, el rango intercuartil por la extensión vertical de la caja y el rango total de los bigotes.
Dado que H. pylori
animales infectados mostraron una abundancia de expresar AT1R células inflamatorias en su mucosa gástrica y una expresión aumentado AT1R antral, se realizó un análisis cuantitativo de las células inflamatorias en la mucosa para evaluar si la sobre regulación de la proteína AT1R en jerbos infectados con SS1 estaba relacionado con la mucosa infiltración de células inflamatorias.
el grado de infiltración de la mucosa de ambos leucocitos mononucleares y polimorfonucleares (reflejada por la densidad de volumen de la lámina propia) no difirió entre los jerbos infectados con SS1 y infectadas por TN2GF4. Sin embargo, la infiltración mucosal de leucocitos polimorfonucleares (PMNs) fue significativamente mayor en los animales infectados con SS1 que en los animales infectados por TN2GF4 12 meses después de la inoculación (Tabla 2). Los PMN en el H. pylori
mucosa infectado con consistían casi exclusivamente de los neutrófilos (Figura 1O); sólo unos pocos eosinofílica y no hay células basófilas podrían ser identificadas en el microscope.Table 2 Análisis cuantitativo de células inflamatorias en la mucosa antral jerbo después de 12 meses de Helicobacter pylori
infección

control
TN2GF4
SS1
mucosas infiltración de leucocitos polimorfonucleares y mononucleares (reflejada por la densidad de volumen (%) de la lámina propia)
26,7 ± 2,4 47,1 ± 2,2

41,3 ± 2,4
mucosas infiltración de leucocitos polimorfonucleares (PMN /mm2 lámina propia)
198 ± 37
1892 ± 169 4166 ± 275
* *
Los valores son la media ± error estándar de la media
** p <.; 0,01, SS1 frente TN2GF4. Mann-Whitney U-test
una relación lineal (r = 0,75, p < 0,01) se observó entre la expresión de la proteína AT1R en el antro y el número de leucocitos polimorfonucleares en la mucosa del antro después de 12 meses de H. pylori
infección (Figura 4). Esta relación fue apoyado por la correlación entre la expresión logarítmica antral de AT1R y la expresión de la mieloperoxidasa (r = 0,58, p < 0,05) (Figura 5). Mieloperoxidasa (MPO) es una enzima que se expresa abundantemente en los neutrófilos y en menor medida en monocitos y ciertos tipos de los macrófagos [24]. Por lo tanto, los niveles tisulares de MPO sirvieron como marcadores de proteínas de la infiltración de neutrófilos en este estudio. Si el valor atípico marcado con un triángulo en la figura 5 se excluyeron del análisis (no mostrada en una figura por separado) la relación entre AT1R y MPO se vuelve notablemente más fuerte (r = 0,86 y p < 0,01). Figura 4 Relación entre la expresión AT1R en el antro y el número de leucocitos polimorfonucleares (PMN) en la mucosa del antro después de 12 meses de la infección por H. pylori.
Figura 5 Relación entre la expresión y la mieloperoxidasa AT1R expresión (MPO) en la mucosa del antro después 12 meses de infección por H. pylori. Si el valor atípico marcado con un triángulo se excluyó del análisis (no se muestra) la relación entre AT1R y MPO se vuelve notablemente más fuerte (r = 0,86 y p < 0,01).
Discusión Francia El presente estudio exploró la línea de base presencia y localización de receptores de angiotensina II en la pared antral y corporal del jerbo de Mongolia y demostraron que AT1R y AT2R se expresaron por una variedad de células. Un hallazgo de particular interés fue que una subpoblación de células endocrinas en la mucosa antral mostró una marcada expresión de AT1R. La validez del procedimiento inmunohistoquímico utilizado en el presente estudio se confirmó en varias formas. Los anticuerpos del receptor de Ang II se detectaron utilizando dos técnicas diferentes, y la especificidad de los anticuerpos primarios utilizados tanto para el Western Blot e inmunohistoquímica se comprobó mediante la comparación de los patrones de tinción de la jerbo con los de la glándula adrenal humana y por preabsorción con el bloqueo de péptido ( AT1R). México la distribución ubicua de los receptores de Ang II en el estómago informó aquí está en concordancia con lo que se ha informado anteriormente en el colon [7]. La autorradiografía del estómago de rata también ha indicado que AT1R, y un bajo número de AT2R, están presentes en todas las capas del estómago [4]. Sin embargo, la ubicación precisa de AT1R y AT2R en el estómago ha sido hasta ahora solamente escasamente explorado. Matsuo et al
. inmunohistoquímica utiliza para localizar AT1R en antro humano y lo encontró en las células del músculo liso vascular (CMLV), células mesenquimales y células del músculo liso en las capas musculares de la mucosa y la muscular propia [25]. Además, Bregonzio et al
.

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