PLOS ONE: isocitrato deshidrogenasa de Helicobacter pylori Potencialmente induce respuesta inmune humoral en pacientes con úlcera péptica y gastritis

Extracto

Antecedentes

H. pylori causa gastritis
y úlceras pépticas y es un factor de riesgo para el desarrollo de carcinoma gástrico. Muchas de las proteínas tales como ureasa, porinas, flagelinas y toxinas tales como lipo-polisacáridos han sido identificados como posibles factores de virulencia que inducen reacción proinflamatoria. Presentamos los potenciales inmunogénicas de la isocitrato deshidrogenasa (ICD), una proteína importante mantenimiento de la casa de H. pylori
.

Hallazgos Metodología /Principales

Las secuencias de aminoácidos de H. pylori
CIE fueron sometidos a in silico
análisis para las regiones con altos índices de esperar antigénicos. Además, el modelado computacional de la H. pylori
CIE como yuxtapuesto al E. coli
ICD se llevó a cabo para determinar los niveles de similitud estructura y la disponibilidad de los motivos expuestos en la superficie, si la hay. El icd
gen fue clonado, expresado y purificado a un nivel muy alto de homogeneidad. La respuesta humoral dirigida contra H. pylori
CIE se detectó mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA) en 82 sujetos humanos que comprende de 58 pacientes con H. pylori servicios asociados gastritis o la úlcera y 24 controles sanos asintomáticos. El H. pylori
CIE suscitó la respuesta inmune humoral potencialmente alto y reveló altos niveles de anticuerpos en sueros correspondientes a confirmado endoscópicamente gastritis y úlcera sujetos con enfermedad. Sin embargo, las muestras de control negativas sana prueba respiratoria con urea y muestras de control asintomáticos no revelaron respuestas inmunes detectables. El ELISA para citoquinas proinflamatorias IL-8 no presenta ninguna actividad proinflamatoria importante de la CIE.

Conclusiones /Importancia

CIE de H. pylori
es un inmunógeno que interactúa con el sistema inmune del huésped posterior a una posible liberación autolítico y de ese modo significativamente provoca respuestas humorales en individuos con invasiva H. pylori
infección. Sin embargo, la CIE no podía estimular significativamente la inducción de IL-8 en una línea celular de macrófagos cultivados (THP1) y por lo tanto, no puede ser un agente proinflamatorio notable

Visto:. Hussain MA, Naveed SA, Sechi LA, Ranjan S, Alvi A, Ahmed I, et al. (2008) isocitrato deshidrogenasa de Helicobacter pylori
potencialmente induce la respuesta inmune humoral en pacientes con úlcera péptica y gastritis. PLoS ONE 3 (1): e1481. doi: 10.1371 /journal.pone.0001481

Editor Académico: Keertan Dheda, University College de Londres, Reino Unido

Recibido: 29 Agosto, 2007; Aceptado 24 de diciembre del 2007; Publicado: 23 Enero 2008

Derechos de Autor © 2008 Hussain et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. La financiación de CDFD Core Subvenciones (Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India)

Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Helicobacter pylori
es una bacteria Gram negativa, curva que establece infecciones crónicas en el estómago humano. Es un importante patógeno que se cree que han evolucionado conjuntamente con los seres humanos [1], [2]. Habita cerca de la mitad de la población mundial y es considerado como un factor de riesgo potencial para el desarrollo de adenocarcinoma gástrico [3]. H. pylori
es una causa reconocida de la gastritis crónica, úlcera péptica, carcinoma gástrico, y el tejido linfoide asociado a mucosas (MALT). Se han propuesto varios mecanismos para explicar su papel en la patogénesis de la tripa. A pesar de las altas tasas de colonización sólo un pequeño subconjunto de las personas infectadas experimentan H. pylori
enfermedades -asociado [2]. Asociaciones de H. pylori Chat con factores específicos de la enfermedad se han mantenido más o menos enigmática a pesar de que las secuencias del genoma fueron descifradas hace casi una década [2].

Una de las características más distintivas de H. pylori
es la diversidad genética entre aislados clínicos obtenidos a partir de diferentes poblaciones de pacientes [3]. Refundición del genoma es la norma con esta bacteria, creando de este modo una gran cantidad de alélica y variación de fase [3], las dificultades en el desarrollo de diagnósticos y vacunas que presenta.

Una vez adquirida, la infección persiste durante años y, provoca respuestas inmunes detectables en personas infectadas [4], [5] que se caracteriza por el aumento de los niveles de IgG específica e IgA en el suero y el aumento de la IgA secretora y IgM en el estómago [6]. Por lo tanto, las pruebas serológicas no invasivos fueron recomendados y desarrolladas para el diagnóstico de H. pylori
infección. Entre estos, el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) es uno de los métodos más ampliamente utilizado, ya que es relativamente asequible, rápido, simple de realizar, y podría adoptarse fácilmente para el cribado de gran número de muestras [7]. Explorar para anti H. pylori anticuerpos
se prescriben a menudo antes de la endoscopia o antes de iniciar el tratamiento. Aunque debido a la memoria inmunológica, serodiagnóstico no puede ser preferido para comprobar el éxito o el resultado del tratamiento de erradicación, sigue siendo una opción como un método sensible, probablemente debido a su naturaleza no invasiva [8].

Actualmente, hay no ha habido ningún antígeno único "patrón oro", que de forma inequívoca se puede utilizar en todas las poblaciones. Una de las razones importantes para esto podría ser la extraordinaria diversidad presente en H. pylori
[9] - [13] y también su adaptación específica en diferentes huéspedes [12], [13]. Aunque las proteínas tales como catalasa, gro
EL, y flagelina son fuertemente inmunogénico, dan no específicos reacciones cruzadas con otras bacterias Gram-negativos y, más particularmente, Campylobacter jejuni
[14], [15]. Por el contrario, los antígenos de virulencia vinculados como CagA o VacA, muestran un gran alto grado de variabilidad de secuencia, ya que existen H. pylori
cepas, que son genéticamente diversas y fenotípicamente variable para uno o ambos de los antígenos [16] - [18]. A pesar de esto, se han descrito asociaciones satisfactorias entre anticuerpos en suero y la enfermedad invasiva [19].

Housekeeping genes de H. pylori
se han utilizado recientemente para realizar un seguimiento de las migraciones de población y se encontró que ser estable en el genoma a través de los siglos [20]. Sin embargo proteínas limpieza, no se han probado por lo general para su uso en el diagnóstico o vacunas. Las enzimas metabólicas parecen ser un buen candidato para ser incluido en un kit de prueba de inmuno-diagnóstico, ya que a menudo no tienen una reacción cruzada con sueros de controles sanos [21]. También, debido a su función de limpieza, que están altamente conservadas entre diferentes H. pylori
cepas con independencia de sus genotipos y por lo tanto pueden servir como candidatos ideales inmuno-diagnóstico.

Las proteínas que se liberan de las bacterias durante la fase de crecimiento logarítmico tardía, como la superóxido dismutasa y la isocitrato deshidrogenasa (ICD), son descrito como marcadores autolisis [22] - [24] y algunos de ellos han sido demostrado ser excelentes antígenos de diagnóstico. Por ejemplo, ICD de M. tuberculosis
ha sido descrito como un antígeno potencial de discriminar pacientes con tuberculosis pulmonar de los controles sanos [24]. Sin embargo, las comparaciones anteriores de los patrones antigénicos de H. pylori
proteínas (incluyendo algunas de las proteínas de limpieza) reconocidos por los sueros de pacientes revelaron ninguna asociación específica de H. antígenos pylori
con casos de especial patología gastroduodenal [21].

Este estudio demuestra la interacción del sistema inmune del huésped con H. pylori
ICD en forma de respuestas humorales significativos observados en sujetos con enfermedad. Además, describimos H. antígeno pylori
CIE para distinguir pacientes con la enfermedad de la úlcera y la gastritis de individuos sanos no infectados.

Resultados

En el modelado in silico, expresión y purificación de proteínas de H. pylori CIE

secuencia de la proteína de la CIE de H. pylori
se analizó para predecir su inmunogenicidad basado en el índice antigénico, hidrofilicidad y probabilidad de superficie. muestra la Figura 1A in silico
perfiles antigénicos de la CIE generados utilizando el software Protean (DNAStar Inc. EE.UU.). Brevemente, se identificaron varias huellas correspondientes a inmunoreactivos motivos de aminoácidos con índices antigénicos predeciblemente más altas (~3.4). El H. por lo tanto pylori
CIE está representada principales tramos antigénicos (Figura 1A) nos llevó a verlo como una proteína inmunogénica supuestamente. Los índices de antigenicidad de ICD eran comparables a los descritos previamente para un antígeno Rv2430c PPE de origen micobacteriano, que fue probado además a ser un antígeno inmunodominante [25]. El E. coli
CIE también se analizó de manera similar y parecían ser supuestamente inmunogénica; había una diferencia clara encontrado en comparación con H. pylori
ICD, con respecto a la abundancia y la posición de los residuos antigénicos. Más tarde, se construyó un modelo de homología de la H. pylori
ICD basado en la estructura cristalina de E. coli
CIE (AP código 1AI2) y fueron capaces de representar a la organización columna vertebral de H. Pylori gratis (26695) CIE junto con el de E. coli
. Se encontró que los dos DAI ser significativamente similar (RMS Desviación 0,45) aún diferían con respecto a 3 de superficie importante bucle regiones expuestas que son susceptibles de constituir las áreas de diferencias estructurales correspondientes a los epítopos antigénicos putativo, posiblemente impartir las respuestas de anticuerpos diferencial (Figura 1B )

La sobre-expresado N-terminal de His CIE se purificó a >. homogeneidad del 95% en una columna de afinidad de níquel (Figura 2). La masa molecular de la CIE recombinante se determinó que era de 47 kDa. Purificación de proteínas se llevó a cabo bajo condiciones nativas con un rendimiento de 2,0 mg de proteína por 500 ml de cultivo de inicio.

Interacción de H. pylori ICD con el sistema inmunológico humano
respuestas inmunes

humorales dirigida en contra de la H. pylori
CIE se compararon entre los pacientes con H. pylori
infección (gastritis, DNU, el uranio empobrecido y GC) y controles sanos (Figura 3). Los datos de inmunorreactividad se analizaron estadísticamente y se comparan con la conexión a ambos sueros infectados y saludable. Estos datos demostraron que los sueros de todos los pacientes infectados pertenecientes a gastritis y úlcera duodenal (UD) Categorías llevaron estadísticamente significativa ( P
< 0,0001) los niveles de anticuerpos anti CIE, en comparación con los de los controles sanos. La proteína ICD, que tiene un papel metabólico importante, aparentemente, se encontró así que ser capaz de inducir una fuerte respuesta humoral en los sujetos con gastritis y DU. Sin embargo, en casos de dispepsia no ulcerosa (NUD) y el cáncer gástrico (GC), se observó reducción de la respuesta humoral. Teniendo en cuenta estas observaciones, es probable que la liberación de la proteína ICD se asocia con activo, H. pylori
infección. En contraste con las respuestas humorales observados, el recombinante, H. pylori
ICD no indujo respuestas inmunes celulares importantes como se evidencia por la falta de secreción de IL-8 a partir de macrófagos humanos inducidos con recombinante, H. pylori
CIE in vitro gratis (Figura 4). Por lo tanto, sugerimos que la CIE excita solamente el compartimiento humoral y no puede contribuir a la patología gástrica o los cambios inducidos por citoquinas en la fisiología gástrica.

Discusión

Identificación y caracterización de los altamente inmunogénica H. pylori
proteínas es un requisito obligatorio para el desarrollo de pruebas serológicas basadas en antígenos purificados recombinantes. En combinación con la prueba de aliento con urea, la serología es un método no invasivo para detectar H. pylori
infección, y varios equipos de prueba serológica para muchos H diferente. antígenos pylori
están disponibles comercialmente. Aunque la respuesta inmune humoral a H. pylori
parece ser bastante variable, con frecuencia combinaciones de antígenos reconocidos podrían resultar útiles para fines de diagnóstico [21]. Las enzimas metabólicas tales como ICD parecen ser buenos candidatos para ser aprovechadas para el desarrollo kit de prueba serológica principalmente debido a que no tienen una reacción cruzada con sueros de individuos sanos no infectados o [24].

El significado de muchos proteínas inmunogénicas de H. pylori
incluyendo algunas enzimas metabólicas no se ha apreciado tanto en muestras clínicas en un estudio basado en la proteómica anteriores [21]. sin embargo, nuestro estudio fue dirigido para evaluar purificada, recombinante, H. pylori
ICD por sus propiedades inmunológicas en las diferentes clases de H. pylori
pacientes infectados por la enfermedad ácido péptica. Hemos tratado de examinar sistemáticamente la presencia y la utilidad de las respuestas inmunitarias producidas por la proteína ICD en H. pylori
pacientes infectados.

Nuestro análisis usando la CIE recombinante de H. pylori
reveló los títulos de anticuerpos significativamente alta entre los pacientes de la enfermedad de la úlcera péptica y gastritis, en comparación con NUD y los pacientes de cáncer (Figura 3). Especulamos que la respuesta inmune que se ve en casos de úlcera péptica y gastritis podría quizás ser debido a altas cargas de bacterias asociadas con patología invasiva y por lo tanto un mayor número de agentes patógenos o patógenos que presentan autolisados ​​ICD en la superficie. Esto puede explicar posiblemente la respuesta comparativamente alto de anticuerpos en pacientes categoría invasivos.

H. antígenos pylori
se describen para ser lanzado al espacio extracelular a través de múltiples mecanismos tales como la secreción de las vías específicas, autolisis, y formación de vesículas de membrana [23] y las propiedades de la superficie de H. pylori
se han sugerido para ser único en permitir la localización de adsorción /superficie de tales proteínas [26]. Los ICD se conoce tradicionalmente como marcadores de autolisis [22], [24], [27], liberados durante la fase logarítmica tardía. La liberación extracelular de proteínas podría ser potencialmente ocurriendo sólo durante in vitro
crecimiento de H. pylori
. Sin embargo, in vivo
existencia de tales mecanismos, si se demuestra, podría ser capaz de explicar el papel de varias proteínas secretadas en la patología molecular de la enfermedad de úlcera. La entrada de H. pylori
proteínas en el espacio submucoso gástrico pueden tener importantes consecuencias funcionales tales como la promoción de proinflamatorias y las respuestas quimiotácticas través de la liberación de citocinas por los macrófagos activados. Además, la liberación extracelular y o la adsorción o de la superficie de localización [26] de proteínas potencialmente inmunogénicos pueden apoyar una estrategia bacteriana para desviar una respuesta inmune local efectiva [23]. La integridad de los múltiples mecanismos en mente, hemos comprobado potenciales proinflamatorios de la CIE con la ayuda de un ensayo ELISA de IL-8. En nuestra observación, ICD no induce significativamente la secreción de IL-8 en los macrófagos diferenciadas, cultivadas. Sin embargo, dado que no se analizó el papel de la CIE en lo que respecta a la inducción de otras citoquinas proinflamatorias como TNF-α y β-IL1, será prematuro gobernar con justicia a cabo su implicación en la inflamación gástrica.

Después de haber demostrado que H. pylori
ICD provoca una respuesta humoral, se investigó la base de la especificidad inmunológica de esta proteína como se refleja por el modelado basado en la estructura. Nuestro análisis de secuencias y modelado molecular de H. Opiniones y pylori E. coli
DAI no revelaron superposiciones estructurales completas entre los dos (Figura 1); varias regiones de diferencias estructurales se distinguieron los que posiblemente se corresponden con los epítopos antigénicos putativos en H. pylori
CIE. Aparte de las cuestiones vinculadas a la conservación o la diversidad estructural, que postula que el mayor reactividad de H. pylori
CIE, en comparación con la CIE de (comensal) E. coli
con el sistema inmune del huésped in vivo
podría asociarse con 1) diferente invasividad de H. Opiniones y pylori E. coli página 2) diferentes magnitudes de la carga bacteriana, la facturación y la autolisis 3) diferente repertorio de células presentadoras de antígenos (macrófagos frente a las células dendríticas) que participan y su abundancia relativa 4) la disponibilidad de los epítopos expuestos en la superficie H. pylori
CIE (como los ilustrados en la figura 1B), y 5) la presencia de lesiones activas de la inflamación crónica, daño de la mucosa y los efectos quimiotácticos de la otra H. pylori
proteínas en el
entorno.

Al considerar posible reactividad cruzada de otras bacterias invasivas, como C. jejuni
, hemos probado H. pylori
CIE contra 8 muestras de C. jejuni
sueros de pacientes enteritis y encontró que lo hizo no una reacción cruzada significativa (datos no mostrados). El H. pylori
estado de libertad de nuestro C. jejuni
pacientes positivos se determinó en base a la ausencia de síntomas de indigestión, dolor de estómago y acidez, etc. Sin embargo, dado que sólo se utilizaron muestras de suero limitados de C. jejuni
pacientes, no se inclinan a la marca H. pylori
ICD como un antígeno de diagnóstico independiente. No obstante, C. jejuni
no siempre puede comprender un fondo mucho más competitiva a menos que C. jejuni
propios pacientes están clínicamente colonizadas por H. pylori
o viceversa.

Finalmente, los prometedores resultados que obtienen en términos de respuestas humorales significativas a H. pylori
CIE no puede ser interpretado como de aplicación inmediata para el diagnóstico sobre el terreno. No obstante, es posible que nuestros resultados proporcionan una base sólida para el desarrollo de una prueba serológica para el diagnóstico de H. pylori servicios asociados patologías gastroduodenales. Sugerimos el potencial de este antígeno y sus péptidos específicos de epítopo puede además ser analizada mediante el uso de una gran batería de muestras de suero que representan diferentes sujetos con enfermedad. Del mismo modo, el estado y la importancia de los anticuerpos de reacción cruzada en el suero correspondiente a enfermedades causadas por bacterias tales como Salmonella spp., Shigella spp. y otros enteropatógenos invasivos también podrían ser determinados. Será que vale la pena explorar en profundidad la participación de la CIE en las actividades de señalización en el espacio submucoso, especialmente su interacción con los macrófagos y los linfocitos activados. Además, dada su importante papel en el ciclo del ácido tricarboxílico y la ausencia de shunt glioxilato en H. pylori
[27], la evaluación de la CIE como un posible objetivo de intervención plantea una propuesta muy interesante.

Materiales y Métodos

En antigenicidad in silico de predicción H. pylori CIE (HP0023)

secuencia de nucleótidos del H. pylori icd
(ORF HP0023) y la correspondiente secuencia de aminoácidos se obtuvo de la base de datos Pylorigene (http://genolist.pasteur.fr) y se sometió a análisis por DNAStar paquete (DNAStar Inc. Madison, EE.UU.). secuencia de aminoácidos de la CIE se sometió al escrutinio de las determinantes antigénicos usando el programa Protean dentro del paquete DNAStar. Parámetros tales como hidrofilicidad, probabilidad de superficie y el índice antigénico se calcularon para toda la proteína utilizando este software. índices antigénicos que muestran más de 2 picos a > 3,0 escalas se consideraron como significativamente más antigénico

modelación computacional de la estructura de la CIE

Uso Modeller-6, un programa de modelado molecular que implementa un enfoque automatizado. para el modelado comparativo estructura de la proteína por la satisfacción de las restricciones espaciales [28] se utilizó para determinar el modelo tridimensional de H. pylori
CIE. El modelo ICD de H. pylori
se genera en función del E. coli
CIE plantilla 1a12 que comparte la identidad de secuencia global de 68% con el H. pylori
CIE.

Producción de recombinante de H. pylori CIE

El ORF correspondiente a H. pylori icd
(HP0023, 1,275 kb) se amplificó por PCR a partir del ADN genómico de un H. pylori
paciente aislar MS8. La proteína recombinante fue ICD expresa en más E. coli
y purificado hasta la homogeneidad (Figura 2) de acuerdo con los métodos descritos anteriormente por Banerjee et al
[24]. La cosecha de la proteína purificada se estandarizó hasta 2,0 mg de proteína purificada por 500 ml de a partir de la cultura recombinante E. coli
. La proteína recombinante purificada se dializó contra 20 mM Tris HCl, pH 7,5, con NaCl 100 mM y 3% de glicerol. Además, la proteína purificada se trató con polimixina B para descartar efectos de cualquier contaminación LPS. El ICD recombinante purificada se liofilizó y se almacenó congelado inmediatamente aguas abajo para su uso en el diagnóstico clínico.

Pacientes y muestras de suero humano

La población de estudio ( n = 82)
comprendía 58 H. pylori
muestras de pacientes infectados (para más detalles del número de casos analizados en cada categoría, por favor véase la Figura 3) obtenidos a partir de los casos que informaron sobre todo al Colegio Deccan de Ciencias Médicas y Hospitales aliadas, (MCD), Hyderabad, y 24 clínicamente sanos donantes. El grupo de control sano se compone de 18 probada H. pylori
casos negativos probados con Urea Breath Ensayo (UBA) y 6 individuos asintomáticos que fueron confirmados H. pylori negativo
como prueba de ELISA disponible en el mercado kit (Pyloriset EIA-GIII, Orion, Espoo, Finlandia). En todos los grupos de pacientes, el diagnóstico de úlcera o gastritis fue confirmada o descartada por endoscopia por el gastroenterólogo tratante. La presencia de H. pylori Hoteles en sujetos enfermos incluidos en este estudio fue confirmado previamente por la tinción de Gram, una prueba rápida de ureasa (RUT), 16S rRNA y cag
Un gen PCR y la cultura [29] Sobre la base. La población del estudio tenía ningún sesgo sexo o edad. consentimientos informados escritos fueron obtenidos de todos los pacientes y controles sanos en los centros respectivos.

ELISA para las respuestas humorales
ensayo

ELISA se realizó para comprobar la respuesta inmune humoral en humanos contra la CIE recombinante. Brevemente, las placas de microtitulación de 96 pocillos se recubrieron con ~ 500 ng de la proteína ICD recombinante. Las placas recubiertas se incubaron durante la noche a 4 ° C, se lavaron tres veces con PBS-T (0,05% de Tween 20 en PBS 1X) y dos veces con PBS. Las placas se bloquearon a continuación con 100 l de tampón de bloqueo (BSA al 2% en 1 x PBS) a 37 ° C durante 2 horas. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado PBS-T y dos veces con PBS. El H. pylori
suero humano infectado con pertenecer a diferentes grupos clínicos se diluyeron en serie (1:50, 1:100, 1:200 y 1:400) en tampón de bloqueo (BSA al 1% en PBS), para obtener títulos óptimos. sueros diluidos [50 l de suero diluido 1:200] se añadieron a los pocillos recubiertos de antígeno y se incubó durante 1 hora a 37 ° C. Las placas se enjuagaron tres veces con PBS-T y dos veces con PBS y se incubaron adicionalmente con anti-IgG humana-peroxidasa de rábano (Sigma) a 37 ° C durante 1 hr. Se detectó actividad de peroxidasa de rábano picante usando una sustancia cromogénica, o
fenilendiamina tetrahidrocloruro (Sigma) en tampón citrato-fosfato (pH 5,4) y H _{2O 2 como 1 l /ml. Las reacciones se detuvieron mediante el uso de 0,5 M H 2SO 4, y los valores de absorbancia se midieron a 492 nm en un lector de ELISA (Bio-Rad). Cada ELISA se repitió al menos dos veces con todos los aislados de suero clínicos. Estudiante de t
prueba se realizó para calcular valores de p
basados ​​en las medias de los títulos de anticuerpos en suero correspondientes a las clases sanos e infectados por el uso de la calculadora científica en línea de GraphPad (www.graphpad.com_quickcalcs_ttest1 .cfm). P
los valores inferiores a 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.}

ELISA para citoquinas proinflamatorias IL-8

THP-1 células (monocitos humanos, ATCC TIB 202) y se cultivaron mantenido en medio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con suero bovino fetal 10%, glutamina 2 mM y solución de 1% antibacteriano y anti-micótico (Gibco). Para macrófagos como etapa, aproximadamente 1 × 10 ^{-6 células /pocillo se diferenciaron utilizando 5 ng /ml de forbol-miristato 12 acetato de 13c (PMA, Sigma). Después de 24 horas, las células se lavaron una vez con medio RPMI 1640 y se estimularon con 10 g /ml de ICD recombinante. Una proteína proinflamatoria, HP940, de H. pylori
[30], se purificaron en condiciones similares se utilizó como control positivo (1 ug /ml). Las células se incubaron durante 24 horas en una atmósfera humidificada a 37 ° C. Las células sin tratamiento con proteína (células no estimuladas) sirvieron como control negativo. sobrenadante de cultivo recogido después de que se utilizan 24 horas para la estimación de IL-8 usando el disponible comercialmente Kit ELISA OptEIA (BD Biosciences). El ensayo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante y los niveles de citoquinas se calcularon utilizando el estándar recombinante proporcionado en el kit. La sensibilidad de IL-8 fue 3,1 pg /ml. Los valores se expresan como media ± desviación estándar.}

Reconocimientos

Estamos muy agradecidos a Seyed E. Hasnain y Sharmistha Banerjee para las discusiones. Agradecemos a nuestros colaboradores CM Habibullah y Barik Un Salih ayuda en material del paciente y la información. Gracias también a Francis Megraud para proporcionar diversas muestras de suero de control. NA es el miembro correspondiente del Grupo de Estudio Europeo sobre el Helicobacter (EHSG).

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