PLOS ONE: isocitratdehydrogenas av Helicobacter pylori Potentiellt inducerar humoralt immunsvar hos patienter med magsår och Gastritis

Abstrakt

Bakgrund

H. pylori
orsakar gastrit och magsår och är en riskfaktor för att utveckla magcancer. Många av de proteiner såsom ureas, poriner, flagellins och toxiner såsom lipo-polysackarider har identifierats som potentiella virulensfaktorer som inducerar proinflammatoriska reaktion. Vi rapporterar immunogena potentialen hos isocitratdehydrogenas (ICD), en viktig hus hålla protein av H. pylori
.

Metodik /viktigaste resultaten

Aminosyrasekvenser av H. pylori
ICD utsattes för in silico
analys för regioner med förutsägbart höga antigena index. Även datormodellering för H. pylori
ICD som intill till E. coli
ICD utfördes för att bestämma nivåer av struktur likhet och tillgängligheten av ytexponerade motiv, om något. icd
genen klonades, uttrycktes och renades till en mycket hög homogenitet. Humoralt svar riktat mot H. pylori
ICD upptäcktes genom en enzymkopplad immunsorbentanalys (ELISA) i 82 försökspersoner bestående av 58 patienter med H. pylori
associerad gastrit eller magsår och 24 asymtomatiska friska kontroller. H. pylori
ICD framkallade potentiellt hög humoralt immunsvar och avslöjade höga antikroppstitrar i serum motsvarande endoskopiskt bekräftade gastrit och ulcussjukdom ämnen. Men urea-andningsprov negativa friska kontrollprov och asymtomatiska kontrollprover inte avslöja några detekterbara immunsvar. ELISA för proinflammatoriska cytokiner IL-8 uppvisade inte någon signifikant proinflammatoriska aktivitet ICD.

Slutsatser /Betydelse

ICD H. pylori
är en immunogen som interagerar med värdens immunsystem efter en eventuell autolytisk frisättning och därmed avsevärt framkallar humorala svar hos individer med invasiva H. pylori
infektion. Dock kunde ICD inte signifikant stimulera IL8 induktion i en odlad makrofag cellinje (THP1) och därför inte kan vara en betydande proinflammatorisk agent

Citation. Hussain MA, Naveed SA, Sechi LA, Ranjan S, Alvi A, Ahmed I, et al. (2008) isocitratdehydrogenas av Helicobacter pylori
Potentiellt inducerar humoralt immunsvar hos patienter med magsår och gastrit. PLoS ONE 3 (1): e1481. doi: 10.1371 /journal.pone.0001481

Academic Redaktör: Keertan Dheda, University College London, Storbritannien

emottagen: 29 augusti 2007; Accepteras: 24 december, 2007; Publicerad: 23 januari 2008

Copyright: © 2008 Hussain et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Stöd från CDFD Kärn Grants (Institutionen för bioteknik, Indiens regering) Review

konkurrerande intressen. författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Helicobacter pylori
är en gramnegativ, krökt bakterie som etablerar kroniska infektioner i människans mage. Det är en viktig patogen som tros ha samar utvecklats med människor [1], [2]. Den lever ungefär hälften av världens befolkning och betraktas som en potentiell riskfaktor för utveckling av magcancer [3]. H. pylori
är en erkänd orsak till kronisk gastrit, magsår, magcancer, och slemhinnor associerad lymfoid vävnad (MALT) lymfom. Flera mekanismer har föreslagits för att förklara dess roll i patogenesen av tarmen. Trots höga kolonisering priser endast en liten del av smittade människor upplever H. pylori
-associated sjukdomar [2]. Sammanslutningar av H. pylori hotell med sjukdomsspecifika faktorer har varit mer eller mindre gåtfulla även om genomsekvenser var dechiffreras nästan ett decennium sedan [2].

En av de mest utmärkande dragen i H. pylori
är den genetiska mångfalden mellan kliniska isolat erhållna från olika patientpopulationer [3]. Omarbetning av genomet är normen med denna bakterie, skapar därigenom en mycket allel och fasvariationen [3], försvårar i utvecklingen av diagnostik och vaccin.

När förvärvats kvarstår infektion år efter, framkallar detekterbara immunsvar i infekterade personer [4], [5] som kännetecknas av förhöjda nivåer av specifikt IgG och IgA i serum och förstärkning av sekretorisk IgA och IgM i magen [6]. Därför var noninvasive serologiska tester rekommenderas och utvecklats för diagnos av H. pylori
infektion. Bland dessa är det enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) en av de mest omfattande använda metoden eftersom det är relativt prisvärd, snabb, enkel att utföra, och kunde lätt antas för screening av ett stort antal prover [7]. Exploring för anti H. pylori
antikroppar ordineras ofta före endoskopi eller före behandlingsstart. Även på grund av immunologiskt minne, kan serodiagnos inte vara att föredra att kontrollera framgång eller resultatet av behandlingen utrotning, är det fortfarande ett val som en känslig metod förmodligen på grund av dess icke-invasiva natur [8].

För närvarande finns har inte varit någon enkel "gold standard" antigen, som entydigt kan användas i alla populationer. En av de viktigaste anledningarna till detta kan vara den extraordinära mångfald som finns i H. pylori
[9] - [13] och även dess specifika anpassning i olika värdar [12], [13]. Även om proteiner såsom katalas, gro
EL, och flagellin är starkt immunogena, de ger icke-specifika korsreaktioner med andra Gram-negativa bakterier och närmare bestämt, Campylobacter jejuni
[14], [15]. I kontrast, virulens länkade antigener såsom CagA eller VacA, visa en ganska hög grad av sekvensvariation, eftersom det existerar H. pylori
stammar, som är genetiskt skiftande och fenotypiskt variabel för den ena eller båda antigenerna [16] - [18]. Trots detta har tillfredsställande samband mellan serumantikroppar och invasiv sjukdom har beskrivits [19].

Hushållning gener av H. pylori
har använts nyligen för att spåra befolkningsmigrationer och befanns vara stabil i genomet över århundraden [20]. Hushållning proteiner dock inte har testats i stort för deras användning inom diagnostik och vacciner. De metaboliska enzymer verkar vara en bra kandidat som skall ingå i en immuno-diagnostisk testkit eftersom de ofta inte korsreagerar med sera från friska kontroller [21]. Också, på grund av sin hushållning funktion, de är mycket konserverade bland olika H. pylori
stammar oberoende av deras genotyper och således kan tjäna som ideala immuno-diagnostiska kandidater.

Proteiner som frigörs från bakterier under sena logaritmiska tillväxtfasen, såsom superoxiddismutas och isocitratdehydrogenas (ICD), är beskrivas som autolys markörer [22] - [24] och en del av dem har visat sig vara utmärkta diagnostiska antigener. Till exempel, ICD M. tuberkulos
har beskrivits som ett potentiellt antigen för att diskriminera patienter lungtuberkulos från friska kontroller [24]. Men tidigare jämförelser av de antigena mönster H. pylori
proteiner (inklusive några av hushållning proteiner) erkänns av patientsera visade ingen sammanslutning av specifik H. pylori
antigener med fall av särskilt gastroduodenal patologi [21].

Denna studie visar interaktion av värdens immunsystem med H. pylori
ICD i form av betydande humorala svar ses i sjukdoms ämnen. Vidare beskriver vi H. pylori
ICD antigen att skilja patienter med magsår och gastrit från oinfekterade friska individer.

Resultat

I silico modellering, uttryck och rening av H. pylori ICD protein

proteinsekvensen hos ICD H. pylori
analyserades för att förutsäga dess immunogenicitet baserat på antigenindex, hydrofilicitet och yta sannolikhet. Figur 1A visar i silico
antigena profiler av ICD genereras med hjälp av Protean programvara (DNAStar Inc. USA). I korthet har flera spår motsvarande immunreaktiva aminosyramotiv med förutsägbart högre antigen index (~3.4) identifieras. H. pylori
ICD visas alltså stora antigena sträckor (Figur 1A) meddelar oss att titta på det som en förmodat immunogent protein. Antigeniciteten Index för ICD var jämförbara med dem som tidigare rapporterats för en PPE antigen Rv2430c av mykobakteriella ursprung, vilket ytterligare har visat sig vara en immun antigen [25]. E. coli
ICD analyserades också på liknande sätt och verkade vara förmodat immunogen; det fanns en tydlig skillnad hittades jämfört med H. pylori
ICD, med avseende på förekomst och positionen av antigena rester. Senare, vi konstruerat en homologimodell av H. pylori
ICD baserad på kristallstrukturen för E. coli
ICD (PDB kod 1AI2) och kunde beskriva organisation ryggraden i H. Pylori
(26695) ICD tillsammans med den i E. coli
. De två ICD befanns vara signifikant liknande (RMS Avvikelse 0,45) ännu skilde med avseende på tre viktiga ytan exponerade sling regioner som sannolikt kommer att utgöra områdena strukturella skillnader motsvarar de förmodade antigena epitoper, möjligen att ge svar differentiell antikropps (Figur 1B ) katalog

överuttryckta N-terminal His-märkt ICD renades till >. 95% homogenitet på en nickelaffinitetskolonn (Figur 2). Molekylmassan för det rekombinanta ICD bestämdes till 47 kDa. Proteinrening utfördes under nativa betingelser med ett utbyte av 2,0 mg protein per 500 ml startkultur.

Interaktion av H. pylori ICD med människans immunsystem

humorala immunsvar riktade mot H. pylori
ICD jämfördes hos patienter med H. pylori
infektion (gastrit, NUD, DU och GC) och friska kontroller (Figur 3). Immunoreaktiviteten uppgifterna analyserades statistiskt och jämfördes med anslutning till både infekterade och friska sera. Dessa data visade att serum från alla infekterade patienter som hör till gastrit och duodenalsår (DU) kategorier genomstatistiskt signifikant ( P Hotel < 0,0001) anti ICD antikroppsnivåer jämfört med de av de friska kontrollerna. ICD-proteinet, som har en till synes viktig metabolisk roll, konstaterades därför att kunna framkalla en stark humoral respons hos patienter med gastrit och DU. Men i fall av bristande sår dyspepsi (NUD) och magcancer (GC), reducerades humorala svaret sett. Med tanke på dessa observationer är det troligt att frisättningen av ICD-proteinet är associerat med aktiva, H. pylori
infektion. I motsats till observerade humorala svar, den rekombinanta, H. pylori
ICD inducerade inte några betydande cellulära immunsvar, vilket framgår av brist på sekretion av IL-8 från humana makrofager inducerad med rekombinant, H. pylori
ICD In vitro
(Figur 4). Vi kan därför tyder på att ICD exciterar endast den humorala facket och kan inte bidra till gastric patologi eller cytokin inducerade förändringar i gastric fysiologi.

Diskussion

Identifiering och karakterisering av mycket immunogent H. pylori
proteiner är ett obligatoriskt krav för utveckling av serologiska tester baserade på rekombinanta renade antigener. Kombinerat med utandningstestet är serologi en icke-invasiv metod för att detektera H. pylori
infektion, och flera serologiska testkit baserade på många olika H. pylori
antigener är kommersiellt tillgängliga. Även det humorala immunsvaret till H. pylori
verkar vara ganska varierande, kan kombinationer av ofta erkända antigen vara till nytta för diagnostiska ändamål [21]. De metaboliska enzymer såsom ICD verkar vara bra kandidater som ska utnyttjas för serologiska testutrustning utveckling främst därför att de inte korsreagerar med serum från icke-infekterade eller friska individer [24].

Betydelsen av många immunogena proteiner av H. pylori
inklusive vissa metaboliska enzymer har inte uppskattat mycket i kliniska prover i en tidigare proteomik baserad studie [21]. Vår studie var dock riktad mot utvärdera renat, rekombinant, H. pylori
ICD för sina immunologiska egenskaper i olika klasser av H. pylori
patienter infekterade med syra peptiska sjukdom. Vi försökte att systematiskt undersöka förekomsten och nyttan av immunsvar som framkallas av ICD-proteinet i H. pylori
infekterade patienter.

Vår analys med hjälp av rekombinant ICD H. pylori
visade signifikant höga antikroppstitrar hos patienter magsår och magkatarr, jämfört med NUD och cancerpatienter (Figur 3). Vi spekulerar att immunsvaret sett i magsårsfall och gastrit kanske kan bero på hög belastning av bakterier i samband med invasiv patologi och därmed ett större antal brutits ned genom autolys patogener eller patogener presenterar ICD på ytan. Detta kan möjligen kunna förklara den jämförelsevis höga-antikroppssvar hos invasiva kategorin patienter.

H. pylori
antigener beskrivs att släppas in i det extracellulära utrymmet via flera mekanismer som specifika utsöndringsvägar, autolys, och bildning av membranvesiklar [23] och ytegenskaper H. pylori
har föreslagits att vara unik i att låta adsorption /yta lokalisering av sådana proteiner [26]. ICD är traditionellt kända som markörer för autolys [22], [24], [27], som släpptes under den sena logaritmiska fasen. Den extracellulära frisättningen av proteiner skulle kunna vara förekommande endast under In vitro
tillväxten av H. pylori
. Men In vivo
förekomsten av sådana mekanismer, om visat skulle kunna förklara betydelsen av olika utsöndrade proteiner i molekylär patologi av ulcussjukdom. Införsel av H. pylori
proteiner i mag submukosala utrymmet kan ha viktiga funktionella konsekvenser såsom främjande av proinflammatoriska och kemotaktiska svar genom frisättning av cytokiner från aktiverade makrofager. Dessutom kan den extracellulära frisättningen och eller adsorption eller yta lokalisering [26] av potentiellt immunogena proteiner stödja en bakteriell strategi för att avleda en effektiv lokal immunsvar [23]. Att hålla dessa multipla mekanismer i åtanke, vi kontrollerat proinflammatoriska potentialer ICD med hjälp av en IL-8 ELISA-analys. I vår observation gjorde ICD inte signifikant inducerar IL-8-utsöndring i differentierade, odlade makrofager. Men eftersom vi inte har analyserat roll ICD som gäller induktion av andra proinflammatoriska cytokiner såsom TNF-α och IL1-β, kommer det att vara för tidigt att rätta utesluta sitt engagemang i gastric inflammation.

Efter att ha visat att H. pylori
ICD framkallar ett humoralt svar, vi undersökte grund av immun specificitet av detta protein som reflekteras av strukturen baserad modellering. Vår sekvensanalyser och molekylär modellering av H. pylori Köpa och E. coli
ICD inte avslöja strukturella överlappningar mellan de två (figur 1); flera regioner i strukturella olikheter var urskiljas som eventuellt motsvarar de förmodade antigena epitoper i H. pylori
ICD. Bortsett från de problem som är kopplade till strukturell bevarande eller mångfald, hypotes vi att högre reaktivitet av H. pylori
ICD jämfört med ICD (kommen) E. coli hotell med värdens immunsystem In vivo
skulle kunna förknippas med ett) olika invasions av H. pylori Köpa och E. coli
2) olika magnituder av bakteriehalten, omsättning och autolys 3) olika repertoar av antigenpresenterande celler (makrofager jämfört dendritiska celler) som är involverade och deras utbredning 4) tillgången på ytan exponerade epitoper i H. pylori
ICD (som de som anges i figur 1B), och 5) närvaro av aktiva lesioner av kronisk inflammation, slemhinneskada och kemotaktiska effekter av andra H. pylori
proteiner i miljö
.

När man överväger eventuell korsreaktivitet från andra invasiva bakterier såsom C. jejuni
, testade vi H. pylori
ICD mot 8 prover av C. jejuni
enterit patientsera och fann att det inte korsreagerar signifikant (data visas ej). H. pylori
status av vår C. jejuni
positiva patienter bestämdes baserat på avsaknad av symptom på matsmältningsbesvär, magont och halsbränna etc. Men eftersom vi använde endast begränsade serumprover från C. jejuni
patienter, vi är inte benägna att varumärket H. pylori
ICD som en fristående diagnostisk antigen. Ändå, C. jejuni
kanske inte alltid bestå av en mycket konkurrenskraftig bakgrund om C. jejuni
patienterna själva är kliniskt koloniseras av H. pylori
eller vice versa.

Slutligen lovande resultat vi fick i form av betydande humorala svar på H. pylori
ICD får inte tolkas som omedelbart tillämplig för fältnivå diagnos. Ändå är det möjligt att våra resultat ger en solid grund för utvecklingen av en sero-diagnostiskt test för H. pylori
associerade gastroduodenala patologier. Vi föreslår potentialen för denna antigen och dess epitop specifika peptider kan dessutom analyseras genom att använda ett stort batteri av serumprover som representerar olika sjukdoms ämnen. På samma sätt, status och betydelse av korsreagerande antikroppar i sera motsvarande sjukdomar orsakade av bakterier såsom Salmonella spp., Shigella spp. och andra invasiva tarmpatogener kan också bestämmas. Det kommer att vara värt att utforska på djupet medverkan av ICD i signalerings aktiviteter i submukosala utrymme, speciellt dess interaktion med de aktiverade makrofager och lymfocyter. Dessutom, med tanke på dess viktiga roll i trikarboxylsyra cykeln och frånvaron av glyoxylat shunt i H. pylori
[27], utvärderingen av ICD som en möjlig interventionell mål utgör ett spännande förslag.

Material och metoder

I silico antigenicitet av förutspått H. pylori ICD (HP0023)

Nukleotidsekvens av H. pylori icd
(ORF HP0023) och den motsvarande aminosyrasekvensen erhölls från Pylorigene databasen (http://genolist.pasteur.fr) och underkastades analys genom DNAStar paket (DNAStar Inc. Madison, USA). Aminosyrasekvensen för ICD utsattes för kontroll för eventuella antigena determinanter som använder Protean program inom DNAStar paketet. Parametrar såsom hydrofilicitet, yta sannolikhet och antigenindex beräknades för hela proteinet med hjälp av denna programvara. Antigena index visar mer än 2 toppar vid > 3,0 skalor ansågs vara betydligt mer antigen

Computational modellering av ICD struktur

Använda Modeller-6, en molekylmodelleringsprogram som implementerar en automatiserad metod. jämförande proteinstruktur modellering av tillfredsställelse av rumsliga begränsningar [28] användes för att bestämma den tredimensionella modellen av H. pylori
ICD. ICD modell H. pylori
genererades baserat på E. coli
ICD mall 1A12 som delar totalt 68% sekvensidentitet med H. pylori
ICD.

Produktion av rekombinant H. pylori ICD

ORF motsvarande H. pylori icd
(HP0023, 1,275 kb) amplifierades med PCR från genom-DNA av en H. pylori
patienten isolera MS8. Det rekombinanta ICD-proteinet var överuttryckt i E. coli
och renades till homogenitet (figur 2) enligt de metoder som tidigare beskrivits av Banerjee et al
[24]. Skörden av renat protein standardiserades upp till 2,0 mg renat protein per 500 ml startkultur av rekombinant E. coli
. Det renade rekombinanta proteinet dialyserades mot 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, med 100 mM NaCl och 3% glycerol. Vidare var det renade proteinet behandlas med polymixin B för att utesluta effekterna av LPS föroreningar. Det renade rekombinanta ICD lyofiliserades och omedelbart lagras fryst för användning nedströms i klinisk diagnos.

Patienter och humana serumprover

Studiepopulationen ( n
= 82) bestod av 58 H. pylori
infekterade patientprover (för uppgifter om antalet fall som analyserats i varje kategori, se figur 3) som erhållits från fall rapporterar främst till Deccan College för medicinska vetenskaper och Allied Sjukhus, (DCMS), Hyderabad, och 24 kliniskt friska givare. Den friska kontrollgruppen bestod av 18 beprövad H. pylori
negativa fall testas med utandnings Assay (UBA) och 6 asymtomatiska individer som bekräftades H. pylori
negativ testats av kommersiellt tillgängligt ELISA-kit (Pyloriset EIA-GIII, Orion, Espoo, Finland). I alla patientgrupper, var diagnosen magsår eller gastrit bekräftas eller uteslutas med endoskopi av den behandlande gastroenterolog. Förekomsten av H. pylori
i sjuka patienter som ingår i denna studie har tidigare bekräftats av Gram färgning, en snabb ureastest (RUT), 16S rRNA och CAG Review, en gen baserade PCR och kultur [29]. Studiepopulationen hade ingen kön eller ålder partiskhet. Skriftligt informerat medgivande erhölls från alla patienter och friska kontroller vid respektive centra.

ELISA för humorala svar

ELISA-analys utfördes för att kontrollera det humorala immunsvaret hos människor mot rekombinant ICD. I korthet var de 96-brunnars mikrotiterplattor belades med ~ 500 ng av rekombinant ICD protein. De belagda plattorna inkuberades över natten vid 4 ° C, tvättades tre gånger med PBS-T (0,05% Tween 20 i 1 × PBS) och två gånger med PBS. Plattorna blockerades sedan med 100 pl av blockeringsbuffert (2% BSA i 1 x PBS) vid 37 ° C under 2 timmar. Plattorna tvättades tre gånger med tvättbuffert PBS-T och två gånger med PBS. H. pylori
infekterade humana sera som tillhör olika kliniska grupper serieutspäddes (01:50, 1:100, 1:200 och 1:400) i blockeringsbuffert (1% BSA i PBS), för att erhålla optimala titrar. Utspädda sera [50 pl av 1:200 utspädda sera] sattes till antigenbelagda brunnarna och inkuberades under 1 h vid 37 ° C. Plattorna sköljdes tre gånger med PBS-T och två gånger med PBS och inkuberades ytterligare med anti-humant IgG-pepparrotsperoxidas (Sigma) vid 37 ° C under 1 timme. Pepparrotsperoxidas aktivitet detekterades med användning av en kromogen substans, o
fenylendiamin-tetrahydroklorid (Sigma) i citrat-fosfatbuffert (pH 5,4) och H _{2O 2 som en | j, l /ml. Reaktionerna stoppades genom att använda 0,5 M H 2SO 4, och absorbansvärdena mättes vid 492 nm i en ELISA-läsare (Bio-Rad). Varje ELISA upprepades åtminstone två gånger med alla kliniska sera isolat. Elev t
test utfördes för att beräkna p
värden baserade på hjälp av titrarna serumantikropps motsvarande friska och infekterade klasser genom att använda online vetenskaplig kalkylator av GraphPad (www.graphpad.com_quickcalcs_ttest1 .cfm). P
värden mindre än 0,05 ansågs statistiskt signifikant.}

ELISA för proinflammatorisk cytokin IL-8

THP-1-celler (human monocyt, ATCC TIB 202) odlades och hölls i RPMI 1640 (Invitrogen) som kompletterats med 10% fetalt bovint serum, 2 mM glutamin och 1% anti-bakteriell och anti-mykotisk lösning (Gibco). För makrofagliknande skede, ungefär 1 x 10 ^{-6 celler /brunn var differentierade med användning av 5 ng /ml Forbol-12-myristat 13c acetat (PMA, Sigma). Efter 24 timmar tvättades cellerna en gång med RPMI 1640-medium och stimulerades med användning av 10 | ig /ml av rekombinant ICD. En proinflammatoriska protein, HP940 av H. pylori
[30], renades under liknande betingelser användes som en positiv kontroll (en ug /ml). Celler inkuberades under 24 timmar i en fuktad atmosfär vid 37 ° C. Celler utan proteinbehandling (ostimulerade celler) tjänade som negativ kontroll. Odlingssupernatanten uppsamlades efter 24 timmar användes för uppskattning av IL-8 med användning av kommersiellt tillgängliga optEIA ELISA Kit (BD Biosciences). Utfördes enligt instruktionen av tillverkaren och cytokinnivåer beräknades med hjälp av rekombinant standard ingår i kitet. Känslighet hos IL-8 var 3,1 pg /ml. Värden uttrycktes som medelvärde ± SD.}

Tack till

Vi är tacksamma för Seyed E. Hasnain och Sharmistha Banerjee för diskussioner. Vi tackar våra samarbetspartners CM Habibullah och Barik A Salih för hjälp med patientmaterial och information. Tack också till Francis Megraud för att tillhandahålla olika kontrollserumprover. NA är motsvarande Fellow europeiska Helicobacter Study Group (EHSG).

• PLOS ONE: Bakteriell Microbiota profilering i gastrit utan Helicobacter pylori-infektion eller icke-steroida antiinflammatoriska droganvändning
• PLOS ONE: Associerade Faktorer av atrofisk gastrit diagnostiseras genom dubbel Contrast Övre gastrointestinal Barium X-Ray Röntgen: En tvärsnittsstudie Analysera 6,901 friska försökspersoner i Ja…