PLoS ONE: isocitraatdehydrogenase van Helicobacter pylori Potentieel induceert humorale immuunrespons bij patiënten met een maagzweer en Gastritis

De abstracte

Achtergrond

H.
pylori veroorzaakt gastritis en maagzweren en is een risicofactor voor de ontwikkeling van maagcarcinoom. Veel eiwitten zoals urease, porinen, flagellins en toxinen zoals lipo- polysacchariden zijn geïdentificeerd als potentiële virulentiefactoren die ontstekingsreactie veroorzaken. Wij rapporteren immunogeen potentieel van isocitraatdehydrogenase (ICD), een belangrijke huis houden eiwit van H. pylori
.

Methodologie /voornaamste bevindingen

aminozuursequenties van H. pylori
ICD werden onderworpen aan in silico
analyse voor regio's met een voorspelbaar hoge antigene indexen. Ook, computationeel modelleren van de H. pylori
ICD als naast elkaar aan de E. coli
ICD werd uitgevoerd om het niveau van gelijkenis structuur en de aanwezigheid van blootgestelde oppervlak motieven te bepalen, indien aanwezig. icd
gen werd gekloneerd, tot expressie gebracht en gezuiverd tot een zeer hoge homogeniteit. Humorale respons gericht tegen H. pylori
ICD gedetecteerd door een enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) in 82 proefpersonen bestaande uit 58 patiënten met H. pylori
geassocieerde gastritis of een ulcus ziekte en 24 asymptomatische gezonde controles. De H. pylori
ICD opgewekt potentieel hoge humorale immuunrespons en onthulde hoge antilichaamtiters in sera die overeenkomt met endoscopisch bevestigde gastritis en ulcera onderwerpen. Echter, ureum adem test negatief gezonde controlemonsters en asymptomatisch controlemonsters leverde geen detecteerbare immuunrespons te onthullen. De ELISA voor pro-inflammatoire cytokine IL-8 leverde geen significante pro-inflammatoire activiteit van ICD vertonen.

Conclusies /Belang

ICD van H.
pylori is een immunogeen dat samenwerkt met de gastheer immuunsysteem na een eventuele autolytische-afgifte significant en daarmee lokt humorale responsen bij patiënten met invasieve H. pylori
infectie. Echter, kon ICD niet significant stimuleren IL8 inductie in een gekweekte macrofaag cellijn (THP1) en daarom mag geen noemenswaardige pro-inflammatoire agent

Visum:. Hussain MA, Naveed SA, Sechi LA, Ranjan S, Alvi A, Ahmed I, et al. (2008) isocitraatdehydrogenase van Helicobacter pylori
Potentieel induceert humorale immuunrespons bij patiënten met een maagzweer en gastritis. PLoS ONE 3 (1): e1481. doi: 10.1371 /journal.pone.0001481

Academic Editor: Keertan Dheda, University College London, United Kingdom

Ontvangen: 29 augustus 2007; Aanvaard: 24 december 2007; Gepubliceerd: 23 januari 2008

Copyright: © 2008 Hussain et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Financiering vanaf CDFD Core Subsidies (Dept. of Biotechnology, de regering van India)

Competing belangen. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Helicobacter pylori
is een Gram-negatieve, gebogen bacterie die chronische infecties in menselijke maag vestigt. Het is een belangrijke pathogeen die wordt verondersteld te zijn geëvolueerd samen met de mens [1], [2]. Het leeft ongeveer de helft van de wereldbevolking en wordt beschouwd als een mogelijke risicofactor voor het ontwikkelen van maagdarmkanker [3]. H.
pylori is een erkende oorzaak van chronische gastritis, maagzweren, maagcarcinoom, en mucosa-geassocieerde lymfeweefsel (MALT) lymfomen. Verschillende mechanismen zijn voorgesteld om de rol in de pathogenese van de darm verklaren. Ondanks de hoge kolonisatie tarieven slechts een klein deel van de besmette mensen ervaren H. pylori
geassocieerde ziekten [2]. Verenigingen van H. pylori hotels met de ziekte-specifieke factoren zijn min of meer raadselachtige hoewel de genoomsequenties bijna een decennium geleden werden ontcijferd bleef [2].

Een van de meest onderscheidende kenmerken van H. pylori
is de genetische diversiteit tussen klinische isolaten verkregen uit verschillende populaties patiënten [3]. Herschikking van het genoom is de norm met deze bacterie, waardoor zodoende veel allelen en fasevariatie [3] stellen problemen bij de ontwikkeling van diagnostica en vaccins.

Het verworven, infectie jaren blijft bestaan ​​en, wekt detecteerbare immuunrespons op geïnfecteerde personen [4], [5] gekenmerkt door verhoogde niveaus van specifiek IgG en IgA in het serum en vergroting van secretorische IgA en IgM in de maag [6]. Daarom werden noninvasive serologische testen aanbevolen en ontwikkeld voor de diagnose van H. pylori
infectie. Van deze, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is een van de meest uitgebreid gebruikte werkwijze is relatief betaalbaar, snel, eenvoudig uit te voeren, en kan gemakkelijk voor het screenen groot aantal monsters genomen [7]. Het verkennen voor anti H. pylori
antilichamen wordt vaak voorgeschreven voor endoscopie of vóór aanvang van de behandeling. Maar als gevolg van het immunologisch geheugen, mogen serodiagnose niet de voorkeur om het succes of het resultaat van de uitroeiing van de behandeling te controleren, het blijft een keuze als een gevoelige methode waarschijnlijk als gevolg van de niet-invasieve karakter [8].

Momenteel is er heeft geen enkele 'gouden standaard' antigen, die ondubbelzinnig in alle bevolkingsgroepen kunnen worden gebruikt geweest. Een van de belangrijkste redenen hiervoor kunnen de buitengewone diversiteitsgehalte H zijn. pylori
[9] - [13] alsook de specifieke afstemming op verschillende gastheren [12], [13]. Hoewel eiwitten zoals catalase, gro
EL en flagellin sterk immunogeen, geven ze niet-specifieke kruisreacties met andere Gram-negatieve bacteriën en, meer in het bijzonder Campylobacter jejuni
[14], [15]. Daarentegen virulentie gekoppelde antigenen zoals CagA of VacA, vertonen een vrij hoge mate van sequentie variabiliteit, aangezien er H.
pylori stammen die genetisch diverse en fenotypisch variabele een of beide antigenen [16] zijn - [18]. Ondanks dit, bevredigend associaties tussen serum antilichamen en invasieve ziekte is beschreven [19].

Housekeeping genen van H. pylori
onlangs gebruikt om bevolkingsmigratie volgen en bleken stabiel in het genoom door de eeuwen heen [20]. Huishoudelijke dienst eiwitten echter, zijn niet getest in grote lijnen voor het gebruik ervan in de diagnostiek of vaccins. De metabolische enzymen lijken een goede kandidaat om te worden opgenomen in een immuno-diagnostische test kit, omdat ze vaak niet kruisreageren met sera van gezonde controlepersonen [21]. Ook vanwege het huishouden functie, ze zijn sterk geconserveerd onder verschillende H.
pylori stammen ongeacht hun genotypen en dus ideaal als immuno-diagnostiek kandidaten dienen.

Eiwitten die vrijkomen uit bacteriën in de late logaritmische groeifase, zoals superoxide dismutase en isocitraat dehydrogenase (ICD), zijn genaamd autolyse merkers [22] - [24] en sommige hebben bewezen uitstekend diagnostische antigenen. Bijvoorbeeld, ICD van M. tuberculose
is beschreven als een potentieel antigeen longtuberculose patiënten onderscheiden van gezonde controles [24]. Echter, vorige vergelijkingen van de antigene patronen van de H. pylori
eiwitten (waaronder enkele van de huishouding eiwitten) herkend door patiënt sera toonde geen associatie van specifieke H. pylori
antigenen met gevallen van bijzondere gastroduodenale pathologie [21].

Deze studie toont aan interactie van de gastheer immuunsysteem met H. pylori
ICD in de vorm van aanzienlijke humorale respons bij de ziekte onderwerpen. Verder beschrijven we H. pylori
ICD-antigeen te onderscheiden ulcera en gastritis patiënten uit niet-geïnfecteerde gezonde individuen.

Resultaten

In silico modellering, expressie en zuivering van H. pylori ICD eiwit

eiwitsequentie van ICD van H.
pylori werd onderzocht wat de immunogeniciteit basis van antigene index, hydrofiliteit en oppervlakte waarschijnlijkheid te voorspellen. Figuur 1A toont in silico
antigene profielen van ICD gegenereerd met behulp van Protean software (DNAStar Inc. USA). In het kort, een aantal sporen die overeenkomt met aminozuur motieven immunoreactief met voorspelbaar hogere antigene indices (~3.4) werden geïdentificeerd. De H. pylori
ICD dus weergegeven belangrijke antigene stukken (Figuur 1A) gevraagd ons om te kijken naar het als een vermeend immunogeen eiwit. De antigeniciteit van ICD indices waren vergelijkbaar met die eerder gerapporteerd voor een antigeen PPE Rv2430c van mycobacteriële oorsprong, dat verder werd bleek een immunodominante antigeen [25] zijn. De E. coli
ICD werd geanalyseerd op dezelfde wijze en bleek vermoedelijk immunogeen is; Er was een duidelijk verschil in vergelijking met H. pylori
ICD met betrekking tot de omvang en positie van antigene residuen. Later, gebouwd we een homologie model van de H. pylori
ICD op basis van de kristalstructuur van E. coli
ICD (PDB code 1AI2) en waren in staat om backbone organisatie van de H portretteren. Pylori
(26.695) ICD samen met dat van de E. coli
. De twee ICDs bleken significant vergelijkbaar zijn (RMS afwijking 0,45) maar verschilden met betrekking tot 3 belangrijke oppervlakte blootgestelde lus regio die waarschijnlijk de onderdelen structurele verschillen gevonden volgens de vermoedelijke antigene epitopen, eventueel verlenen differentieel antilichaamresponsen vormen zijn (Figuur 1B )

De overexpressie N-terminale His-getagde ICD werd gezuiverd gt van &;. 95% homogeniteit op een nikkel affiniteitskolom (figuur 2). De moleculaire massa van het recombinante ICD werd bepaald op 47 kDa. Eiwit zuivering werd uitgevoerd onder natuurlijke omstandigheden uitgevoerd met een rendement van 2,0 mg eiwit per 500 ml van start cultuur.

Interactie van H. pylori ICD met het menselijke immuunsysteem

humorale immuunreacties gericht tegen de H. pylori
ICD werden vergeleken bij patiënten met H.
pylori infectie (gastritis, NUD, DU en GC) en gezonde controles (figuur 3). De immunoreactiviteit gegevens werden statistisch geanalyseerd en vergeleken met verbinding naar zowel geïnfecteerde gezonde sera. Deze gegevens toonden aan dat sera van alle geïnfecteerde patiënten die tot gastritis en darmzweren (DU) Categorieën uitgevoerd statistisch significant ( P
< 0,0001) anti ICD antilichaam niveaus in vergelijking met die van gezonde controles. De ICD eiwit dat een schijnbaar belangrijke metabolische rol heeft aldus gevonden kunnen een sterke humorale respons bij patiënten met gastritis en DU wekken. Echter, in geval van niet-ulcus dyspepsie (NUD) en maagkanker (GC), werd gereduceerd humorale respons gezien. Gezien deze bevindingen is het waarschijnlijk dat de afgifte van ICD-eiwit is geassocieerd met actieve, H. pylori
infectie. In tegenstelling tot humorale responsen waargenomen, het recombinante, H. pylori
ICD leverde geen significante cellulaire immuunreacties te induceren, zoals blijkt uit het ontbreken van de secretie van IL-8 uit menselijke macrofagen geïnduceerd met recombinant, H. pylori
ICD In vitro
(figuur 4). Daarom suggereren dat ICD exciteert alleen de humorale compartiment en kunnen niet bij tot maagproblemen of cytokine geïnduceerde veranderingen in de maag fysiologie.

Discussie

Identificatie en karakterisatie van sterk immunogene H. pylori
eiwitten is een vereiste voor de ontwikkeling van serologische tests op basis van recombinante gezuiverde antigenen. In combinatie met de ureum ademtest, serologie is een niet-invasieve benadering op te sporen H. pylori
infectie, en een aantal serologische test kits gebaseerd op vele verschillende H.
pylori antigenen zijn in de handel verkrijgbaar. Hoewel de humorale immuunrespons H. pylori
lijkt heel variabel kan combinaties van vaak opgenomen antigenen nuttig zijn voor diagnostische doeleinden [21]. De metabolische enzymen zoals ICD lijken te zijn goede kandidaten om te worden ingezet voor de serologische test kit ontwikkeling vooral omdat ze niet kruisreageren met sera van niet-geïnfecteerde of gezonde individuen [24].

De betekenis van de vele immunogene eiwitten van H. pylori
waaronder enkele metabolische enzymen niet veel klinische monsters gewaardeerd in een eerdere proteomics gebaseerd onderzoek [21]. Ons onderzoek was echter betrekking op gezuiverde, recombinant, H evalueren. pylori
ICD voor zijn immunologische eigenschappen in verschillende klassen van de H. pylori
besmet zuur peptische patiënten met de ziekte. We hebben geprobeerd om systematisch te onderzoeken op de aanwezigheid en het nut van de immuunrespons opgewekt door de ICD-eiwit in H. pylori
geïnfecteerde patiënten.

Onze analyse met behulp van recombinant ICD van H. pylori
bleek significant hoge antilichaamtiters bij maagzweren en gastritis patiënten vergeleken met NUD en kankerpatiënten (figuur 3). We speculeren dat de immuunreactie waargenomen bij maagzweren en gastritis gevallen wellicht kan worden veroorzaakt door hoge belastingen bacteriën geassocieerd met invasieve pathologie en daardoor een groter aantal geautolyseerde pathogenen of ziekteverwekkers presenteren ICD op het oppervlak. Dit kan mogelijk de relatief hoge-antilichaam respons in invasieve categorie patiënten uit te leggen.

H.
pylori antigenen worden beschreven vrij in de extracellulaire ruimte via meerdere mechanismen zoals uitscheiding specifieke trajecten, autolyse, en de vorming van membraan vesicles [23] en de oppervlakte eigenschappen van H. pylori
zijn voorgesteld om unieke in het toestaan ​​van adsorptie /oppervlak lokalisatie van dergelijke eiwitten [26] zijn. ICD's zijn van oudsher bekend als markers van autolyse [22], [24], [27], die vrijkomen tijdens de late logaritmische fase. Het extracellulaire afgifte van proteïnen zou kunnen alleen die optreden tijdens de In vitro
groei van H. pylori
. Echter, In vivo
bestaan ​​van dergelijke mechanismen, als aangetoond zou kunnen de rol van verschillende uitgescheiden eiwitten in moleculaire pathologie van ulcera verklaren. De vermelding van de H. pylori
eiwitten in de maag submucosale ruimte kan belangrijke functionele consequenties zoals de bevordering van pro-inflammatoire en chemotactische effectiviteit gedurende afgifte van cytokinen uit geactiveerde macrofagen. Ook kan het extracellulaire vrijkomen en of adsorptie of oppervlak lokalisatie [26] van potentieel immunogene eiwitten een bacteriële te ondersteunen voor het afleiden van een effectieve lokale immuunrespons [23]. Houden van deze verschillende mechanismen in het achterhoofd, checkten we pro-inflammatoire potenties van ICD met behulp van een IL-8-ELISA-test. In onze waarneming, heeft ICD niet significant induceren IL-8 secretie in gedifferentieerde, gekweekte macrofagen. Aangezien er geen rol van ICD met betrekking tot inductie van andere pro-inflammatoire cytokines zoals TNF-α en IL1-β heeft geanalyseerd, zal het voortijdig rechtvaardig sluiten betrokkenheid bij maagontsteking zijn.

Nadat aangetoond dat H. pylori
ICD lokt een humorale respons, onderzochten we de basis van immunologische specificiteit van dit eiwit zoals weergegeven door structuur gebaseerde modellen. Onze reeks analyses en moleculaire modellering van de H. pylori Kopen en E. coli
ICDs niet alle structurele overlappingen voeg tussen de twee (figuur 1); verschillende gebieden van structurele verschillen werden waargenomen die mogelijk overeenkomen met de vermeende antigene epitopen in H. pylori
ICD. Afgezien van de problemen in verband met structurele behoud of de diversiteit, veronderstellen we dat een hogere reactiviteit van H. pylori
ICD in vergelijking met ICD van (commensale) E. coli hotels met immuunsysteem van de gastheer In vivo
geassocieerd kan worden met 1) verschillende invasieve karakter van de H. pylori Kopen en E. coli Pagina 2) verschillende grootten van bacteriële belasting, omzet en autolyse 3) verschillende repertoire van antigeen presenterende cellen (macrofagen versus dendritische cellen) die betrokken zijn en hun relatieve overvloed 4) beschikbaarheid van het oppervlak blootgestelde epitopen in H. pylori
ICD (als die aangegeven in figuur 1B), en 5) de aanwezigheid van actieve laesies van chronische ontsteking, mucosale beschadiging en chemotactische effecten van de andere H. pylori
eiwitten in de milieu
.

Tijdens de behandeling van mogelijke cross-reactiviteit van andere invasieve bacteriën, zoals C. jejuni
, testten we H. pylori
ICD tegen 8 monsters van C. jejuni
enteritis patiënt sera en vond dat het niet significant kruisreageren (gegevens niet getoond). De H. pylori
vrije status van onze C. jejuni
positieve patiënten werd bepaald op basis van de afwezigheid van symptomen van indigestie, maagpijn en zuurbranden etc. Echter, omdat we alleen gebruikt beperkte sera monsters uit C. jejuni
patiënten, we zijn niet geneigd om het merk H. pylori
ICD als een stand-alone diagnostisch antigeen. Niettemin, C. jejuni
niet altijd bestaan ​​uit een veel concurrerende achtergrond tenzij C. jejuni
patiënten zelf zijn klinisch gekoloniseerd door H. pylori golfreizen of vice-versa.

Tot slot, de veelbelovende resultaten die we in termen van belangrijke humorale reacties op H verkregen. pylori
ICD mag niet worden opgevat als onmiddellijk van toepassing op veldniveau diagnose. Desalniettemin is het mogelijk dat onze bevindingen vormen een sterke basis voor de ontwikkeling van een sero-diagnostische test voor H. pylori
bijbehorende gastroduodenal pathologieën. Wij stellen het potentieel van dit antigeen en epitoop specifieke peptiden kunnen verder worden geanalyseerd met behulp van een grote batterij van serummonsters die verschillende ziekten onderwerpen. Ook de status en betekenis van kruisreagerende antilichamen in sera gevonden volgens ziekten veroorzaakt door bacteriën zoals Salmonella spp., Shigella spp. en andere invasieve enteropathogenen kan worden bepaald. Het is de moeite waard te verkennen diepgaande betrokkenheid van ICD signalering activiteiten in de submucosale ruimte, speciaal de interactie met de geactiveerde macrofagen en lymfocyten. Ook, gezien zijn belangrijke rol bij de citroenzuurcyclus en de afwezigheid van glyoxylaat omleiding H. pylori
[27], de evaluatie van de ICD als een mogelijke interventie doelwit vormt een spannend voorstel.

Materialen en methoden

In silico antigeniciteit van voorspelde H. pylori ICD (HP0023)

nucleotidesequentie van H. pylori icd
(ORF HP0023) en de bijbehorende aminozuursequentie werd verkregen uit Pylorigene database (http://genolist.pasteur.fr) en werd onderworpen aan analyse door DNAStar pakket (DNAStar Inc. Madison, USA). Aminozuursequentie ICD werd tegen het licht gehouden voor antigene determinanten gebruikt Protean programma binnen het DNAStar pakket. Parameters zoals hydrofiliciteit, waarschijnlijkheid oppervlak en antigene index werd berekend voor het gehele eiwit met behulp van deze software. Antigene indices tonen van meer dan 2 pieken bij > 3,0 schalen werden als significant meer antigene beschouwd

Computational modelleren van ICD structuur

Met behulp van Modeller-6, een moleculaire modellering programma dat implementeert een geautomatiseerde aanpak. vergelijkende eiwitstructuur modellering door genoegen van ruimtelijke beperkingen [28] werd gebruikt voor het bepalen van de driedimensionale model van H. pylori
ICD. De ICD-model van H. pylori
werd gegenereerd op basis van de E. coli
ICD template 1A12 die de algehele 68% sequentie-identiteit met de H-aandelen. pylori
ICD.

De productie van recombinante H. pylori ICD

De ORF overeenkomt met H. pylori icd
(HP0023, 1,275 kb) werd geamplificeerd met PCR uit het genomische DNA van een H. pylori
patiënt te isoleren MS8. Het recombinante ICD-eiwit was meer dan uitgedrukt in E. coli Kopen en tot homogeniteit gezuiverd (figuur 2) volgens de eerder beschreven door Banerjee werkwijzen et al
[24]. De oogst van gezuiverde eiwit werd gestandaardiseerd tot 2,0 mg gezuiverd proteïne per 500 ml beginnend kweek van recombinante E. coli
. Het gezuiverde recombinante eiwit werd gedialyseerd tegen 20 mM Tris HCI, pH 7,5, met 100 mM NaCl en 3% glycerol. Verder werd het gezuiverde eiwit behandeld met polymyxine B uitsluiten van effecten van elke LPS besmetting. Het gezuiverde recombinant ICD werd gevriesdroogd en onmiddellijk bevroren bewaard voor downstream gebruik in klinische diagnose.

Patiënten en serummonsters menselijke

De onderzoekspopulatie ( n
= 82) bestond uit 58 H. pylori
geïnfecteerde patiënt monsters (voor meer informatie over het aantal gevallen in elke categorie geanalyseerd, zie figuur 3) verkregen van de gevallen rapportage vooral om de Deccan College van Medische Wetenschappen en Allied Ziekenhuizen, (DCMS), Hyderabad, en 24 klinisch gezond donors. De gezonde controlegroep bestond uit 18 bewezen H. pylori
negatief gevallen getest met Ureum Breath Assay (UBA) en 6 asymptomatische individuen die werden bevestigd H. pylori
negatief getest door in de handel verkrijgbare ELISA-kit (Pyloriset EIA-GIII, Orion, Espoo, Finland). In alle patiëntengroepen, diagnose van maagzweer of gastritis werd bevestigd of door endoscopie uitgesloten door de behandelend gastro-enteroloog. De aanwezigheid van H. pylori
in zieke patiënten opgenomen in deze studie werd eerder bevestigd door kleuring Gram's, een snelle urease-test (RUT), 16S rRNA en CAG Hotels A gen-gebaseerde PCR en cultuur [29]. De onderzoekspopulatie had geen geslacht of leeftijd vooringenomenheid. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten en gezonde controles op de respectievelijke centra.

ELISA voor humorale responsen

ELISA assay werd uitgevoerd om de humorale immuunrespons in mensen tegen recombinant ICD controleren. Kort samengevat, werden de 96-well microtiterplaten bekleed met -500 ng recombinant eiwit ICD. De beklede platen werden overnacht geïncubeerd bij 4 ° C, drie keer gewassen met PBS-T (0,05% Tween 20 in 1 x PBS) en tweemaal met PBS. De platen werden vervolgens geblokkeerd met 100 ui blokkerende buffer (2% BSA in 1 x PBS) bij 37 ° C gedurende 2 uur. De platen werden driemaal met wasbuffer PBS-T en tweemaal met PBS gewassen. De H.
pylori geïnfecteerde humane sera die tot verschillende klinische groepen werden serieel verdund (1:50, 1:100, 1:200 en 1:400) in blokkeerbuffer (1% BSA in PBS), optimale titers te verkrijgen. Verdunde sera [50 gl verdunde sera 1:200] werden aan met antigeen beklede putjes toegevoegd en gedurende 1 uur bij 37 ° C. De platen werden driemaal met PBS-T en tweemaal gespoeld met PBS en verder geïncubeerd met anti-humaan IgG-mierikswortelperoxidase (Sigma) bij 37 ° C gedurende 1 uur. Mierikswortel peroxidase-activiteit werd gedetecteerd met een chromogene stof, o
tetrahydrochloride-fenyleendiamine (Sigma) in citraat-fosfaatbuffer (pH 5,4) en H _{2O 2 als 1 ul /ml. De reacties werden gestopt met 0,5 M H 2SO 4 en de absorptiewaarden werden gemeten bij 492 nm in een ELISA-lezer (Bio-Rad). Elke ELISA werd ten minste tweemaal herhaald met alle klinische isolaten sera. Student's t
test werd uitgevoerd om te berekenen p
waarden op basis van de middelen van het serum antilichaamtiters die overeenkomen met een gezonde en geïnfecteerde klassen met behulp van het online wetenschappelijke rekenmachine van GraphPad (www.graphpad.com_quickcalcs_ttest1 .cfm). P
waarden van minder dan 0,05 werden statistisch significant beschouwd.}

ELISA voor de pro-inflammatoire cytokine IL-8

THP-1-cellen (humane monocyten, ATCC TIB 202) werden gekweekt en gehandhaafd in RPMI 1640 (Invitrogen) aangevuld met 10% foetaal runderserum, 2 mM glutamine en 1% anti-bacteriële en anti-mycotische oplossing (Gibco). Voor macrofaagachtige fase ongeveer 1 x 10 ^{-6 cellen /putje werden gemaakt met behulp van 5 ng /ml Phorbol-12 13c myristaat acetaat (PMA, Sigma). Na 24 uur werden de cellen eenmaal met RPMI 1640 medium gewassen en gestimuleerd middels 10 ug /ml recombinant ICD. Een pro-inflammatoire eiwit, HP940, van H.
pylori [30], gezuiverd onder vergelijkbare omstandigheden werd als een positieve controle (1 ug /ml). Cellen werden gedurende 24 uur in een bevochtigde atmosfeer bij 37 ° C. Cellen zonder eiwitbehandeling (ongestimuleerde cellen) diende als negatieve controle. Kweeksupernatant verzameld na 24 uur werd gebruikt voor de schatting van IL-8 in de handel verkrijgbare optEIA ELISA Kit (BD Biosciences). Assay werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant en de cytokine niveaus werden berekend volgens de standaard recombinante in de kit. Gevoeligheid van IL-8 was 3,1 pg /ml. Waarden werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD.}

Dankwoord

We zijn dankbaar voor Seyed E. Hasnain en Sharmistha Banerjee voor discussies. Wij danken onze medewerkers CM Habibullah en Barik Een Salih voor hulp bij patiënten materiaal en informatie. Dankzij zijn ook te wijten aan Francis Megraud voor het verstrekken van diverse controle-sera monsters. NA is de overeenkomstige Fellow van de Europese Helicobacter Study Group (EHSG).

• PLoS ONE: Bacteriële Microbiota Profiling in gastritis zonder Helicobacter pylori infectie of niet-steroïdale anti-inflammatoire drugsgebruik
• PLoS ONE: geassocieerde factoren van atrofische gastritis gediagnosticeerd door Double-Contrast gastro-intestinale barium X-Ray Radiography: Een cross-sectionele studie analyseren van 6901 gezonde pro…