PLoS ONE: Isocitrato deidrogenasi di Helicobacter pylori potenzialmente Induce umorale risposta immunitaria nei soggetti con ulcera peptica malattia e la gastrite

Astratto

Sfondo

H. pylori
provoca gastrite e ulcere peptiche ed è un fattore di rischio per lo sviluppo di carcinoma gastrico. Molte delle proteine ​​come ureasi, Porins, flagellins e tossine, come lipo-polisaccaridi sono stati identificati come potenziali fattori di virulenza che inducono la reazione proinfiammatorie. Riportiamo potenzialità immunogenicità dei deidrogenasi isocitrate (ICD), importante la tenuta di casa proteine ​​di H. pylori
.

Metodologia /risultati principali

sequenze di amminoacidi di H. pylori
ICD sono stati sottoposti a in silico
analisi per le regioni con alti indici prevedibile antigeniche. Inoltre, modellazione computazionale del H. pylori
ICD come giustapposta al E. coli
ICD è stata effettuata per determinare i livelli di struttura similarità e la disponibilità di superficie esposta motivi, se presente. Il ICD
gene è stato clonato, espresso e purificato ad un altissimo omogeneità. risposta umorale diretta contro H. pylori
ICD è stato rilevato attraverso un enzima collegato immunosorbent assay (ELISA) in 82 soggetti umani che comprende 58 pazienti con H. pylori associata
gastrite o ulcera e 24 controlli sani asintomatici. Il H. pylori
ICD suscitato potenzialmente elevata risposta immunitaria umorale e ha rivelato alti titoli anticorpali nel siero corrispondenti a endoscopicamente confermati gastrite e ulcera soggetti malattia. Tuttavia, l'urea-respiro-test campioni di controllo sano negativi e campioni di controllo asintomatici non hanno evidenziato risposte immunitarie rilevabili. Il test ELISA per la citochina proinfiammatoria IL-8 non mostra alcuna attività proinfiammatoria significativo di ICD.

Conclusioni /Significato

ICD di H. pylori
è un immunogeno che interagisce con il sistema immunitario ospite successiva ad un eventuale autolitico release e quindi significativamente suscita risposte umorali in soggetti con invasiva H. pylori
infezione. Tuttavia, ICD non poteva stimolare significativamente IL8 induzione in una linea cellulare di macrofagi in coltura (THP1) e, pertanto, non può essere un agente proinfiammatoria notevole

Visto:. Hussain MA, Naveed SA, Sechi LA, Ranjan S, Alvi A, Ahmed I, et al. (2008) Isocitrato deidrogenasi di Helicobacter pylori
Potenzialmente Induce umorale risposta immunitaria nei soggetti con ulcera peptica e malattia di gastrite. PLoS ONE 3 (1): e1481. doi: 10.1371 /journal.pone.0001481

Editor Accademico: Keertan Dheda, University College di Londra, Regno Unito

Ricevuto: August 29, 2007; Accettato: 24 dicembre 2007; Pubblicato: 23 gen 2008

Copyright: © 2008 Hussain et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Il finanziamento da CDFD core Grants (Dipartimento di Biotecnologie, governo di India):

Competere interessi:. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

Helicobacter pylori
è un negativo, batterio Gram curva che stabilisce le infezioni croniche in stomaco umano. Si tratta di un patogeno importante che si pensa abbia co-evoluti con gli esseri umani [1], [2]. Abita circa metà della popolazione mondiale ed è considerato come un potenziale fattore di rischio per lo sviluppo di adenocarcinoma gastrico [3]. H. pylori
è una causa riconosciuta di gastrite cronica, ulcera peptica, carcinoma gastrico, e associato alla mucosa tessuto linfoide (MALT) linfoma. Diversi meccanismi sono stati proposti per spiegare il suo ruolo nella patogenesi dell'intestino. Nonostante gli elevati tassi di colonizzazione solo un piccolo sottoinsieme di persone infette sperimentano H. pylori
malattie -associated [2]. Associazioni di H. pylori
con fattori specifici della malattia sono rimasti più o meno enigmatico, anche se le sequenze del genoma sono stati decifrati quasi un decennio fa [2].

Una delle caratteristiche più distintive di H. pylori
è la diversità genetica tra gli isolati clinici ottenuti da diverse popolazioni di pazienti [3]. Rifusione del genoma è la norma con questo batterio, creando così un sacco di allelica e variazione di fase [3], che presentano difficoltà nello sviluppo della diagnostica e vaccini.

Una volta acquisita, l'infezione persiste per anni e, suscita risposte immunitarie rilevabili nelle persone infette [4], [5] caratterizzata da un aumento dei livelli di specifici IgG e IgA nel siero e aumento della secrezione di IgA e IgM nello stomaco [6]. Pertanto, test sierologici non invasivi sono stati raccomandati e sviluppati per la diagnosi di H. pylori
infezione. Tra questi, il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) è uno dei metodi più ampiamente utilizzato in quanto è relativamente economico, veloce, semplice da eseguire, e potrebbe essere facilmente adottata per lo screening gran numero di campioni [7]. Esplorare per anti H. pylori
anticorpi è spesso prescritto prima di endoscopia o prima di iniziare il trattamento. Anche se a causa di memoria immunologica, sierodiagnosi non può essere preferito per controllare il successo o il risultato del trattamento di eradicazione, rimane una scelta come un metodo sensibile, probabilmente a causa della sua natura non invasiva [8].

Al momento, non ci non è stato alcun antigene singolo 'gold standard', che può essere utilizzato in modo inequivocabile tutte le popolazioni. Una delle ragioni importanti per questo potrebbe essere la straordinaria diversità presente in H. pylori
[9] - [13] e anche il suo adattamento specifico host differenti [12], [13]. Sebbene proteine ​​come catalasi, gro
EL e flagellin sono fortemente immunogenico, danno reazioni crociate aspecifiche con altri batteri Gram-negativi e, più in particolare, Campylobacter jejuni
[14], [15]. Al contrario, virulenza collegato antigeni come CagA o VacA, mostrano piuttosto un alto grado di variabilità di sequenza, come esistono H. pylori
ceppi, che sono geneticamente diverse e fenotipicamente variabile per uno o entrambi gli antigeni [16] - [18]. Nonostante questo, sono state descritte associazioni soddisfacente tra anticorpi sierici e le malattie invasive [19].

geni housekeeping su H. pylori
sono stati utilizzati di recente per tracciare le migrazioni di popolazione e sono stati trovati ad essere stabile nel genoma attraverso i secoli [20]. PULIZIE proteine ​​tuttavia, non sono stati testati in linea di massima per il loro utilizzo nella diagnostica o vaccini. Gli enzimi metabolici sembrano essere un buon candidato per essere inclusi in un kit per il test immuno-diagnostici in quanto spesso non cross-reagiscono con il siero di soggetti sani di controllo [21]. Inoltre, a causa della loro funzione di pulizia, che sono altamente conservati tra diverse H. pylori
ceppi indipendentemente dalla loro genotipi e quindi può servire come candidati ideali immuno-diagnostica.

Le proteine ​​che vengono rilasciati dai batteri durante la fase di crescita logaritmica tardiva, come la superossido dismutasi e deidrogenasi isocitrate (ICD), sono descritto come marcatori autolisi [22] - [24] e alcuni di loro sono stati dimostrato di essere ottimi antigeni diagnostici. Ad esempio, ICD di M. la tubercolosi
è stato descritto come un potenziale antigene di discriminare pazienti affetti da tubercolosi polmonare da controlli sani [24]. Tuttavia, precedenti confronti dei modelli antigeniche di H. pylori
proteine ​​(tra cui alcune delle proteine ​​pulizia) riconosciute dalla sieri dei pazienti hanno rivelato alcuna associazione di specifica H. pylori
antigeni con i casi di particolare patologia gastroduodenale [21].

Questo studio dimostra l'interazione del sistema immunitario ospite con H. pylori
ICD sotto forma di risposte umorali significativi osservati nei soggetti di malattia. Inoltre, descriviamo H. pylori
ICD antigene di distinguere la malattia di ulcera e gastrite pazienti provenienti da individui sani non infettati.

Risultati

Nella modellazione in silico, l'espressione e la purificazione di proteine ​​H. pylori ICD

sequenza della proteina di ICD di H. pylori
è stato analizzato per prevedere la sua immunogenicità sulla base dell'indice antigenica, idrofilia e la probabilità di superficie. spettacoli Figura 1A in silico antigenici Profili di ICD generati usando il software Protean (DNAStar Inc. USA). In breve, sono state individuate diverse tracce corrispondenti a immunoreattiva motivi di amminoacidi con prevedibilmente più alti indici antigenici (~3.4). Il H. pylori
ICD quindi visualizzata principali tratti antigenici (Figura 1A) ci spinge a guardare come una proteina putatively immunogenico. Gli indici antigenicità di ICD erano paragonabili a quelli precedentemente riportati per un Rv2430c DPI antigene di origine micobatteri, che è stata ulteriormente dimostrato di essere un antigene immunodominante [25]. Il E. coli
ICD è stato anche analizzato in maniera simile e sembrava essere putativamente immunogenico; c'era una chiara differenza trovato rispetto a H. pylori
ICD, rispetto alla abbondanza e posizione dei residui antigenici. In seguito, abbiamo costruito un modello di omologia del H. pylori
ICD basato sulla struttura cristallina di E. coli
ICD (codice PDB 1AI2) e sono stati in grado di rappresentare l'organizzazione spina dorsale del H. Pylori
(26695) ICD insieme a quello di E. coli
. Le due ICD sono risultati essere significativamente simili (RMS deviazione 0,45) tuttavia differivano rispetto a regioni loop esposte 3 superficiali importante che possono costituire zone di differenze strutturali corrispondenti agli epitopi antigenici putativi, eventualmente impartendo risposte anticorpali differenziale (Figura 1B )

L'over-espresso N-terminale His-tag ICD è stato purificato a >. omogeneità 95% su una colonna di nichel affinità (Figura 2). La massa molecolare del ICD ricombinante è stata determinata da 47 kDa. purificazione della proteina è stata effettuata in condizioni native con una resa di 2,0 mg di proteina per 500 ml di cultura inizio.

L'interazione di H. pylori ICD con il sistema immunitario umano
risposte immunitarie

umorali diretto contro il H. pylori
ICD sono stati confrontati tra i pazienti con H. pylori
infezione (gastrite, NUD, DU e GC) e controlli sani (Figura 3). I dati immunoreattività sono stati analizzati statisticamente e confrontati con collegamento ad entrambi i sieri infetti e sani. Questi dati hanno dimostrato che sieri di tutti i pazienti infetti appartenenti gastrite e ulcera duodenale (DU) categorie effettuate statisticamente significativa ( P
< 0,0001) anti-ICD livelli anticorpali rispetto a quelli dei controlli sani. La proteina ICD, che ha un apparentemente importante ruolo metabolico, è stata pertanto in grado di suscitare una forte risposta umorale in soggetti con gastrite e DU. Tuttavia, nei casi di dispepsia non ulcerosa (NUD) e cancro gastrico (GC), ridotta risposta umorale è stato visto. Alla luce di queste osservazioni, è probabile che il rilascio di proteine ​​ICD è associato attiva, H. pylori
infezione. In contrasto risposte umorali osservate, ricombinante, H. pylori
ICD non induce significativi risposte immunitarie cellulari come evidenziato dalla mancanza di secrezione di IL-8 da macrofagi umani indotta con ricombinante, H. pylori
ICD in vitro
(Figura 4). Pertanto, suggeriamo che ICD eccita solo il vano umorale e non può contribuire alla patologia gastrica o citochine cambiamenti indotti nella fisiologia gastrica.

Discussione

Identificazione e caratterizzazione di altamente immunogenico H. pylori
proteine ​​è un requisito obbligatorio per lo sviluppo di test sierologici basati su antigeni ricombinanti purificate. In combinazione con l'urea breath test, sierologia è un approccio non invasivo per rilevare H. pylori
infezioni e diversi kit di test sierologici sulla base di molti H diverso. pylori
antigeni sono disponibili in commercio. Sebbene la risposta immunitaria umorale a H. pylori
sembra essere molto variabile, le combinazioni di antigeni spesso riconosciuti potrebbero rivelarsi utili per scopi diagnostici [21]. Gli enzimi metabolici come ICD sembrano essere buoni candidati per essere sfruttate per lo sviluppo sierologica kit soprattutto perché non cross-reagiscono con il siero di individui sani non infetti o [24].

Il significato di molti proteine ​​immunogeniche di H. pylori
tra cui alcuni enzimi metabolici non è stato apprezzato molto in campioni clinici in uno studio basato proteomica precedenti [21]. Il nostro studio è stato invece indirizzato a valutare purificata, ricombinante, H. pylori
ICD per le sue proprietà immunologiche in differenti classi di H. pylori
infettato pazienti con malattia peptica acidi. Abbiamo tentato di esaminare sistematicamente la presenza e l'utilità delle risposte immunitarie indotte dalla proteina ICD in H. pylori
infettato pazienti.

La nostra analisi utilizzando ICD ricombinante di H. pylori
rivelato significativamente elevati titoli di anticorpi tra ulcera peptica e gastrite pazienti, rispetto ai pazienti affetti da cancro (Figura 3) NUD e. Noi ipotizziamo che la risposta immunitaria visto in casi di ulcera peptica e gastrite potrebbe forse essere dovuto ad elevati carichi di batteri associati con patologia invasiva e pertanto un maggior numero di patogeni autolisi o patogeni presentano ICD sulla superficie. Questo può forse spiegare la risposta relativamente alta di anticorpi nei pazienti categoria invasive.

H. pylori
antigeni sono descritti per essere rilasciato nello spazio extracellulare tramite diversi meccanismi quali percorsi specifici secrezione, autolisi, e la formazione di vescicole di membrana [23] e le proprietà di superficie di H. pylori
sono state suggerite per essere unico nel consentire la localizzazione adsorbimento /superficie di tali proteine ​​[26]. ICD sono tradizionalmente noti come marcatori di autolisi [22], [24], [27], rilasciate durante la fase di ritardo logaritmica. Il rilascio extracellulare di proteine ​​potrebbe essere potenzialmente si verificano solo durante in vitro
crescita del H. pylori
. Tuttavia, in vivo
esistenza di tali meccanismi, se dimostrato, potrebbe essere in grado di spiegare il ruolo di varie proteine ​​secrete in patologia molecolare della malattia ulcerosa. L'ingresso di H. pylori
proteine ​​nello spazio sottomucosa gastrica potrebbero avere importanti conseguenze funzionali quali la promozione di proinfiammatorie e risposta chemiotattica attraverso il rilascio di citochine da macrofagi attivati. Inoltre, il rilascio extracellulare e o adsorbimento o una superficie di localizzazione [26] di proteine ​​potenziale immunogenicità potrebbero sostenere una strategia di batteri per deviare una efficace risposta immunitaria locale [23]. Mantenere questi meccanismi multipli in mente, abbiamo controllato i potenziali pro-infiammatorie di ICD con l'aiuto di un test ELISA IL-8. Nella nostra osservazione, ICD non ha indotto in modo significativo IL-8 secrezione differenziate, macrofagi in coltura. Tuttavia, dato che non abbiamo analizzato il ruolo di ICD per quanto riguarda l'induzione di altre citochine proinfiammatorie quali il TNF-α e β-IL1, sarà prematuro escludere giustamente il suo coinvolgimento nel processo infiammatorio gastrico.

Dopo aver dimostrato che H. pylori
ICD provoca una risposta umorale, abbiamo studiato la base della specificità immunitario di questa proteina come risulta dalla modellazione basata struttura. La nostra sequenza di analisi e modellistica molecolare di H. pylori
e E. coli
ICD non hanno evidenziato sovrapposizioni strutturali complete tra i due (figura 1); diverse regioni di differenze strutturali sono stati giudicano che forse corrispondono alle epitopi antigenici putativi in ​​ H. pylori
ICD. A parte le questioni legate alla conservazione strutturale o la diversità, ipotizziamo che una maggiore reattività di H. pylori
ICD rispetto a ICD di (commensale) E. coli
con il sistema host immunitario in vivo
potrebbero essere associati a 1) diversa invasività di H. pylori
e E. coli Pagina 2) diversa entità batterica carico, fatturato e autolisi 3) diverso repertorio di cellule presentanti l'antigene (macrofagi rispetto a cellule dendritiche) coinvolte e la loro relativa abbondanza 4) disponibilità di epitopi superficie esposta in H. pylori
ICD (come quelli evidenziati in Figura 1B), e 5) presenza di lesioni attive di infiammazione cronica, danno della mucosa e gli effetti chemiotattici degli altri H. pylori
proteine ​​nel ambiente
.

Pur considerando possibile cross-reattività da altri batteri invasivi come C. jejuni
, abbiamo testato H. pylori
ICD contro 8 campioni di C. jejuni
sieri dei pazienti enterite e ha scoperto che lo ha fatto non cross-reagiscono in modo significativo (dati non riportati). Il H. pylori
stato gratuito del nostro C. jejuni
pazienti positivi è stato determinato in base all'assenza di sintomi di indigestione, mal di stomaco e bruciore di stomaco ecc Tuttavia, dal momento che abbiamo utilizzato solo i campioni di siero limitate da C. jejuni
pazienti, che non sono inclini a marchio H. pylori
ICD come antigene diagnostica standalone. Tuttavia, C. jejuni
non può comprendere sempre uno sfondo molto competitivo a meno che C. jejuni
pazienti stessi sono clinicamente colonizzate da H. pylori
o viceversa.

Infine, i risultati promettenti che abbiamo ottenuto in termini di significative risposte umorali a H. pylori
ICD non può essere interpretato come immediatamente applicabile per la diagnosi livello di campo. Tuttavia, è possibile che i nostri risultati forniscono una solida base per lo sviluppo di un siero-diagnostico per H. pylori
associato patologie gastroduodenali. Si suggerisce il potenziale di questo antigene e dei suoi peptidi specifici epitopi può inoltre essere analizzato utilizzando una grande batteria di campioni di siero che rappresentano diversi soggetti della malattia. Allo stesso modo, lo stato e il significato degli anticorpi cross-reattivi nel siero corrispondenti a malattie causate da batteri come Salmonella spp., Shigella spp. e altri enteropatogeni invasivi potrebbe anche essere determinate. Sarà la pena di esplorare in profondità il coinvolgimento di ICD in attività di segnalazione nello spazio sottomucosa, specialmente la sua interazione con i macrofagi e linfociti attivati. Inoltre, dato il suo ruolo importante nel ciclo degli acidi tricarbossilici e l'assenza di gliossilato shunt in H. pylori
[27], la valutazione di ICD come un possibile bersaglio interventistica pone una proposta interessante.

Materiali e Metodi

In silico antigenicità del predetto H. pylori ICD (HP0023)

sequenza nucleotidica del H. pylori ICD
(ORF HP0023) e la sequenza di amminoacidi corrispondente è stato ottenuto dal database Pylorigene (http://genolist.pasteur.fr) ed è stato sottoposto ad analisi da DNAStar pacchetto (DNAStar Inc. Madison, Stati Uniti d'America). Sequenza aminoacidica di ICD è stato sottoposto a controllo per eventuali determinanti antigenici che utilizzano il programma Protean all'interno del pacchetto DNAStar. Parametri come idrofilia, la probabilità di superficie e l'indice antigenico sono stati calcolati per l'intera proteina utilizzando questo software. indici antigeniche che mostrano più di 2 picchi a > 3,0 scale sono state considerate come significativamente più antigenico

modellazione computazionale delle strutture ICD

Utilizzando Modeller-6, un programma di modellazione molecolare che implementa un approccio automatizzato. a comparativa struttura delle proteine ​​di modellazione per la soddisfazione di vincoli spaziali [28] è stato utilizzato per la determinazione del modello tridimensionale di H. pylori
ICD. Il modello ICD di H. pylori
è stata generata in base al E. coli
ICD modello 1A12 che condivide identità complessiva di sequenza del 68% con il H. pylori
ICD.

Produzione di ricombinante H. pylori ICD

La ORF corrispondente al H. pylori ICD
(HP0023, 1.275 kb) è stato amplificato mediante PCR dal DNA genomico di un H. pylori
paziente isolare MS8. La proteina ricombinante ICD era finita espresso in E. Comprare e purificata all'omogeneità coli (figura 2) secondo i metodi precedentemente descritti da Banerjee et al
[24]. La raccolta di proteina purificata è stato standardizzato fino a 2,0 mg di proteina purificata per 500 ml di partenza cultura ricombinante E. coli
. La proteina ricombinante purificata è stato dializzato contro 20 mM Tris HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl e 3% glicerolo. Inoltre, la proteina purificata è stato trattato con polimixina B per escludere effetti di eventuali contaminazioni LPS. L'ICD ricombinante purificata è stato liofilizzato e subito conservati congelati per l'uso a valle nella diagnosi clinica.

Pazienti e campioni di siero umano

La popolazione in studio ( n
= 82) comprendeva 58 H. pylori
infettato campioni dei pazienti (per i dettagli del numero di casi analizzati in ogni categoria, si veda la Figura 3) ottenuti da casi di segnalazione principalmente al Deccan Collegio di Scienze mediche, paramediche Ospedali, (DCMS), Hyderabad, e 24 clinicamente sani donatori. Il gruppo di controllo sano era composto da 18 dimostrato H. pylori
casi negativi testati con Urea Breath Assay (UBA) e 6 soggetti asintomatici che sono stati confermati H. pylori
negativo come testato da disponibile in commercio kit ELISA (Pyloriset EIA-GIII, Orion, Espoo, Finlandia). In tutti i gruppi di pazienti, la diagnosi di ulcera o gastrite è stata confermata o esclusa per via endoscopica dal gastroenterologo curante. La presenza di H. pylori
nei soggetti malati inclusi in questo studio è stato già confermato dalla colorazione di Gram, un test rapido dell'ureasi (RUT), 16S rRNA e cag
Un gene PCR e la cultura [29] In base. La popolazione dello studio non aveva pregiudizi di sesso o età. consensi informato scritto sono stati ottenuti da tutti i pazienti e controlli sani ai rispettivi centri.

ELISA per le risposte umorali
test

ELISA è stato eseguito per verificare la risposta immunitaria umorale negli esseri umani contro ICD ricombinante. Brevemente, le piastre a 96 pozzetti sono stati rivestiti con ~500 ng di proteina ricombinante ICD. Le piastre rivestite sono state incubate overnight a 4 ° C, lavate tre volte con PBS-T (0,05% Tween 20 in 1 × PBS) e due volte con PBS. Le piastre sono state poi bloccate con 100 ml di tampone di bloccaggio (2% BSA in PBS 1 ×) a 37 ° C per 2 ore. Le piastre sono state lavate tre volte con tampone di lavaggio PBS-T e due volte con PBS. Il H. pylori
-infected sieri umani appartenenti a diversi gruppi clinici sono stati diluiti (1:50, 1:100, 1:200 e 1:400) in tampone di bloccaggio (1% BSA in PBS), per ottenere titoli ottimali. I sieri diluiti [50 ml di 1:200 sieri diluiti] sono stati aggiunti a pozzetti dell'antigene ed incubate per 1 ora a 37 ° C. Le piastre sono state lavate tre volte con PBS-T e due volte con PBS e in seguito incubate con IgG-perossidasi di rafano anti-umano (Sigma) a 37 ° C per 1 ora. perossidasi del rafano è stato rilevato usando una sostanza cromogenico, o
fenilendiamina tetraidrocloride (Sigma) in tampone citrato-fosfato (pH 5.4) e H _{2O 2 come 1 ml /ml. Le reazioni sono stati fermati utilizzando 0,5 M H 2SO 4, ed i valori di assorbanza sono stati misurati a 492 nm in un lettore ELISA (Bio-Rad). Ogni ELISA è stato ripetuto almeno due volte con tutti gli isolati clinici SERA. dello studente t
test è stato eseguito per calcolare i valori p commercio basato sui mezzi dei titoli anticorpali nel siero corrispondenti alle classi sani e infetti utilizzando la calcolatrice scientifica on-line di GraphPad (www.graphpad.com_quickcalcs_ttest1 .cfm). P
valori inferiori a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.}

ELISA per la citochina proinfiammatoria IL-8

cellule THP-1 (Monociti umano, ATCC TIB 202) sono state coltivate e mantenuta in RPMI 1640 (Invitrogen) supplementato con siero fetale bovino al 10%, 2 mM glutammina e 1% antibatterica e antimicotica soluzione (Gibco). Per macrofagi come fase, a circa 1 × 10 ^{-6 cellule /pozzetto sono stati differenziati con 5 ng /ml Phorbol-12 myristate 13c acetato (PMA, Sigma). Dopo 24 ore, le cellule sono state lavate una volta con RPMI 1640 media e stimolate con 10 ug /ml di ICD ricombinante. Una proteina proinfiammatorie, HP940, di H. pylori
[30], purificato in condizioni simili è stato utilizzato come controllo positivo (1 ug /ml). Le cellule sono state incubate per 24 ore in atmosfera umidificata a 37 ° C. Le cellule senza trattamento di proteine ​​(cellule non stimolate) è servito come controllo negativo. Culture surnatante raccolto dopo 24 ore è stato utilizzato per la stima di IL-8 utilizzando commercialmente disponibile Kit optEIA ELISA (BD Biosciences). Assay è stata eseguita secondo le istruzioni del produttore e le livelli di citochine sono stati calcolati utilizzando lo standard ricombinante fornito nel kit. La sensibilità di IL-8 è stato del 3,1 pg /ml. I valori sono stati espressi come media ± SD.}

Riconoscimenti

Siamo grati a Seyed E. Hasnain e Sharmistha Banerjee per le discussioni. Ringraziamo i nostri collaboratori CM Habibullah e Barik Un Salih per un aiuto su materiale del paziente e l'informazione. Grazie sono dovuti a Francesco Megraud per la fornitura di vari campioni di controllo sieri anche. NA è il Fellow relativa al gruppo di studio europeo Helicobacter (EHSG).

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