Expresie receptora pre angiotenzín II a vzťah k Helicobacter pylori infekcii v žalúdku mongolský gerbil

výrazu receptora angiotenzínu II a vzťahu k Helicobacter pylori
-infection v žalúdku pískomil mongolský
abstraktné
pozadia
úloha renín-angiotenzínového systému v žalúdku fyziológiu a choroby doteraz bolo riedko preskúmané. Prvým cieľom tejto štúdie bolo zistiť základné prítomnosť a umiestnenie receptorov angiotenzínu II (AT1R a AT2R) v žalúdku pískomil mongolský. Druhým cieľom bolo zistiť, či sa prítomnosť H. pylori
infekcie je spojená so zmenami v expresiu týchto receptorov.
Metódy
H. pylori
-negativní a H. pylori-
infikovaný (kmeň SS1 alebo TN2GF4) boli skúmané mužských mongolskej pískomily. Žalúdky boli skúmané na šesť alebo 12 mesiacov po naočkovaní použitím imunohistochémia, western blot a mikroskopické morfometrie.
Výsledky
AT1R a AT2R boli umiestnené v rôznych buniek v Gerbil steny žalúdka, vrátane subpopulácie endokrinné bunky v antrálnej sliznice a zápalové bunky infiltrujúcej H. pylori
-infected žalúdky. Pieskomily infikované kmeňom SS1 vykazoval významne zvýšenou expresiu antrálnej AT1R proteínov a zvýšený počet infiltrujúcich polymorfonukleárnych leukocytov (PMN) po 12 mesiacoch. V AT1R expresie proteínov v korelácii s počtom PMN a antrálnej expresiu myeloperoxidasy.
Závery
angiotenzín II receptory sú prítomné v rôznych buniek v žalúdočnej stene mongolskej pískomil. Výsledky naznačujú, je závislý na H. pylori
napätie na žalúdočné AT1R prejavu a vzťah medzi žalúdočné AT1R prejavu a slizničnej PMN infiltráciou vplyv.
Pozadie
role renín-angiotenzínového systému (RAS) žalúdočné fyziológiu a choroby doteraz ako bol riedko preskúmané. Niektoré štúdie uvádzajú pôsobenie angiotenzínu II (Ang II) na slizničnej prietok krvi, kyslé žalúdočné sekrécie a kontrakcie hladkého svalstva [1-3]. Iní zapletený vplyv RAS v strese indukovaného žalúdočného zranenia a ischemické /re-perfúznom poškodenie žalúdočnej sliznice [4, 5].
Klasický endokrinné charakter RAS je dobre známy pre jeho účinky na reguláciu hemodynamického a telesné tekutiny homeostázy. Menej je známe o regulačnom dopadom tkaniva Miestne RAS, že bolo preukázané v rade orgánov, napr. mozgu, pankreasu, pažeráka a hrubého čreva [6-8]. Intersticiálna výroba Ang II sa môžu objaviť po miestnej produkcie angiotenzinogénu (AGT), ACE a renínu, alebo prostredníctvom alternatívnych ciest, vrátane štiepenia cirkulujúcich AGT inými miestne vyjadrených enzýmy, ako sú kathepsinu D a chymasy [9]. Ang II pracuje hlavne prostredníctvom dvoch receptorov, určený Ang II typ 1 receptor (AT1R) a Ang II typ 2 receptor (AT2R). V dôsledku toho mapovanie expresiu a umiestnenie receptorov Ang II je veľmi dôležité pri skúmaní potenciálny signalizácii Ang II v rôznych fyziologických a patologických nastavenia. V posledných rokoch sa RAS bolo preukázané, že sa podieľajú na rôznych patologických stavov, ako sú zápaly, hojenie rán a karcinogenézy [10, 11]. Epidemiologické štúdie tiež preukázali spojitosť medzi príbuzné RAS polymorfizmu (SNP) a rozvoj žalúdočného vredu a rakoviny žalúdka [12, 13]. Ale neboli hlásené žiadne spojenie medzi tkanivovú expresie receptorov Ang II a Helicobacter pylori
infekcie. Potenciál RAS modulovať lokálne zápalové reakcie je to dôležité, aby sa vyšetriť jeho vzťahu k dobre definované gastritídy vyvolanej H. pylori
.
V tejto štúdii sme skúmali expresiu receptorov Ang II uninfected a H. pylori
-infected pískomil mongolský. Tento zvierací model je zaujímavé, pretože to môže ľahko byť infikované H. pylori
, čo chronický aktívny zápal s patologickými zmenami, ktoré napodobňujú väčšina vyskytujú u ľudí, vrátane lézií žalúdočné vredy, žalúdočné črevné metaplázia a rakovinou žalúdka, ako obrázok [14]. Či H. pylori
infekcie sama spôsobuje rakovinu žalúdka v mongolských Gerbil zostáva pod debaty [15].
Prvá Cieľom tejto štúdie bolo zistiť základné prítomnosť a umiestnenie AT1R a AT2R v žalúdku pískomil mongolský. Druhým cieľom bolo objasniť, či prítomnosť H. pylori
infekcie je spojená so zmenami v expresiu týchto receptorov.
Metódy
Zvieratá
Experimenty boli schválené etickou komisiou pokusov na zvieratá, University of Gothenburg. Tridsať špecifických patogénov (SPF) mužskej pískomil mongolský (Charles River, Uppsala, Švédsko), sedem týždňov staré, boli použité. Tie boli náhodne rozdelené do troch skupín o rovnakej veľkosti, skladajúci sa z jednej kontrolnej skupiny a dvoch skupín, ktoré mali byť infikované H. pylori
. Päť Zvieratá boli držané v každej klietky a miestnosť bola regulovaná v závislosti na teplote (18-22 ° C), vlhkosťou (asi 55%) a cyklus svetlo /tma (12/12 h). V pieskomily mali voľný prístup k potrave (2016F, Harlan Tek. Lab, Trnka, Anglicko) a pitnej vody. Smeli jeden týždeň aklimatizácia pred očkovaním.
Bakteriálnych kmeňov a očkovanie
dva rôzne H. pylori
kmene boli použité pre naočkovanie, kmeň TN2GF4 [16], a kmeň Sydney 1 (SS1) [ ,,,0],17]. Oba kmene je známe, že spôsobujú chronické aktívny zápal žalúdka Gerbil antrálnej a telesnej sliznice. Baktérie boli pestované na Columbia dosky. Tieto kultúry sa potom užije na naočkovanie 500 ml Brucella médium obsahujúce 5% teľacieho séra novorodenca, 10 ug /ml vankomycínu a 5 ug /ml trimetoprim. Banky sa inkubujú po dobu 24 hodín za aeróbnych podmienok mikro pri 37 ° C. Baktérie boli skúmané s fázovým kontrastom mikroskopom pred podávaním zvieratám. So pieskomily sa infikujú 0,5 ml bakteriálnej suspenzie alebo Brucella bujónu iba (kontroly) za použitia kŕmenie ihly. Životaschopné počty boli vyrobené v suspenzii na určenie skutočných infekčných dávok, ktoré boli 7 × 10 7 jednotiek a 4 × 10 7 jednotiek pre SS1 a TN2GF4, resp.
Časový priebeh a obetujú
po 24 hod nalačno obdobie s voľným prístupom k pitnej vode, päť zvierat z každej skupiny bolo usmrtených šesť alebo 12 mesiacov po očkovaní. Zvieratá boli anestéziu intraperitoneálnou injekciou medetomodin (0,5 mg /kg) a Ketamín (75 mg /kg). Midline laparotomie bola vykonaná a žalúdky boli potom odstránené a otvorený pozdĺž hlavnej zakrivenie. Jedna polovica bola použitá pre kultúru, a vzorky boli odobraté z druhej polovice pre histologickú analýzu a western blot analýzy. Zvieratá boli usmrtené srdcovej rezom. Histopatologické nálezy a bakteriologické status boli hlásené skôr [14].
Imunohistochémia
Vzorky plná múr (antra a corpus) odobrali bezprostredne po otvorení žalúdkov, stanovené v Histofix (produkty Histolab AB, Göteborg, Švédsko ) pri izbovej teplote (RT) cez noc a potom opláchnuté v PBS po dobu 24 hodín. Vzorky boli následne dehydratovaný, vložené do parafínu, rezané do 5-u
silné oddiely a upevnené na sklenené sklíčka. Pred immunohistocemical farbenie boli rezy zbavené parafínu a varí sa v pufri s kyselinou citrónovou (0,01 M, pH 6,0, 10 min). Immunocruz TM farbenie System (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) bol použitý pre protokol imunohistochemického. Po inhibíciu endogénnej aktivity peroxidázy, nešpecifické viazanie sekundárnej protilátky bola blokovaná inkubáciou s normálnym kozím sére počas 30 minút pri teplote miestnosti. Nasledujúce dve polyklonálne primárne protilátky, roztoky a doba inkubácie potom použili: králičie anti-AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech, 1: 100 v PBS, 2 hodiny pri teplote miestnosti) a králičie anti-AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech, 1: 100 v PBS, 2 hodiny pri teplote miestnosti). Po inkubácii s primárnymi protilátkami, boli rezy premyté trikrát v PBS a sondovania biotinylizované sekundárnou protilátkou; komplex bol detekovaný s použitím chrenovej peroxidázy (HRP) -streptavidin a farba bola vyvinutá pomocou 3,3'-Diaminobenzidine (DAB).
neočakávaná, silné farbenie buniek s typickou vzhľadu endokrinných buniek bolo zaznamenaných po Imunohistochemické farbenie s touto metódou na báze peroxidázy. Immunoflourescens značenie bolo vykonané ďalej vylúčiť možnosť, že sa farbenie bolo výsledkom endogénnej biotín, endogénne aktivity peroxidázy alebo nešpecifické väzby sekundárnej protilátky. bol použitý nasledujúci protokol: po varu v pufri kyseliny citrónovej, nešpecifické viazanie sekundárnej protilátky bola blokovaná inkubáciou s normálnym kozím sérom (SC-2043, Santa Cruz Biotech) počas 30 minút pri teplote miestnosti. Rezy boli inkubované s primárnymi protilátkami ako je uvedené vyššie. Sklíčka potom boli premyté trikrát v PBS a skúmal sa sekundárnou protilátkou Alexa múky 488 konjugovanou kozí anti-králičie IgG (A-11034, Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA), zriedený 1: 400 v PBS po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Sklíčka sa ďalší trikrát premyté v PBS a osadené fluorescenčné montovacího média (DakoCytomation, Glostrup, Dánsko), po ktorom obrazy boli zachytené s fluorescenčným mikroskopom. Pre potvrdenie umiestnenia AT1R v endokrinných bunkách, Dvojité imunologické bola vykonaná za použitia vyššie popísaného peroxidáze založený protokol pre AT1R a vyššie popísaného immunoflorescens označovanie protokol pre primárnu protilátkou namierenou proti chromograninu (C-20, Santa Cruz Biotech, 1: 100 v PBS, 2 h pri teplote miestnosti). Nešpecifické väzby sekundárnej protilátky (Alexa múka 568-konjugovanej oslie anti-kozie IgG, A-11057, Molecular Probes Inc., 1: 800 v PBS, 1 hodina pri teplote miestnosti) bola blokovaná inkubáciou s normálnou somárov sérum (sc-2044 , Santa Cruz Biotech). Preabsorpion s prebytkom (5 x) blokovacieho peptid (sc-1173P, Santa Cruz Biotech) bola vykonaná ako kontrola pre špecificitu AT1R protilátky, zatiaľ čo primárne protilátka bola vynechaná pre AT2R.
Gerbil AT1R a AT2R majú viac ako 90% aminokyselinovú homológie sekvenčné identitu s ľudským, potkanov a myší Ang II-receptorov [18, 19]. V pieskomilov, ako je u potkanov a myší, existujú dva podtypy AT1R (AT1aR a AT1bR), ktoré sú kódované rôznymi gény, ale s 95% sekvenčnou homológie aminokyselín. Tieto podtypy receptorov je známe, že rôzne lokalizované a regulované, ale majú podobnú afinitu pre Ang II. Vzhľadom k vysokej sekvenčnej homológie aminokyselín medzi Gerbil AT1aR a AT1bR sme predpokladali rovnakú väzbovú afinitu k AT1R subtypov pre AT1R protilátky použité v tejto štúdii. Navyše protilátky použité na farbenie receptory Ang II sú stanovené výrobcom u myší, potkanov a ľudí. Preto, pre potvrdenie špecificity týchto protilátok v pieskomilov, rezy z parafínu vloženej bloky normálneho Gerbil a ľudských nadobličiek boli zafarbené ako je uvedené vyššie (s výnimkou, že obe primárne protilátky boli nariedia 1:50 v PBS) a distribučných vzorov pre Ang II receptorové protilátky boli študované. Nadobličiek distribučné štúdie ukázali, že anti-AT1R protilátok prevažne z farebného kôry nadobličiek buniek v zona glomerulosa (farbenie kapsule obklopujúce žľazy, sa tiež poznamenať, bunky hladkého svalstva ciev (VSMC) a endotelové bunky) ako v Gerbil a ľudských úsekov. Anti-AT2R protilátok zafarbia drene nadobličiek bunky a bunky v Zona glomerulosa v Gerbil a ľudskej drene nadobličiek (farbenie VSMC a endoteliálnych buniek bolo zaznamenané tiež použitie tejto protilátky). Tieto výsledky sa zhodujú s už skôr publikovaných štúdií [20], a silná podobnosť farbenie vzorov v Gerbil a ľudských nadobličiek podporuje všeobecnú použiteľnosť protilátok v pískomil tkanivách.
Western blot
po otvorení žalúdky, plnej hrúbke vzorky antrálnej múry boli okamžite odobrané, zmrazí v kvapalnom dusíku a skladované pri -70 ° C. Vzorky sa homogenizujú na ľade (Polytron, PT-MR 2100, kinematike, Switzerland) v pufri A (10% glycerol, 20 mM Tris-HCl pH 7,3, 100 mM NaCl, 2 mM fenylmetylsulfonyl fluorid, 2 mM EDTA, 2 nM EGTA , 10 mM orthovanadátu sodného, ​​10 ug /ml leupeptinu a 10 ug /ml aprotinínu všeobecného vzorca II) [21] a centrifugována pri 30,000 g počas 30 minút pri 4 ° C. Pelety boli resuspendované v pufri B (1% NP-40 [Sigma-Aldrich, Štokholm, Švédsko] v pufri A) a mieša sa pri teplote 4 ° C po dobu 1 hodiny pred odstreďovaním pri 30000 g počas 30 minút pri 4 ° C. Supernatanty boli analyzované na obsah proteínu metódou podľa Bradford [21] a uložené pri -70 ° C až do ďalšej analýzy. Vzorky boli zriedené v SDS pufri a zmes sa zahrieva pri teplote 70 ° C počas 10 minút predtým, ako je naložený na NuPage 10% bistrispropan gélu (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Jeden pruh bol naplnený prestained štandardy molekulovej hmotnosti (SeeBlue ™, Invitrogen AB, Lidingo, Švédsko) a lyzátov celých buniek PC-12 (pre AT1R Sc-2250, Santa Cruz Biotech), Hep G2 (pre AT2R; SC- 2227, Santa Cruz Biotech) a HL60 (pre myeloperoxidáze (MPO), 12-354, Upstate Lake Placid, NY, USA) boli použité ako pozitívne kontroly. Polyvinyldifluoridu membrány (Amersham, Buckinghamshire, UK) boli inkubované s polyklonálne králičie protilátky proti AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech), AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech) alebo MPO (07-496, Upstate). Alkalická fosfatáza konjugovaná kozia anti-králičia protilátkou (sc-2007, Santa Cruz Biotech pre AT1R a AT2R protilátok a IgG 12-448, Upstate, pre protilátku MPO) a CDP-Star substrátu (Tropix, Bedford, MA, USA ) boli použité na identifikáciu imunoreaktívnych proteínov chemiluminescense. Snímky boli zachytené chladenou CCD kamerou (LAS-1000, Fujifilm, Tokyo, Japonsko). A semi kvantifikácie bola vykonaná na základe porovnania vzoriek do pozitívnych kontrol pomocou softvéru (Fujifilm, Tokyo, Japonsko) mierku 3.3
Mikroskopická morphometry
Tkanivové vzorky z antrálnej múry boli fixované v Histofix (Histolab Products AB) a vložené do parafínu. Štyri-u
silné rezy boli upevnené na kódovaných sklíčka a rutinne farbené hematoxylín /eosínu (H &E). Stupeň sliznice infiltrácie mononukleárnych a polymorfonukleárnych leukocytov bol skúmaný vo svetelnom mikroskope. Lamina propria bude mať tendenciu k zvýšeniu objemu v dôsledku prílivu zápalových buniek. Z tohto dôvodu je relatívny objem lamina propria bola hodnotená pomocou morfometrie, aby odrážal infiltráciu oboch mononukleárnych a polymorfonukleárnych leukocytov. Toto bolo vykonané H.F.H. v svetelným mikroskopom, s 10 x 10 štvorcové mriežky vložené do okuláru a x 25 šošovky objektívu. Za použitia metódy bod počítania [22], hustota objem lamina propria sa stanoví a vyjadrí sa v percentách sliznice (v tomto prípade definovaná ako oblasť medzi povrch sliznice a v dolnej časti žliaz). Slizničnej objem je tu definovaný ako epitelové vrstve + lamina propria. Mukóznej infiltrácie polymorfonukleárnych leukocytov (PMN), bola hodnotená P.H. vo svetelnom mikroskope, s 10 × 10-štvorcové mriežky vložené do okuláru, je × 50 olej ponorné objektívu (N. A. 1.4) a olejovým hornú šošovku kondenzátora (N. A. 1.4). PMN boli identifikované ako hrubo guľaté bunky v lamina propria s temne moreného multilobulated alebo bilobulated jadra. Počet PMN v štvorcové oblasti sliznice bola stanovená, rovnako ako celkový počet štvorcov nad lamina propria; počet PMN sa vyjadruje na 1 mm 2 lamina propria. Počítanie začal z dna žliaz a skončil po vyhodnotení jedného do siedmich celých pruhoch sliznice, čo má za následok najmenej 0,077 mm 2lamina propria analyzované na časti. Systematické vzorkovanie s náhodným štartom bola použitá k výberu oblastí, ktoré majú byť študované v oboch analýz. Oblasti s lymfatických folikulov neboli zahrnuté.
Štatistická analýza
Kruskal-Wallis testu a Mann-Whitney U-testu hodnoteného významnosť v rozdieloch v proteínovej expresii medzi kontrole, TN2GF4 infikovaných a SS1 infikované skupiny. Mann-Whitneyho U test posudzovaný význam v rozdieloch v slizničnej infiltráciu zápalových buniek medzi TN2GF4 infikovaných a SS1 infikovaných pieskomilov. Lineárny vzťah medzi AT1R-proteínu a PMN, a lineárny vzťah medzi AT1R a ln (MPO) v antrálnej sliznice, boli testované s Pearson korelácia. Všetky testy boli dvojchvostý, a štatistická významnosť bola stanovená na p < 0.05. Všetky štatistické analýzy boli vykonávané pomocou SPSS, verzia 15.0 (SPSS Inc. Chicago, Illinois).
Výsledky
Lokalizácia AT1R a AT2R bielkovín
Imunoreaktivita na AT1R a AT2R bielkoviny bolo pozorované u všetkých Gerbil vzorky študované, a nie farbenie bol pozorovaný v kontrolných sekcií. Protilátka AT1R všeobecne indukuje výraznejšie sfarbenie než AT2R protilátky.
Niekoľko tkanív oddelenia ako v korpuse a antra, nezávislá na prítomnosti alebo neprítomnosti H. pylori infekcie
, vykazovali imunoreaktivita s oboma na Ang II subtypy receptorov (pozri tabuľku 1 pre prehľad výsledkov a na obrázku 1 pre reprezentatívne úseky. pozri tiež Ďalšie súbor 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 a 15 pre obrázky s vysokým rozlíšením). Tak, imunoreaktivita ako na AT1R a AT2R boli nájdené v endoteliálnych bunkách ciev nachádzajúcich sa v lamina propria, Submucosa (Obrázok 1B) a muscularis propria, rovnako ako v bunkách hladkého svalstva svalové mukózy a muscularis propria (obr 1C a 1G) a v niektorých mezenchymálnych buniek nachádzajúcich sa v lamina propria a submukóze. Sa tiež zistilo, slabé farbenie oboch receptorov, najmä v bazálnej časti väčšiny epitelových buniek. nebol pozorovaný zreteľný farbenie intramurální nervových štruktúr. Imunoreaktivita iba AT1R bola pozorovaná vo vaskulárnych buniek hladkého svalstva ciev v submukóze, muscularis propria a serózne blany ako korpusu a antrálnej časti žalúdka (obrázok 1A a 1 g). Je zaujímavé, že silné imunologické pre AT1R sa objavil v podskupine buniek, najmä v základni antrálnej žliaz. Tieto bunky vykazovali vzhľad typický endokrinné bunky, to znamená, že boli pomerne malé, s bunkovými orgánmi v blízkosti bazálnej membrány; úzka reťazec cytoplazmy bola pozorovaná v niektorých prípadoch (obrázok 1G, 1H a 1i). Taký AT1R farbenie nebolo možné nájsť v endokrinných bunkách podobných v oxyntických sliznice. Dvojité imunologické pre AT1R a pre pan-endokrinné markeru Chromogranin A [23] potvrdilo, umiestnenie AT1R v subpopulácii endokrinných buniek v Gerbil antrálnej sliznice (obr 1M a 1N) .Table 1 Lokalizácia AT1R a AT2R proteínu v žalúdočnej stena pískomil mongolský
Tissue priehradka

bunkový typ
AT1R

AT2R
sliznice
epitel
Väčšina epitelové bunky
+ predovšetkým v bazálnych častiach
+ predovšetkým v bazálnej diely
malé epitelové bunky v základni žliaz
+++ v niektorých endokrinných ako buniek v dutine
žiadny
Lamina propria
cievneho riečiska
+ v endotelu
+ v endotelu
nervové štruktúry
žiadny
Nie
mezenchymálnych bunky
++ v niektorých bunkách;
++ v leukocytov v H. pylori
-infected
+ v niektorých bunkách;
++ vo leukocytov H. pylori
-infected
muscularis sliznice
bunky hladkého svalstva
++
+
Submucosa
cievneho riečiska
+ v endotelu,
++ v VSMC
+ v endotelu;
nie V VSMC
nervových štruktúr
žiadny
žiadne
mezenchýmové bunky
++ v niektorých bunkách,
++ vo leukocytov v H. pylori
-infected
+ v niektoré bunky,
++ vo leukocytov v H. pylori
-infected
muscularis propria
buniek hladkého svalstva
++
+
cievneho riečiska
+ v endotelu;
++ v VSMC
+ v endotelu;
nie V VSMC
nervové štruktúry
n.o.
n.o.
seroza
cievneho zásobenia
n.o. v endotelu;
++ vo VSMC
nie nie
: nebola pozorovaná (alebo nešpecifické) imunoreaktivitu
+: slabá imunoreaktivita, ale s výraznou polohou
++: ľahko rozpoznateľné imunoreaktivita
+ ++: silná imunoreaktivita
VSMC: bunky hladkého svalstva ciev
Obrázok 1 Preukázanie imunohistochemické umiestnenie AT1R a AT2R v žalúdku pískomil mongolský. A-F ukazuje úseky z antrálnej oblasti s SS1-infikované Gerbil 12 mesiacov po očkovaní. A) bunky hladkého svalstva ciev (VSMC) v tepne sa nachádza v seróza škvrny pozitívne pre AT1R proteín (zelená farba). B) Endoteliálne bunky (end) a neidentifikované mezenchýme bunky (M) umiestnenú vo Submucosa ukazuje imunoreaktivity pre AT2R proteínu. C) Bunky hladkého svalstva v svalovej vrstvy muscularis propria škvrnu pozitívne pre AT2R proteínu. D) negatívna kontrola (po sebe v časti A v) preabsorbed s blokovacím peptidom pre AT1R protilátky, ukazuje žltú autofluorescence od erytrocytov. E & F) negatívnych kontrol pre AT2R protilátky, po sebe idúce do sekcií B & C, v danom poradí. G, H sú skupiny z antrálnej oblasti kontrolnej zviera 6 mesiacov po očkovaní a v časti (i) je z Gerbil TN2GF4 infikovaných, 12 mesiacov po inokulácii. Silné imunologické pre AT1R bolo možné zistiť u buniek s typickou vzhľad endokrinných buniek, (e). Svalové mukózy (mm), muscularis propria (mp) a bunky hladkého svalstva ciev (VSMC) tiež zafarbené pozitívne pre AT1R. Použila metóda založená peroxidázou (hnedá farba) na farbenie AT1R v G, H a imonufluoreskujúca (zelená farba) bolo použité na farbenie AT1R v (I). J, K a L) Po sebe idúce úseky z antrálnej oblasti s TN2GF4-infikované Gerbil, 6 mesiacov po očkovaní. J) Imunohistochemické pre AT1R (zelená farba) ukazuje zhluky leukocytov (Leu) vyjadrujúca AT1R proteín. K) Negatívna kontrola na úseku v J, ukazuje žltú autofluorescence z erytrocytov. L) po sebe idúcich sekcie do sekcie v K, bežne farbeného H &E, čo potvrdzuje, že agregáty sú leukocyty. M a N ukazuje Dvojité imunologické pre AT1R (hnedá farba v M) a pre pan-endokrinné strážca Chromogranin A (červenej farby v n) s antrálnej časti kontrolného zvieraťa. Biela šípka na M a N miest na bunku v základni s antrálnej žľazy, ktorý zafarbí pozitívne na oba AT1R a Chromogranin A. Niektoré z pozitívnych buniek chromograninu neboli immunopositive na AT1R. Sekcia O demonštruje neutrofilov (PMN) v antrálnej sliznici s SS1-infikované Gerbil 12 mesiacov po očkovaní.
Intenzitu a distribúciu imunoreaktivity vyššie popísaného Nezdalo sa bude líšiť medzi H. pylori
-negativní a H. pylori
-infected zvierat alebo medzi zvieratami obetovaná na šesť alebo 12 mesiacov po očkovaní. Avšak, jeden zrejmý rozdiel bol zaznamenaný medzi H. pylori
negatívnych a H. pylori
-infected zvierat: rozdiel v neinfikovaných pieskomilov, úseky oboch antra a corpus nakazených zvierat vykazovali veľké množstvo zápalových buniek v lamina propria s imunoreaktivitu ako na AT1R a AT2R. V jednej z TN2GF4 infikovaných zvierat usmrtená šiestich mesiacov, agregáty zápalových buniek boli tiež pozorované v muscularis propria (obr 1J, 1K a 1L). Žiadne zjavné rozdiely v farbenie vzorov alebo intenzity boli pozorované medzi zvierat infikovaných kmeňom TN2GF4 alebo kmeňa SS1, alebo medzi zvieratá usmrtené šesť alebo 12 mesiacov po naočkovaní.
Kvantifikácia AT1R a AT2R bielkovín a vzhľadom k zápalových buniek
Vzhľadom k podobnej imunohistochemické vzhľadu receptorov angiotenzínu II v korpuse a dutine (s výnimkou AT1R vyjadrujúce subpopulácii endokrinných buniek uvedených vyššie) v šiestich a 12 mesiacov, kvantitatívne hodnotenie bola obmedzená na antrálnej vzoriek po 12 mesiacoch po inokulácii .
Obaja AT1R a AT2R proteíny boli identifikované westernovým prenosom vo všetkých vzorkách (obrázok 2). Po 12 mesiacoch infekcie, výraz AT1R proteín bol v SS1 infikovaných zvierat významne vyššia než u kontrolnej skupiny v tom čase (obrázok 3). Žiadne významné rozdiely v expresiu proteínov AT2R boli nájdené medzi rôznymi skupinami pieskomilov (nie je znázornené). Obrázok 2 exemplárne obraz západných škvrny. Horná doska: Imunoreaktivita proti AT1R 41 kDa v PC-12 bunkového lyzátu (pozitívna kontrola) a v antrálnej vzorkách plné steny. Spodná doska: Imunoreaktivita proti AT2R naznačuje slabý pás pri 44 kDa v Hep G2 (pozitívna kontrola) a kapiel v antrálnej vzorkách plnej nástenných
Obrázok 3 ukazuje boxplot Protein Expression AT1R 12 mesiacov po očkovaní v pieskomilov infikovaných H. pylori. kmene TN2GF4 a SS1 a kontrol. Výraz AT1R proteín bol významne vyšší v SS1 zvierat infikovaných v porovnaní s kontrolami (Kruskal-Wallis testu a Mann-Whitney U test). Úrovne proteínové sú prezentované ako optická hustota (OD). Medián hodnoty sú označené priečne čiary v poli, na kvartily rozmedzí od vertikálneho rozsahu boxu a celkový rozsah zo strany fúzov.
Vzhľadom na to, že H. pylori
-infected zvieratá neprejavili hojnosť AT1R vyjadrovania zápalové bunky v ich žalúdočnej sliznice a zvýšenú antrálnej AT1R expresie, bola vykonaná kvantitatívna analýza zápalových buniek v sliznici posúdiť, či up-regulácia AT1R proteínu SS1 infikovaných pieskomilov sa vzťahuje k slizničnej infiltráciu zápalových buniek.
stupeň slizničnej infiltrácií oboch mononukleárnych a polymorfonukleárnych leukocytov (odráža od objemovú z lamina propria) sa nelíšila medzi SS1 infikovaných a TN2GF4 infikovaných pieskomilov. Avšak, slizničnej infiltrácie polymorfonukleárnych leukocytov (PMN) bol v SS1 infikovaných zvierat výrazne vyššia, než v TN2GF4 zvierat infikovaných 12 mesiacov po naočkovaní (tabuľka 2). PMN v H. pylori
-infected sliznice skladala takmer výhradne neutrofilov (obr 1O); len bolo možné identifikovať niekoľko eozinofilná a žiadne bázomilné bunky vo microscope.Table 2 kvantitatívna analýza zápalových buniek v Gerbil antrálnej sliznici po 12 mesiacoch Helicobacter pylori infekcie

kontrolu
TN2GF4
SS1
slizničnej infiltrácie mononukleárnych a polymorfonukleárnych leukocytov (odráža od objemovej hmotnosti (v%) lamina propria)
26,7 ± 2,4
47,1 ± 2,2
41,3 ± 2,4
slizničnej infiltrácie polymorfonukleárnych leukocytov (PMN /mm2 lamina propria)
198 ± 37
1892 ± 169
4166 ± 275 * *
Hodnoty sú priemer ± štandardná odchýlka priemeru
** p <.; 0,01, SS1 proti TN2GF4. Mann-Whitneyho U test
lineárny vzťah (r = 0,75, p 0,01) bol zaznamenaný medzi expresiou AT1R bielkovín v dutine a počte polymorfonukleárnych leukocytov v antrálnej sliznici po 12 mesiacoch H. pylori
infekcii (Obrázok 4). Tento vzťah bol podporený logaritmickej korelácia medzi expresiou antrálnej AT1R a expresie myeloperoxidasy (r = 0,58, p menšie ako 0,05) (obrázok 5). Myeloperoxidáze (MPO) je enzým, ktorý je hojne vyjadrené v neutrofiloch a v menšej miere v monocytoch a niektoré typy makrofágov [24]. Z tohto dôvodu, tkanivové hladiny MPO slúžil ako proteínové markery infiltrácia neutrofilov v tejto štúdii. Ak je hodnota odľahlý označené trojuholníkom na obrázku 5 je vylúčený z analýzy (nie je zobrazený v samostatnom obrázku) vzťah medzi AT1R a MPO znateľne silnejšia (R = 0,86 a P < 0,01). Obrázok 4 Vzťah medzi AT1R expresie v dutine a počet leukocytov (PMN polymorphnuclear) v antrálnej sliznici po 12 mesiacoch infekcie H. pylori.
Obrázok 5 Vzťah medzi AT1R prejavu a myeloperoxidáze (MPO) expresie v antrálnej sliznici po 12 mesiacov infekciou H. pylori. Ak je hodnota odľahlý označené trojuholníkom je vylúčený z analýzy (nie je znázornené) vzťah medzi AT1R a MPO stáva znateľne silnejšie (r = 0,86 a p 0,01).
Diskusia
tejto štúdii skúmali smerného prítomnosť a umiestnenie angiotenzín II receptory v antrálnej a telesnej stene mongolskej Gerbil a preukázali, že AT1R a AT2R boli vyjadrené rôznymi bunkami. Zistenie zvláštneho záujmu bolo, že subpopulácie endokrinných buniek v antrálnej sliznice, preukázala výraznú expresiu AT1R. Platnosť imunohistochemické postupu použitého v tejto štúdii bola potvrdená rôznymi spôsobmi. Tieto receptorové protilátky Ang II boli detekované s použitím dvoch rôznych techník, a špecifickosť primárnych protilátok používaných ako pre Western blot a imunohistochemicky bola overená porovnaním farbenie vzory Gerbil s tými, ľudské nadobličiek a preabsorpci s blokovaním peptid ( AT1R).
všadeprítomný distribúcia receptorov Ang II v žalúdku tu hlásené je v zhode s tým, čo bolo uvedené skôr v hrubom čreve [7]. Autorádiografické z potkana žalúdka bolo tiež uvedené, že AT1R, a nízky počet AT2R, sú prítomné vo všetkých vrstvách žalúdka [4]. Avšak, presné umiestnenie a AT1R AT2R v žalúdku je zatiaľ len bol riedko preskúmané. Matsuo et al
. Použité imunohistochémia lokalizovať AT1R v ľudskej dutine a zistil, že v bunkách hladkého svalstva ciev (VSMC), mezenchýmových buniek a buniek hladkého svalstva pri svalových vrstiev sliznice a muscularis propria [25]. Ďalej, Bregonzio et al
.

• Helicobacter pylori infekcie vyvolané rakovinu žalúdka; pokročiť v žalúdku výskumu kmeňových buniek a zostávajúce výzvy
• Vyhodnotenie a klinický význam vekové modelu žalúdka pre hodnotenie starnutie žalúdka-multicentrickej štúdie v Číne