Plos ONE: Izocitrat dehidrogenaza Helicobacter pylori Morebitno povzroča humoralnega imunskega odziva pri osebah z peptičnega in gastritis

Povzetek

Ozadje

H. pylori
povzroča gastritis in peptične razjede in je dejavnik tveganja za razvoj raka želodca. Veliko beljakovin, kot so ureaze, porinov, flagelinov in toksinov, kot so lipo-polisaharidi so bile opredeljene kot možne virulentnih dejavnikov, ki sprožajo vnetnih reakcijo. Poročamo imunogenske potenciale Izocitrat dehidrogenaza (ICD), ki je pomemben za ohranjanje hiša proteina H. pylori
.

metodologija /glavnih ugotovitev

zaporedja amino kislin H. pylori
ICD bili podvrženi silico
analize regij s predvidljivo visoko antigenski indeksov. Tudi, računalniško modeliranje H. pylori
ICD, kot je dodan v E. coli
ICD je bila izvedena za določitev ravni strukturnih podobnosti in razpoložljivosti površinskih izpostavljena motivov, če sploh. ICD
gen klonirali, izražena in očistimo na zelo visoko homogenost. Humoralni odziv usmerjena proti H. pylori
ICD bila odkrita skozi encimsko-imunskim testom (ELISA), pri 82 ljudeh, ki vsebuje od 58 bolnikov z H. pylori PODJETJA
povezana gastritis ali razjeda bolezen in 24 asimptomatski zdravih kontrol. H. pylori
ICD vzbudil potencialno visoko humoralni imunski odziv in razkril visoke titre protiteles v serumu, ki ustrezajo endoskopsko potrjen gastritis in razjede predmete bolezni. Vendar urea-dih testne negativne vzorce zdrave nadzora in asimptomatski kontrolni vzorci niso razkrili nobenih zaznaven imunski odziv. ELISA za vnetnih citokinov IL-8 niso imele pomembnega vnetnih dejavnost ICD.

Sklepi /Pomen

ICD za H. pylori
je imunogen, ki komunicira z gostiteljskim imunskega sistema sledi morebitno avtolitičnega sproščanja in tako znatno izzove humoralni odzivi pri posameznikih z invazivno H. pylori
okužbe. Vendar ICD ne bi bistveno spodbuditi indukcijo IL8 v kultivirane celične linije makrofagov (THP1), zato ne sme biti znan vnetnih sredstvo

Navedba. Hussain MA, Naveed SA, Sechi LA, Ranjan S, ALVI A Ahmed I., et al. (2008) Izocitrat dehidrogenaza za Helicobacter pylori
potencialno povzroči humoralnega imunskega odziva pri osebah z peptičnega in gastritis. PLoS ONE 3 (1): e1481. doi: 10,1371 /journal.pone.0001481

Akademska Urednik: Keertan Dheda, University College London, Velika Britanija

Prejeto: 29. avgust, 2007; Sprejeto: 24. december 2007; Objavljeno: 23. januar 2008

Copyright: © 2008 Hussain et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

financiranja:. Financiranje iz CDFD Core Donacije (Oddelek za biotehnologijo, indijska vlada)

nasprotujočimi si interesi. avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Helicobacter pylori
je gram negativna, ukrivljeni bakterije, ki vzpostavlja kroničnih okužb v človeškem želodcu. Je pomemben patogen, da se domneva, da so sodelovali razvil z ljudmi [1], [2]. Naseljuje približno polovico svetovnega prebivalstva in se šteje kot potencialni dejavnik tveganja za razvoj adenokarcinoma želodca [3]. H. pylori
je priznan vzrok kroničnega gastritisa, peptični ulkus, karcinom želodca in-sluznica povezana limfatičnega tkiva (MALT) limfoma. Predlagani so bili številni mehanizmi, da pojasni svojo vlogo v patogenezi črevesju. Kljub visoki kolonizacija le majhen podmnožica okuženih ljudeh se pojavijo H. pylori
-associated bolezni [2]. Združenja H. pylori
z dejavniki specifične bolezni ostala bolj ali manj skrivnostna, čeprav so bili zaporedjem nukleotidov razvozlal pred skoraj desetimi leti [2].

Ena od najbolj značilnih lastnosti H. pylori
je genetska raznolikost med kliničnih izolatov, pridobljenih iz različnih populacijah bolnikov [3]. Preoblikovanje genoma je norma s to bakterijo, ki ustvarja s tem veliko alelov in variacije fazo [3], ki predstavljajo težave pri razvoju diagnostike in cepiv.

Ko pridobljena, okužba trajajo več let in, izvabi zaznaven imunski odziv na okuženih oseb [4], [5] značilna povečane ravni specifične IgG in IgA v serumu in bogatenja sekretorni IgA in IgM v želodcu [6]. Zato je bilo priporočeno in razviti za diagnozo H neinvaziven serološki testi. pylori
okužbe. Med njimi je encimski imunski test (ELISA) je eden od najbolj obširno uporabljajo metode, kot je relativno cenovno, hitra, enostavna za izvedbo, in lahko zlahka sprejeti za presejanje velikega števila vzorcev [7]. Raziskovanje za anti H. pylori
protitelesa pogosto predpisan pred endoskopijo ali pred začetkom zdravljenja. Čeprav zaradi imunološki spomin, serodiagnosis ni mogoče raje preveri uspeh ali izid zdravljenja za izkoreninjenje, ostaja izbira za občutljivo metodo, verjetno zato, ker svoje ne-invazivne vrste [8].

Trenutno je tam ni bilo nobenega single "zlati standard" antigen, ki se nedvoumno lahko uporablja za vse prebivalstvo. Eden od pomembnih razlogov za to je lahko izredno raznolikost prisotna v H. pylori
[9] - [13] in tudi njegova posebna prilagoditev na različnih gostiteljih [12], [13]. Čeprav so proteini, kot so katalaze, gro
EL in flagelin so močno imunogena, dajejo nespecifične navzkrižne reakcije z drugimi Gram-negativne bakterije, še posebej, Campylobacter jejuni
[14], [15]. V nasprotju s tem, virulence povezani antigeni kot CagA ali VacA kažejo precej visoko stopnjo sekvenčne variabilnosti, saj obstaja H. pylori
sevi, ki so genetsko raznolike in fenotipsko spremenljivka za eno ali obe antigenov [16] - [18]. Kljub temu, so bile opisane zadovoljive zveze med serumskih protiteles in invazivni bolezni [19].

Gospodinjstvo geni H. pylori
so bili uporabljeni v zadnjem času, da bi spremljali migracije prebivalstva in ugotovljeno je bilo, da je stabilna v genomu čez stoletja [20]. Gospodinjstvo proteini pa niso bili testirani na splošno za njihovo uporabo v diagnostiki in cepiv. Presnovni encimi zdi, da je dober kandidat za vključitev v kompletu z imunskimi diagnostiko, saj pogosto ne reagira navzkrižno s serumom zdravih kontrol [21]. Prav zaradi svoje gospodinjstvo funkcijo, so zelo ohranjena med različnimi H. pylori
sevi, ne glede na njihove genotipov in zato lahko služi kot idealno imuno-diagnostične kandidatov.

Proteini, ki se sproščajo iz bakterij v pozni logaritemski fazi rasti, kot so superoksid dismutazo in Izocitrat dehidrogenaza (ICD), so opisan kot avtolize označevalcev [22] - [24] in nekateri od njih so se izkazali za odlične diagnostične antigeni. Na primer, ICD za M. tuberkuloza
je bil opisan kot potencialno antigen, da razlikuje bolnikov pljučno tuberkulozo iz zdravih kontrol [24]. Vendar predhodni primerjave antigenskih vzorcev H. pylori
proteini (vključno z nekaterimi od oskrbniška proteinov), ki jih bolnik serumov priznane pokazala nobene povezave posebnega H. pylori
antigeni s primeri zlasti želodca patologije [21].

Ta študija kaže interakcijo gostiteljskega imunskega sistema s H. pylori
ICD v obliki pomembnih humornega odgovorov pri osebah bolezni. Poleg tega smo opisali H. pylori
ICD antigen za razlikovanje bolnikov razjeda bolezni in gastritis od neokuženih zdravih posameznikih.

Rezultati

V silicij modeliranje, izražanja in čiščenja H. pylori ICD beljakovin

protein zaporedje ICD za H. pylori
smo analizirali napovedati njegovo imunogenost, ki temelji na antigensko indeks, hidrofilnost in površinsko verjetnosti. Slika 1A kaže v silicij
antigenskih profilov ICD pridobivajo s pomočjo Protean programske opreme (DNAStar Inc. ZDA). Na kratko, je bilo ugotovljenih nekaj sledi, ki ustrezajo imunoreaktivna motive aminokislin s predvidljivo višjih antigenske indeksov (~3.4). H. pylori
ICD tako prikaže glavne antigenske odsekih (slika 1A) nas poziva, da pogled na to kot domnevno imunogenega proteina. Indeksi antigenosti MKB so bile primerljive s tistimi, o katerih so poročali za PPE antigena Rv2430c mikobakterijskih izvora, ki se je še izkazalo, da je imunodominanten antigen [25]. E. coli
ICD smo analizirali tudi na podoben način, in je zdelo, da se domnevno imunogeno; je bilo jasno ugotovljena razlika v primerjavi s H. pylori
ICD, glede na številčnost in položaj antigenskih ostankov. Kasneje smo zgradili model homologijo v H. pylori
ICD, ki temelji na kristalni strukturi E. coli
ICD (code PPP 1AI2) in so bili sposobni prikazati hrbtenično organizacijo H. Pylori
(26.695) ICD, skupaj s tisto E. coli
. Dva ICD bilo ugotovljeno, da je precej podobna (RMS odklon 0,45) ni razlikovala glede na 3 pomembne površinske izpostavljenih regij zanke, ki lahko predstavljajo področja strukturnih razlik, ki ustrezajo domnevno antigenske epitope, morda vsiljene odgovore razlika protiteles (slika 1B )

pretirano izražena N-terminalno His-označenega ICD smo očistili s >. 95% homogenosti v koloni niklja afinitetno (slika 2). Molekulska masa rekombinantnega ICD Ugotovljeno je bilo 47 kDa. Čiščenje Protein je bila izvedena pod nativnih pogojih z donosom 2,0 mg beljakovin na 500 ml start kulture.

Interakcija H. pylori MKB na imunski sistem človeka

imunskem odzivu usmerjena proti H. pylori
ICD smo primerjali med bolniki z H. pylori
okužbe (gastritis, NUD, DU in GC) in zdravih kontrol (slika 3). Podatki o radioinkorporacijo smo statistično analizirali in primerjali z navezavo na tako okužene in zdrave serumih. Ti podatki kažejo, da serum vseh okuženih bolnikov, ki pripadajo gastritis in dvanajstnika (DU) kategorije izvajajo statistično značilna ( P
< 0,0001) anti ICD raven protiteles v primerjavi s tistimi iz zdravih kontrol. ICD protein, ki ima očitno pomembno presnovno vlogo, je bilo tako ugotovljeno, da lahko izzove močan humoralni odziv pri bolnikih z gastritisom in DU. Vendar pa je v primerih, ki niso razjede dispepsijo (NUD) in raka želodca (GC), se je zmanjšal humoralni odziv videl. Glede na te ugotovitve, je verjetno, da je sproščanje ICD beljakovin povezana z aktivno, H. pylori
okužbe. V nasprotju z opazovanih humoralni odzivi, rekombinantni H. pylori
ICD ni povzročil nobenih pomembnih celični imunski odziv, kot je razvidno iz pomanjkanja izločanja IL-8 iz človeških makrofagov inducirane z rekombinantno, H. pylori
ICD in vitro
(slika 4). Zato, predlagamo, da ICD vznemirja le humoralno predel in ne smejo prispevati k želodca patologije ali citokinov induciranih sprememb želodca fiziologije.

Pogovor

Identifikacija in karakterizacija visoko imunogenega H. pylori
beljakovine je obvezen pogoj za razvoj seroloških testov, ki temeljijo na rekombinantnih očiščenih antigenov. V kombinaciji z dihalni test s sečnino, serologija je neinvaziven pristop za odkrivanje H. pylori
okužbam, in več seroloških za testiranje, ki temelji na številnih različnih H. pylori
antigeni so na voljo na tržišču. Čeprav humoralnega imunskega odziva na H. pylori
zdi, da je zelo spremenljiva, lahko kombinacije pogosto priznanih antigenov koristna za diagnostične namene [21]. Presnovni encimi, kot so ICD zdi, da so dobri kandidati, ki se izkoristi za serološko razvoj preskusnega kompleta predvsem zato, ker ne reagira navzkrižno s serumi, ki niso okuženi ali zdravih posameznikov [24].

Pomen mnogih imunogenske beljakovine H. pylori
tudi nekatere presnovne encime niso cenili veliko kliničnih vzorcih v študiji prejšnjih proteinomiko temelji [21]. Vendar pa je bila naša raziskava usmerjena na oceni očiščen rekombinantni, H. pylori
ICD za svoje imunološke lastnosti v različnih razredih H. pylori PODJETJA
bolnikih, okuženih kisline peptični. Poskusili smo sistematično preučiti prisotnost in uporabnost imunskih odzivov beljakovine ICD v H dosežen. pylori PODJETJA
okuženih bolnikov.

Naša analiza s pomočjo rekombinantne ICD s H. pylori PODJETJA
pokazala precej visoke titre protiteles med bolniki peptičnega in gastritis, v primerjavi z NUD in bolnikih z rakom (slika 3). Smo domnevajo, da bi lahko imunski odziv opažen pri peptične razjede primerih in gastritisa morda zaradi visoke obremenitve bakterij, povezanih z invazivno patologijo in s tem večjega števila razpadajočih patogenov ali patogenov predstavljajo ICD na površini. To morda pojasni razmeroma visoko-protitelo odziv pri bolnikih invazivnih kategorije.

H. pylori
antigeni so opisane, da se sprosti v zunajcelični prostor preko več mehanizmov, kot so posebne izločanja poti, avtolize in tvorbe membranskih veziklov [23] in površinskih lastnosti H. pylori
so predlagali, da je edinstvena omogoča adsorpcija /površinsko lokalizacijo takšnih beljakovin [26]. ICD so tradicionalno znani kot označevalce avtolize [22] [24] [27], ki se sprošča med pozni logaritemski fazi. Zunajcelične sproščanje beljakovin bi lahko bilo pojavljajo le v in vitro
rasti H. pylori
. Vendar pa je in vivo
obstoj takšnih mehanizmov, če je dokazano, morda lahko pojasni vlogo različnih izločajo proteine ​​v molekularni patologiji ulkusne bolezni. Vstop H. pylori
beljakovine v želodčni Submukozno prostor ima lahko pomembne funkcionalne posledice, kot so spodbujanje vnetnih in kemotaktične odzivov prek sproščanja citokinov iz aktiviranih makrofagov. Prav tako bi lahko zunajcelični sproščanje in ali adsorpcija ali površinsko lokalizacija [26] potencialno imunogenske proteine ​​podporo bakterijsko strategijo za preusmeritev učinkovitega lokalnega imunskega odziva [23]. Ohranjanje teh več mehanizmov v mislih, smo preverili provnetne potenciale MKB s pomočjo IL-8 ELISA. V našem opazovanju, ICD ni bistveno inducira IL-8 izločanje v diferenciranih, gojenih makrofagov. Ker pa nismo analizirali vlogo ICD kot glede indukcije drugih vnetnih citokinov, kot so TNF-a in IL1-ß, bo še prezgodaj za upravičeno izključil svojo vpletenost v vnetje želodca.

Ker je prikazano ki H. pylori
ICD izzove humoralni odziv, smo raziskovali osnovo imunskega specifičnosti tega proteina, kar je razvidno iz strukture modeliranja, ki temelji. Naša zaporedje analiz in molekularno modeliranje H. pylori
in E. coli
ICD ni razkrila strukturne prekrivanja med njima (slika 1); več regij strukturnih razlikami bilo zaznati, ki lahko ustrezajo domnevno antigenske epitope v H. pylori
ICD. Poleg vprašanj, povezanih s strukturnimi ohranjanje in raznolikosti, smo hipotezo, da večja reaktivnost H. pylori
ICD v primerjavi z ICD od (komenzalne) E. coli
z gostiteljico imunski sistem in vivo
bi jih lahko povezovali z 1) razlikuje invazivnosti H. pylori
in E. coli
2) različne magnitude bakterijske obremenitve, prometa in avtolize 3) drugačen repertoar antigen predstavljajoče celice (makrofagi primerjavi dendritične celice) ter v svojem relativno obilje 4) razpoložljivosti površinskih izpostavljenih epitopov v H. pylori
ICD (kot tisti, označenih na sliki 1B) in 5) prisotnost aktivnih lezij kroničnega vnetja, poškodbe sluznice in kemotaktične učinkov drugih H. pylori
beljakovine v okolju ohranjali
.

Ob upoštevanju možne navzkrižne reaktivnosti drugih invazivnih bakterij, kot so C. jejuni
, smo testirali H. pylori
ICD pred 8 vzorcev C. jejuni
črevesja pacientov serum in ugotovili, da to ni bistveno navzkrižno reagirajo (podatki niso prikazani). H. pylori free stanje našega C. jejuni
pozitivnih bolnikih je bila določena na podlagi odsotnosti simptomov prebavne motnje, bolečine v želodcu in zgago itd Vendar, ker smo uporabili le omejeno število vzorcev sera iz C. jejuni
bolniki, nismo naklonjeni znamko H. pylori
ICD kot samostojni diagnostični antigena. Kljub temu, C. jejuni
morda ne bo vedno vsebujejo veliko konkurenčno ozadje razen če je drugače C. jejuni
bolniki sami klinično kolonizirali H. pylori
ali obratno.

Na koncu obetavne rezultate smo dobili v smislu pomembnih humornega odzivov na H. pylori
ICD, se ne sme razumeti kot neposredno uporablja na terenu, diagnozo. Kljub temu, da je možno, da naše ugotovitve zagotoviti trdne temelje za razvoj serološko diagnostiko test za H. pylori PODJETJA
povezana želodcu in patologije. Priporočamo, da potencial tega antigena in njegovih epitop posebnih peptidov lahko nadalje analizirali z veliko baterijo sera vzorcev, ki predstavljajo različne predmete bolezni. Podobno, status in pomen navzkrižne reakcije s protitelesi v serumu, ki ustreza bolezni, ki jih povzročajo bakterije, kot so Salmonella spp., Shigella spp. in drugih invazivnih enteropatogenov lahko določi tudi. To bo vredno raziskati poglobljeno sodelovanje ICD v signalizacijo dejavnosti v prostoru Submukozno, posebej njegova interakcija z aktiviranih makrofagov in limfocitov. Poleg tega, glede na njeno pomembno vlogo pri kroženju trikarboksilne kisline in odsotnost glioksilat drenaže v H. pylori
[27], vrednotenje ICD kot možni interventni cilja predstavlja zanimiv predlog.

Materiali in metode

V silicij antigenosti predvidene H. pylori ICD (HP0023)

nukleotidnega zaporedja H. pylori ICD
(ORF HP0023) in zaporedje ustrezna amino kislin je bila pridobljena iz Pylorigene baze podatkov (http://genolist.pasteur.fr) in smo analizirali s DNAStar paket (DNAStar Inc. Madison, ZDA). Aminokislinska sekvenca od ICD podvrgli pregledom za vse antigenske determinante z uporabo Protean program v paketu DNAStar. Parametri, kot so hidrofilnost, površinsko verjetnosti in antigensko indeksa so bili izračunani za celotno proteina z uporabo te programske opreme. Antigenske indeksi, ki kažejo več kot 2 vrhove pri > 3.0 lestvice so se šteli za bistveno bolj antigenski

Računalniško modeliranje ICD strukture

S modelar-6, program molekularno modeliranje, ki izvaja avtomatiziran pristop. primerjalne modeliranje protein strukture, ki ga zahtevajo prostorskih nasloni [28] je bila uporabljena za določitev tridimenzionalne model H. pylori
ICD. Model ICD za H. pylori
je nastalo na podlagi E. coli
ICD predlogo 1A12, ki se strinja s splošno 68% sekvence z H. pylori
ICD.

Izdelava rekombinantni H. pylori ICD

ORF ustreza H. pylori ICD
(HP0023, 1,275 kb) smo pomnožili s PCR iz genomske DNK z H. pylori
bolnika izolirati Ms8. Rekombinantni ICD protein je bil nad izražen v E. coli
in očistimo do homogenosti (slika 2) v skladu z metodami, ki jih Banerjee prej opisanih sod
[24]. Pridelek očiščenega proteina standardizirana do 2,0 mg očiščenega proteina na 500 ml naprej kulture rekombinantnega E. coli
. Očiščen rekombinantni protein dializiramo proti 20 mM Tris HCI, pH 7,5 z 100 mM NaCl in 3% glicerola. Nadalje je bil očiščen protein obdelamo z polimiksina B izključiti učinkov kontaminacije LPS. Očiščen rekombinantni ICD liofiliziramo in takoj shranjeni zamrznjeni za nadaljnje uporabe v klinični diagnostiki.

Bolniki in vzorci človeškega seruma

Študija populacija ( n
= 82) sestavlja 58 H. pylori PODJETJA
okuženih vzorcev pacientov (za podrobnosti o številu analiziranih primerih v vsaki kategoriji, glej sliko 3), pridobljene iz primerov, ki poročajo predvsem Deccan College of Medical Sciences in zavezniške bolnišnice, (DCMS), Hyderabad, in 24 klinično zdrave donatorji. zdravo kontrolno skupino so sestavljali 18. dokazano H. pylori
negativni primeri testirali z Urea Breath Vsebnost (UBA) in 6 asimptomatskih posameznikov, ki so bili potrjeni H. pylori
negativni testiral na voljo na tržišču kompletom ELISA (Pyloriset EIA-GIII, Orion, Espoo, Finska). V vseh skupinah bolnikov, je bila diagnoza razjede ali gastritis potrdi ali ovrže endoskopijo lečeči gastroenterolog. Prisotnost H. pylori
pri obolelih oseb, vključenih v tej študiji je bila predhodno potrjena s barvanjem gram je, test hitre ureaze (RUT), 16S rRNA in OAS
gen PCRs in kulture [29], ki temeljijo. Populacija študija ni imela spolni ali starostni pristranskosti. Pisnih obvestil soglasja so bili pridobljeni iz vseh bolnikih in zdravih kontrol na posameznih centrih.

ELISA za humoralno delovanje

ELISA test je bil izveden za preverjanje humoralni imunski odziv pri ljudeh proti rekombinantni ICD. Na kratko, so 96-ter mikrotitrske plošče, premazane z ~500 ng rekombinantnega ICD proteina. Prevlečeni Plošče smo inkubirali preko noči pri 4 ° C, speremo trikrat s PBS-T (0,05% Tween 20 v 1 x PBS) in dvakrat s PBS. Plošče smo nato blokirali s 100 ul pufra za blokiranje (2% BSA v PBS 1 x), pri 37 ° C 2 uri. Plošče smo sprali trikrat z pranje varovalnega PBS-T in dvakrat s PBS. H. pylori
okuženimi človek sera iz različnih kliničnih skupinah so bile serijsko razredčene (01:50, 1:100, 1:200 in 1:400) v pufru (1% BSA v PBS) blokiranje, da dobimo optimalne titre. Razredčili serumi [50 xl 1:200 razredčene serume] dodamo k antigen obloženih vdolbinic in inkubiramo 1 uro pri 37 ° C. Plošče smo trikrat s PBS-T in dvakrat speremo s PBS in nadalje inkubiramo z anti-humanega IgG hrenovo peroksidazo (Sigma) pri 37 ° C 1 uro. aktivnost hrenove peroksidaze bila odkrita s pomočjo kromogenega snov, O
-phenylenediamine tetrahidroklorid (Sigma) v citratnem-fosfat pufru (pH 5,4) in H _{2O 2 kot 1 ml /ml. Reakcije so prenehali z 0,5 M H 2SO 4, vrednosti absorbance smo izmerili pri 492 nm v ELISA čitalniku (Bio-Rad). Vsak ELISA je ponoviti vsaj dvakrat z vsemi kliničnimi sera izolatov. Študent je t
preskus je bil opravljen izračun p
vrednosti, ki temeljijo na sredstvih titri seruma protiteles, ki ustrezajo zdravih in okuženih razredov s pomočjo spletnega kalkulatorja v GraphPad (www.graphpad.com_quickcalcs_ttest1 .cfm). P
vrednosti manj kot 0,05, so bile obravnavane statistično značilne.}

ELISA za vnetnih citokinov IL-8

THP-1 celice (človeških monocitov, ATCC TIB 202) gojimo in vzdrževane v RPMI 1640 (Invitrogen), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma, 2mM glutamina in 1% anti-bakterijsko in anti-mikotično raztopine (Gibco). Za makrofaga kot fazi, približno 1 × 10 ^{-6 celic /dobro so bile diferencirane z 5 ng /ml forbol-12 miristat 13C acetat (PMA, Sigma). Po 24 urah smo celice enkrat izperemo z RPMI 1640 medija in spodbujena uporaba 10 mg /ml rekombinantnega ICD. Vnetnih protein, HP940, z H. pylori
[30] očistili pod podobnimi pogoji uporabimo kot pozitivno kontrolo (1 jug /ml). Celice inkubiramo 24 ur v navlaženi atmosferi pri 37 ° C. Celice brez zdravljenja beljakovin (nestimuliranih celice) je služila kot negativno kontrolo. Kultura supernatant zbrali, potem ko je 24 ur, ki se uporablja za oceno IL-8 z uporabo komercialno dostopno optEIA ELISA Kit (BD Biosciences). Test je bil izveden v skladu z navodili proizvajalca in ravni citokinov so bile izračunane s pomočjo rekombinantne standarda predvideno v kompletu. Občutljivost IL-8 je 3,1 pg /ml. Vrednosti so izražene kot povprečje ± SD.}

Priznanja

Mi smo hvaležni, da Seyed E. Hasnain in Sharmistha Banerjee za razprave. Zahvaljujemo se našim sodelavcem CM Habibullah in Barik Salih za pomoč pri materialu pacientov in informacij. Zahvala velja tudi za Franca Megraud za zagotavljanje različnih vzorcev nadzor sera. NA je Pripadajoče sodelavec Evropske Helicobacter študijske skupine (EHSG).

• Plos ONE: Bakterijski Mikrobiota profiliranje v gastritis brez Helicobacter pylori okužbe ali nesteroidna protivnetna zdravila Use
• Plos ONE: Associated Dejavniki atrofični gastritis, ki ga Double-Contrast zgornjega dela prebavil barijev X-Ray Radiografija Diagnoza: presek študije, ki analizira 6,901 zdravih osebah v Japan