Ploche ONE: isocitrátdehydrogenáza Helicobacter pylori Potenciálne indukuje humorálna imunitná odpoveď u pacientov s žalúdočný vred choroby a gastritídy

abstraktné

Pozadie

H. pylori
spôsobuje gastritídy a peptické vredy a je rizikovým faktorom pre rozvoj karcinómu žalúdka. Mnohé z proteínov, ako sú ureázy, purínov, flagellins a toxíny, ako sú Lipo-polysacharidov boli identifikované ako potenciálne faktory virulencie, ktoré indukujú prezápalovú reakciu. Autori uvádzajú imunogénna potenciál isocitrátdehydrogenáza (ICD), významného dom vedenie proteínu H. pylori
.

Metodika /hlavných zistení

Aminokyselinové sekvencie H. pylori
ICD boli podrobené in silico
analýzy pre regióny s vysokým predvídateľne antigénne indexy. Tiež, výpočtovej modelovanie H. pylori
ICD, ako vedľa seba na E. coli
ICD bola vykonaná na stanovenie úrovne štruktúry podobnosti a dostupnosťou povrchu vystavenom motívov, ak existuje. ICD
gén bol klonovaný, exprimovaný a purifikovaný na veľmi vysokej homogenity. Humorálna odozva namierená proti H. pylori
ICD bola detekovaná pomocou enzymatické imunologických testoch (ELISA) v 82 ľudských subjektov, ktorý pozostáva z 58 pacientov s H. pylori
spojené gastritídu alebo vredovým ochorením a 24 asymptomatických zdravých kontrol. H. pylori
ICD vyvolal potenciálne vysokú humorálnej imunitnú odpoveď a odhalil vysoké titre protilátok v sére zodpovedajúcej endoskopicky potvrdenej gastritídy a vredov predmety chorôb. Avšak, močovina-dych-test negatívny vzorky zdravých kontrolných a asymptomatické kontrolné vzorky neodhalili žiadne zistiteľné imunitnej odpovede. ELISA pre prozápalových cytokínov IL-8 nevykazovali žiadnu významnú prezápalovú aktivitu ICD.

Závery /Význam

ICD z H. pylori
je imunogén, ktorý interaguje s imunitným systémom hostiteľa následnej k možnému autolytické uvoľňovanie a tým výrazne vyvoláva humorálnu odozvy u jedincov s invazívnej H. pylori
infekciu. Avšak, ICD nemohol významne stimulovať IL8 indukciu kultivované bunkové línie makrofágov (THP1), a preto nemusí byť pozoruhodný prozápalový prostriedok

Citácia :. Hussain MA, Naveed SA, Sechi LA, Ranjan S, Alvi A, Ahmed I, et al. (2008) isocitrátdehydrogenáza zo Helicobacter pylori
potenciálne indukuje humorálna imunitná odpoveď u pacientov s žalúdočný vred choroby a gastritídy. PLoS ONE 3 (1): e1481. doi: 10,1371 /journal.pone.0001481

Akademický Editor: Keertan Dheda, University College London, Veľká Británia

prijatá: 29. augusta 2007; Prijaté: 24.prosince 2007; Uverejnené: 23. januára 2008

Copyright: © 2008 Hussain et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

financovania :. Finančné prostriedky z CDFD Základné granty (Dept. of Biotechnology, vláda India)

konkurenčné záujmy :. autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Helicobacter pylori
je gramnegatívne, zakrivený baktérie, ktorá sa zavádza chronickej infekcie v ľudskom žalúdku. Ide o dôležitý patogén, ktorý je myšlienka k čo-sa vyvinul s ľuďmi [1], [2]. Vyskytuje sa asi polovica svetovej populácie a je považovaný za potenciálny rizikový faktor pre rozvoj adenokarcinóme žalúdka [3]. H. pylori
je uznávanou príčinou chronickej gastritídy, vredovej choroby, karcinómu žalúdka a sliznice, lymfóm asociovaný s lymfoidné tkanív (MALT) lymfómu. Bolo navrhnutých niekoľko mechanizmov pre objasnenie jeho úlohu v patogenéze črevách. Napriek vysokej miere kolonizačných len malá časť nakazených ľudí pociťuje H. pylori
-associated choroby [2]. Združenie H. pylori
s faktory špecifické pre jednotlivé ochorenia majú viac či menej záhadný, aj keď genómu sekvencie boli dešifrované takmer pred desiatimi rokmi zostal [2].

Jednou z najvýraznejších čŕt H. pylori
je genetickej diverzity medzi klinických izolátov získaných z rôznych populácií pacientov [3]. Prepracovanie genómu je normou s touto baktériou a vytvára tým veľa alelických a fázové kolísanie [3], čo predstavuje ťažkosti pri rozvoji diagnostiky a vakcín.

Potom, čo získal, infekcia pretrváva po mnoho rokov a, vyvoláva detekovateľné imunitné reakcie u infikovaných osôb [4], [5], vyznačujúci sa tým, zvýšené hladiny špecifických protilátok IgG a IgA v sére a zvýšenie sekrečné IgA a IgM v žalúdku [6]. Preto neinvazívna sérologické testy boli odporúčané a vyvinutý pre diagnostiku H. pylori
infekciu. Medzi tieto, enzyme-linked ImmunoSorbent assay (ELISA), je jedným z najviac široko používané spôsobom, ako je to pomerne cenovo dostupné, rýchle, jednoduché vykonať, a môže byť ľahko prijať pre skríning veľkého počtu vzoriek [7]. Za zábavou pre anti H. pylori
protilátky sa často predpisuje pred endoskopia alebo pred začatím liečby. Aj keď v dôsledku imunologickej pamäte, serodiagnosis nemusí byť výhodné kontrolovať úspech alebo výsledok liečby eradikácie, zostáva voľba ako citlivej metódy pravdepodobne preto, že jeho neinvazívneho charakteru [8].

V súčasnej dobe existuje nebola žiadna z jednotlivých "zlatý štandard" antigén, ktoré môžu byť jednoznačne použité vo všetkých populáciách. Jedným z dôležitých dôvodov pre toto by mohol byť mimoriadna rôznorodosť prítomná v H. pylori
[9] - [13] a tiež jeho špecifické prispôsobenie v rôznych hostiteľov [12], [13]. Aj keď proteíny, ako sú katalázy, gro
EL, a flagellin sú silne imunogénna, dávajú nešpecifické krížové reakcie s inými gram-negatívnych baktérií a konkrétnejšie, Campylobacter jejuni
[14], [15]. Na rozdiel od toho virulencie spojené antigény, ako je napríklad ČAGA alebo Vaca, vykazujú pomerne vysoký stupeň variability sekvencie, pretože existujú H. pylori
kmene, ktoré sú geneticky rôznorodé a fenotypovo premenná pre jeden alebo oba antigény [16] - [18]. Napriek tomu, že uspokojivé asociácie medzi protilátok v sére a invazívnym ochoreniam boli popísané [19].

Upratovanie gény H. pylori
v poslednej dobe používajú pre migráciu obyvateľstva a zistilo sa, že sú stabilné v genóme celé storočie [20]. Domácnosť proteíny však neboli testované a veľký pre ich použitie pri diagnostike alebo očkovacej látky. Metabolické enzýmy sa zdajú byť dobrým kandidátom ktoré majú byť zahrnuté do testovacieho kitu imunokorektivním diagnostiky, pretože často nemajú skrížene reagujú so sérom od zdravých kontrol [21]. Tiež, vzhľadom k svojej funkcii domácnosti, ktoré sú vysoko konzervované medzi iným H. pylori
kmene bez ohľadu na ich genotypov a tým môže slúžiť ako ideálne immuno-diagnostické kandidátov.

proteíny, ktoré sa uvoľňujú z baktérií počas neskorej logaritmickej rastovej fáze, ako je napríklad superoxiddismutázy a isocitrátdehydrogenáza (ICD), sú opísal ako autolýza markerov [22] - [24] a niektoré z nich boli ukázala byť vynikajúci diagnostické antigény. Napríklad ICD zo M. tuberkulóza
bol opísaný ako potenciálny antigén rozlišovať pacientov pľúcnej tuberkulózy od zdravých kontrol [24]. Avšak predchádzajúce porovnanie antigénne vzorov H. pylori
proteíny (vrátane niektorých z domácnosti proteínov) uznané sér pacientov neodhalilo žiadnu spojitosť konkrétnych H. pylori
antigény s prípadmi osobitného gastroduodenálnej patológiou [21].

Táto štúdia ukazuje interakciu imunitného systému hostiteľa s H. pylori
ICD vo forme významných humorálnu odpovede pozorované u pacientov ochorenia. Ďalej popíšeme H. pylori
ICD antigén rozlišovať vredovej choroby a gastritídy pacientov z neinfikovaných zdravých jedincov.

Výsledky

In silico modelovanie, expresie a čistenie H. pylori ICD proteínu

proteínová sekvencia ICD zo H. pylori
bola analyzovaná, aby sa predpovedať jeho imunogenecita na základe antigénne indexu, hydrofilnost a povrchové pravdepodobnosti. Obrázok 1A ukazuje v silikónového
antigénne profily MKN generované pomocou Protean softvéru (DNASTAR Inc. USA). Stručne povedané, bolo identifikovaných niekoľko stopy zodpovedajúce imunoreaktívnych motívy aminokyselín sa podľa očakávania vyššej antigénne indexy (~ 3.4). H. pylori
ICD teda zobrazí hlavné antigénne úseky (obrázok 1A) nás výzvou, aby sa na to pozerať ako putatively imunogenným proteínom. Antigenicity indexy ICD boli porovnateľné s predtým zaznamenali PPE antigénu Rv2430c mykobakteriálního pôvodu a, ktorý sa ďalej ukázalo, že je imunodominantní antigén [25]. E. coli
ICD bola tiež analyzovaná podobným spôsobom a zdalo sa byť putatively imunogénna; existuje jasný rozdiel zistený v porovnaní s H. pylori
ICD, s ohľadom na množstvo a postavenie antigénnych zvyškov. Neskôr sme skonštruovali homológnej model H. pylori
ICD založený na kryštálovej štruktúre E. coli
ICD (PDB kód 1AI2) a boli schopní vykresliť chrbticovej organizácia H. Pylori
(26695) ICD spolu s tým E. coli
. Bolo zistené, že dva ICD je významne podobná (RMS odchýlka 0,45), ale líšil, pokiaľ ide o 3 dôležité povrch vystavený slučkových oblastiach, ktoré môžu predstavovať oblastí štrukturálne rozdiely, ktoré zodpovedajú predpokladanej antigénne epitopy, prípadne odovzdávanie odozvy rozdiel protilátky (Obrázok 1B )

nadmerne exprimované N-koncová His-ICD sa čistí na teplotu gt;. 95% homogenita na niklová afinitnej kolóne (obrázok 2). Molekulová hmotnosť rekombinantného ICD bola stanovená na 47 kDa. čistenie proteínu sa uskutočňuje za natívnych podmienok s výťažkom 2,0 mg proteínu na 500 ml štartovacie kultúry.

Interakcia H. pylori ICD s ľudským imunitným systémom
imunitnej odozvy

Humorálna smeruje proti H. pylori
ICD boli porovnané u pacientov s H. pylori
infekcia (zápal žalúdka, NUD, DU a GC) a zdravých kontrol (obrázok 3). Dáta imunoreaktivity boli štatisticky analyzované a v porovnaní s väzbou na infikovaných aj zdravé séra. Tieto dáta ukázali, že séra všetkých infikovaných pacientov patriacich do žalúdka a dvanástnika vred (NU) kategórií vykonané štatisticky významný ( P Hotel &0,0001) proti hladiny protilátok ICD v porovnaní s tými zo zdravých kontrol. ICD proteín, ktorý má zrejme dôležitú metabolickú úlohu, bolo teda zistené, že je schopné vyvolať silnú humorálnu odpoveď u jedincov s gastritídou a DU. Avšak, v prípadoch neulcerózní dyspepsia (NUD) a rakoviny žalúdka (GC), znižuje humorálna odpoveď pozorovaná. Vzhľadom k tomu, tieto pozorovania, je pravdepodobné, že uvoľňovanie ICD proteínu je spojená s aktívnou, H. pylori
infekciu. Na rozdiel od pozorovanej humorálnych odpovedí, rekombinantné, H. pylori
ICD nevyvolal žiadne významné bunkovú imunitnú odpoveď, ako o tom svedčí z nedostatku sekrécie IL-8 z ľudských makrofágov indukovaných rekombinantným, H. pylori
ICD in vitro
(Obrázok 4). Preto, naznačujú, že ICD vzrušuje len humorálnej priestoru a nemusia prispievať k žalúdočnej patológiu alebo vyvolaných zmenami cytokínov v žalúdku fyziológiu.

Diskusia

Identifikácia a charakterizácia vysoko imunogenního H. pylori
proteíny je povinný požiadavka pre vývoj sérologických testov založených na rekombinantných čistených antigénov. V kombinácii s testom močoviny dychu, serology je neinvazívna metóda pre detekciu H. pylori
infekcie, a niekoľko sérologické testovacích súprav na základe mnohých rôznych H. Pylori
antigény sú komerčne dostupné. Aj keď humorálna imunitná odpoveď na H. pylori
sa zdá byť celkom premenná, kombinácia často uznávaných antigény by mohli byť užitočné pre diagnostické účely [21]. Metabolické enzýmy ako ICD sa zdajú byť vhodnými kandidátmi, ktoré majú byť využité pre sérologické vývoj testovacie súpravy hlavne preto, že nemajú skrížene reagujú so sérom od non-infikovaných alebo zdravých jedincov [24].

Význam veľa imunogénna proteíny H. pylori
vrátane niektorých metabolických enzýmov nebol ocenil veľa v klinických vzoriek v štúdii predchádzajúca proteomiky založené [21]. Naša štúdia však bola zameraná na vyhodnotenie čistený rekombinantný, H. pylori
ICD svojimi imunologickými vlastnosťami v rôznych triedach H. pylori
infikovaných pacientov s kyselinami peptických. Pokúsili sme sa systematicky skúmať prítomnosť a užitočnosť imunitných reakcií vyvolaných proteínu ICD vo H. pylori
infikovaných pacientov.

Naša analýza s použitím rekombinantnej ICD zo H. pylori
odhalila významne vysoké titre protilátok medzi vredovej choroby a gastritídy pacientov peptickým, v porovnaní s pacientmi s rakovinou a NUD (obrázok 3). Domnievame sa, že imunitná reakcia je vidieť na peptickým vredom prípadoch a gastritídy by snáď byť v dôsledku vysokého zaťaženia baktérií spojených s invazívnou patológie a tým aj väčším počtom autolyzovanom patogénov alebo patogény, ktoré predstavujú ICD na povrchu. To môže prípadne vysvetliť pomerne vysoký-protilátka reakciu u pacientov s invazívnymi kategórií.

H. pylori
antigény sú popísané byť prepustený do extracelulárneho priestoru pomocou rôznych mechanizmov, ako sú špecifické sekréciou dráh, autolýzy a tvorbu membránových vačkov [23] a povrchových vlastností H. pylori
bolo navrhnuté, že je jedinečný v umožnenie adsorbcie /povrchové lokalizácii týchto proteínov [26]. ICD sú tradične známe ako markery autolýzy [22], [24], [27], uvoľnených počas neskorej logaritmickej fáze. Extracelulárna uvoľňovanie bielkovín by mohlo byť potenciálne dochádza iba pri in vitro
rastu H. pylori
. Avšak, in vivo
existenciu takých mechanizmov, ak sa preukáže, by mali byť schopní vysvetliť úlohu rôznych sekretovaných proteínov v molekulárnej patológie vredovým ochorením. Vstup H. pylori
proteíny do žalúdka podslizničním priestoru môže mať významné funkčné dôsledky, ako je podpora prozápalových a chemotaktické odpovede prostredníctvom uvoľňovania cytokínov z aktivovaných makrofágov. Tiež extracelulárnej uvoľňovanie a alebo adsorpcie alebo povrchovej lokalizácia [26] potenciálne imunogénnych proteínov mohol podporiť bakteriálnu stratégiu na odvrátenie efektívnej lokálnej imunitnej odpovede [23]. Udržať tieto rozmanité mechanizmy na mysli, sme skontrolovali prozápalové potenciály ICD pomocou IL-8 ELISA. V našom pozorovaní, ICD nijako významne indukuje IL-8 sekréciu v diferencovaných, kultivovaných makrofágy. Avšak, pretože sme nemali analyzovať úlohu ICD ako pokiaľ ide o indukcii iných prozápalových cytokínov, ako je TNF-a a IL1-P, bude predčasné spravodlivo vylúčiť svoje aktivity v žalúdočnej zápalu.

Potom, čo je uvedené že H. pylori
ICD vyvoláva humorálnu odpoveď, sme skúmali základ imunitného špecifickosti tohto proteínu, čo sa prejavilo na základe modelovania štruktúry. Naše sekvenčné analýzy a molekulárnej modelovanie H. pylori stroje a E. coli
ICD neodhalilo so všetkými konštrukčnými prekrývania medzi týmito dvoma (obrázok 1); niekoľko oblastí štrukturálnej odlišnosti boli rozpoznané, ktoré pravdepodobne zodpovedajú predpokladaných antigénnych epitopov v H. pylori
ICD. Na rozdiel od problémov súvisiacich so štrukturálnym konzervácie alebo rozmanitosti, my predpokladáme, že vyššia reaktivitu H. pylori
ICD v porovnaní s ICD kyseliny (komensální) E. coli
s hostiteľským imunitným systémom in vivo
mohla byť spojená s 1) iný invazivitě H. pylori stroje a E. coli
2) rôzne veličiny bakteriálne záťaže, obrat a autolyzát 3) rôznych repertoár buniek prezentujúcich antigén (makrofágy oproti dendritických buniek) účastníkoch a ich relatívny výskyt 4) dostupnosti povrchových exponovaných epitopov v H. pylori
ICD (ako tie, uvedených na obrázku 1B), a 5) prítomnosť aktívnych lézií chronického zápalu sliznice, poškodenie a chemotaktické účinky druhej H. pylori
bielkoviny v prostredie
.

Aj keď s ohľadom na možnú skríženú reaktivitu z iných invazívnych baktérií, ako C. jejuni
sme testovali H. pylori
ICD proti 8 vzoriek C. jejuni
sera enteritis pacienta a zistil, že nijako významne skríženú reakciu (dáta nie sú uvedené). H. pylori
zadarmo stav našej C. jejuni
pozitívnych pacientov bola stanovená na základe neprítomnosti príznakov poruchy trávenia, bolesti žalúdka a pálenie záhy atď Avšak, pretože sme použili iba obmedzené vzorky sér od C. jejuni
pacienti, nie sme naklonení značke H. pylori
ICD ako samostatný diagnostického antigénu. Avšak, C. jejuni
nemusí obsahovať veľa konkurenčné pozadí ibaže C. jejuni
sami pacienti sú klinicky kolonizované H. pylori
alebo naopak.

Na záver sľubné výsledky sme získali z hľadiska významných humorálnych odpovedí na H. pylori
ICD nesmie vykladať ako okamžite použiteľné pre diagnózu úroveň terénu. Avšak je možné, že naše zistenia poskytujú solídny základ pre vývoj testu sero diagnostika pre H. pylori
spojené gastroduodenálnu patológiou. Navrhujeme potenciál tohto antigénu a jeho špecifické peptidy epitopu môže byť ďalej analyzovaný pomocou veľkej batérie vzoriek séra predstavujúcich rôznych predmetov ochorení. Podobne, stav a význam krížovo reagujúcich protilátok v sére, čo zodpovedá ochorení spôsobených baktériami, ako sú Salmonella spp., Shigella spp. a ďalšie invazívne enteropatogénov môže byť tiež stanovená. To bude stáť za to preskúmať do hĺbky zapojenia ICD vo signalizácia činnosti v podslizničním priestore, zvlášť jeho interakcie s aktivovanými makrofágy a lymfocyty. Tiež, vzhľadom na jeho významnú úlohu v cykle trikarboxylových kyselín a neprítomnosť glyoxylátu pracovného prúdu v H. pylori
[27], vyhodnotenie MKN ako možný cieľ intervenčné predstavuje vzrušujúce návrh.

Materiály a metódy

In silico antigenicity predikované H. pylori ICD (HP0023)

Nukleotidová sekvencia H. pylori ICD
(ORF HP0023) a zodpovedajúce aminokyselinová sekvencia bola získaná z Pylorigene databázy (http://genolist.pasteur.fr) a bol podrobený analýze DNASTAR balenie (DNASTAR Inc. Madison, USA). Aminokyselinová sekvencia ICD bol podrobený kontrole pre všetky antigénne determinanty s využitím Protean program v rámci balíka DNASTAR. Parametrov, ako je hydrofilitu, povrchové pravdepodobnosti a antigénne indexu boli vypočítané pre celú proteínu s použitím tohto softvéru. Antigénne indexy vykazujú viac ako 2 vrcholy pri > 3,0 škály boli považované za oveľa antigénne

Počítačové modelovanie štruktúry ICD

Použitie Modelár-6, program, molekulárnej modelovanie, ktorý implementuje automatizovaný prístup. porovnávacie modelovanie štruktúry proteínov podľa predchádzajúcich priestorových zadržiavacích systémov [28] bola použitá pre určenie trojrozmerného modelu H. pylori
ICD. ICD model H. pylori
bol vytvorený na základe E. coli
ICD šablóna 1A12 ktorá zdieľa celkový 68% sekvenčná identitu s H. pylori
ICD.

Produkcia rekombinantnej Helicobacter pylori ICD

ORF zodpovedajúce H. pylori ICD
(HP0023, 1,275kilobajt) bol amplifikovaný pomocou PCR z genómovej DNA H. pylori
pacient izolovať Ms8. Rekombinantný ICD proteín skončila vyjadrený v E. coli stroje a čistený do homogenity (viď obrázok 2), v súlade s metódami opísanými skôr Banerjee et al
[24]. Úroda purifikovaného proteínu bola štandardizovaná až 2,0 mg čisteného proteínu na 500 ml východiskovej kultúry rekombinantného E. coli
. Purifikovaný rekombinantný proteín bol dialyzovaný proti 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl a 3% glycerolu. Ďalej sa čistený proteín sa spracuje s polymixin B vylúčiť účinkami akejkoľvek kontaminácie LPS. Vyčistený rekombinantný ICD bol lyofilizovaný a ihneď skladované v hlboko zmrazenom pre následné použitie v klinickej diagnostike.

Pacienti a vzorky ľudských sér

študijnej populácie ( n
= 82), zložený 58 H. pylori
infikované vzorky pacientov (podrobnosti o počte prípadov analyzovaných v každej kategórii, pozri obrázok 3), získané z prípadov podávania správ predovšetkým na Deccan College of Medical Sciences a spojeneckých nemocniciach (DCMS), Hyderabad, a 24 klinicky zdravé darcov. Zdravé kontrolná skupina sa skladala z 18. osvedčené H. pylori
negatívne prípady testovaný s testom Močovina dychu (UBA) a 6 asymptomatických jedincov, ktorí boli potvrdené H. pylori
negatívne, ako je testovaná komerčne dostupného ELISA kitu (Pyloriset EIA-GIII, Orion, Espoo, Fínsko). Vo všetkých skupinách pacientov, diagnostika vredu alebo gastritídy bolo potvrdené, alebo vylúčené endoskopicky ošetrujúci gastroenterológ. Prítomnosť H. pylori
u chorých subjektov zahrnutých do tejto štúdie bola už predtým potvrdená Gramovho farbenia, rýchly ureáza test (RUT), 16S rRNA a CAG
Gen na báze PCR a kultúry [29]. Štúdia populácie nemal pohlavia alebo veku zaujatosť. Písomný informovaný súhlas bol získaný od všetkých pacientov a zdravých kontrol v príslušných centrách.

ELISA pre humorálnu odpovede

ELISA test bol vykonaný na kontrolu humorálna imunitná odpoveď u ľudí proti rekombinantným ICD. V stručnosti, 96-jamkové mikrotitračné doštičky boli potiahnuté ~ 500 ng rekombinantného ICD proteínu. Potiahnuté doštičky boli inkubované cez noc pri 4 ° C, trikrát premyté PBS-T (0,05% Tween 20 v 1 x PBS) a dvakrát PBS. Doštičky potom boli blokované 100 ul blokujúceho pufra (2% BSA v 1 x PBS) pri teplote 37 ° C po dobu 2 hodín. Doštičky boli premyté trikrát premývacím pufrom PBS-T a dvakrát PBS. H. pylori
-infected ľudská séra patriacich do rôznych klinických skupín boli sériovo zriedené (1:50, 1: 100, 1: 200 a 1: 400) v blokovacom pufri (1% BSA v PBS), pre získanie optimálnych titrov. Zriedeného séra [50 ul zriedeného séra 1: 200] bolo pridané do jamiek potiahnutých antigénom a inkubované po dobu 1 hodiny pri teplote 37 ° C. Platničky sa umyjú trikrát PBS-T a dvakrát PBS a ďalej inkubované s anti-ľudským IgG-chrenovej peroxidázy (Sigma) pri teplote 37 ° C po dobu 1 hodiny. aktivita peroxidázy z chrenu bola detekovaná za použitia chromogénneho látky, o
-phenylenediamine Tetrahydrochloride (Sigma) v citrátovom-fosfátového pufra (pH 5,4) a H _{2O 2 as 1 ul /ml. Reakcia bola zastavená pomocou 0,5 M H 2SO 4, a hodnoty absorbancie bola meraná pri 492 nm na ELISA čítačke (Bio-Rad). Každý test ELISA bol opakovaný aspoň dvakrát všetkých klinických izolátov sera. Študenta t
test bol vykonaný výpočet p
hodnoty založené na prostriedku titre séra protilátok zodpovedajúcich zdravých a infikovaných tried pomocou on-line vedeckú kalkulačku GraphPad (www.graphpad.com_quickcalcs_ttest1 .cfm). P
hodnoty menšie ako 0,05 boli považované za štatisticky významné.}

ELISA pre prozápalových cytokínov IL-8

THP-1 bunky (ľudská monocytární, ATCC TIB 202) boli pestované a udržiavané v RPMI 1640 (Invitrogen) doplnenom 10% fetálnym hovädzím sérom, 2 mM glutamínu a 1% anti-bakteriálne a anti-mykotickej roztoku (Gibco). Pre mikrofágům fáze, približne 1 x 10 ^{-6 buniek /jamka boli diferencované použitím 5 ng /ml forbol-12-myristát-acetát 13C (PMA, Sigma). Po 24 hodinách boli bunky raz premyté médiom RPMI 1640 a stimulované pomocou 10 ug /ml rekombinantného ICD. Prozápalový proteín, HP940, ze H. pylori
[30], sa čistí za rovnakých podmienok bola použitá ako pozitívna kontrola (1 ug /ml). Bunky boli inkubované po dobu 24 hodín vo zvlhčenej atmosfére pri 37 ° C. Bunky bez ošetrenia proteínu (nestimulované bunky) slúžili ako negatívna kontrola. Supernatant kultúry odobraté po 24 hodinách bola použitá pre stanovenie IL-8 za použitia komerčne dostupného ELISA kitu optEIA (BD Biosciences). Skúška bola vykonaná podľa pokynov výrobcu a hladiny cytokínov boli vypočítané s použitím rekombinantnej štandardu poskytnuté v súprave. Citlivosť IL-8 bola 3,1 pg /ml. Hodnoty boli vyjadrené ako priemer ± SD.}

Poďakovanie

Sme vďační Seyed E. Hasnain a Sharmistha Banerjee pre diskusiu. Ďakujeme našim spolupracovníkom CM Habibullah a Barika Sálih o pomoc na materiál pacienta a informácií. Poďakovanie patrí tiež kvôli Francis Megraud pre poskytovanie rôznych vzoriek kontrolné séra. NA je zodpovedajúca Fellow európskej Helicobacter Study Group (EHSG).

• Ploche ONE: Bakteriálna mikroflóry profilovanie v gastritídou bez infekcie Helicobacter pylori alebo nesteroidný protizápalový liek Use
• Ploche ONE: priradené Faktory atrofickú gastritídou diagnostikovaná Double-Contrast hornej časti tráviaceho Barium X-Ray röntgene: priečny rez štúdie analyzujúcej 6,901 zdravých jedincov v…