PLoS ONE: izocitrato dehidrogenazės Helicobacter pylori potencialiai sukelia humoralinį imuninį atsaką Asmenų, sergančių dvylikapirštės žarnos opa ir Gastritis

Anotacija

Fonas

H. pylori
sukelia gastritą ir skrandžio opos ir yra rizikos veiksnys skrandžio vėžio vystymosi. Daugelis baltymų, pavyzdžiui, ureazės, Porins, flagellins ir toksinų, tokių kaip Lipo-polisacharidų buvo nustatyti kaip potencialūs virulentiškumo veiksnių, kurie indukuoja prouždegiminių reakciją. Mes pranešti imunogenines potencialą izocitrato dehidrogenazės (TLK), svarbiu namas palaikymo baltymų H. pylori
.

metodika /Pagrindinis išvados

aminorūgščių sekos H. pylori
TLK buvo atliktas silikochromatas pervežimas analizės regionuose, nuspėjamai aukštų antigeno indeksų. Be to, skaičiavimo modeliavimas H. pylori
ICD kaip greta į E. coli
TLK buvo atliekamas siekiant nustatyti lygius struktūros panašumo ir paviršinių veikiami motyvų prieinamumą, jei tokių yra. TLK
genas buvo klonuotas, išreikštas ir išgrynintas iki labai aukšto homogeniškumo. Humoralinį atsaką nukreiptas prieš H. pylori
TLK buvo aptiktas per IMUNOFERMENTINĖS analize (ELISA) 82 žmogaus organizmui, kurį sudaro 58 pacientams, sergantiems H. pylori
susijęs gastritas arba opa ir 24 besimptomis sveikų. h. pylori
TLK sukėlė potencialiai aukštą humoralinį imuninį atsaką ir atskleidė aukštus antikūnų titrai serume atitinkančius endoskopijos patvirtintas gastritas ir opaligė dalykų. Tačiau karbamido kvapą bandymų neigiamas sveikas kontroliniai mėginiai ir besimptomis kontroliniai mėginiai neparodė jokių aptikti imuninį atsaką. ELISA už prouždegiminių citokinų IL-8 ir nebuvo eksponuoti jokios reikšmingos prouždegiminių veiklą TLK.

Išvados /Reikšmė

TLK iš H. pylori
yra imunogene kuris sąveikauja su priimančiąja imuninę sistemą po to, galimos autolytic-išleidimo į aplinką ir tokiu būdu žymiai priverčia humoralinį atsaką asmenims su invaziniu H. pylori
infekcija. Tačiau TLK negalėjo reikšmingai paskatinti IL8 indukcijos kultūringai makrofagų ląstelių linijos (THP1), todėl negali būti pastebimas priešuždegiminiais agentas

nurodomoji dalis:. Hussain MA, Naveed SA Sechi TA, Ranjan S Alvi A, Achmed I ir kt. (2008) izocitrato dehidrogenazės iš Helicobacter pylori
potencialiai sukelia humoralinį imuninį atsaką Asmenų, sergančių dvylikapirštės žarnos opa ir gastritas. PLoS ONE 3 (1): e1481. Doi: 10,1371 /journal.pone.0001481

Akademinė redaktorius: Keertan Dheda, University College London, Jungtinė Karalystė

Įstojo: rugpjūčio 29, 2007; Priėmė: Gruodžio 24, 2007 m Paskelbta: Sausis 23, 2008

Visos teisės saugomos: © 2008 Hussain et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Finansavimas iš CDFD Core Dotacijos (Dept biotechnologijos, Indijos vyriausybė)

konkuruojančių interesų. autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Helicobacter pylori
yra gramneigiamos, lenktas bakterija, kuri nustato, lėtinių infekcijų žmogaus skrandį. Ji yra svarbus patogenas, kad yra manoma, kad bendrai keitėsi su žmonėms [1], [2]. Jis gyvena maždaug pusė pasaulio gyventojų ir yra laikomas kaip potencialus rizikos veiksnys skrandžio adenokarcinoma [3] plėtrai. h. pylori
yra pripažintas priežastis lėtinis gastritas, pepsinė opa, skrandžio karcinoma, ir gleivinė limfoidinis audinys (SALYKLAS) limfoma. buvo pasiūlyta keletas mechanizmų paaiškinti savo vaidmenį patogenezę žarnyne. Nepaisant didelių kolonizacijos normos tik nedidelė poaibis užsikrėtusių žmonių patirtis H. pylori
-associated ligos [2]. Asociacijos H. pylori
su liga konkrečių veiksnių išliko daugiau ar mažiau mįslingas nors genomo sekos buvo iššifruoti beveik prieš dešimtmetį [2].

Vienas iš ryškiausių bruožų H. pylori
yra genetinė įvairovė tarp klinikinių izoliatų, gautų skirtingų pacientų grupėms [3]. Išdėstymas nauja redakcija genomo yra norma su šios bakterijos, sukurti taip daug alelių ir fazės kitimo daug [3], kelia sunkumų diagnostikai ir vakcinoms kurti.

Kai įsigijo, infekcija išsilaiko metus ir, priverčia aptikti imuninį atsaką infekuotų asmenų [4], [5] pasižymi padidėjusiu specifinių IgG ir IgA serume ir gausinimą sekretuojančia IgA ir IgM skrandžio [6]. Todėl, neinvaziniai PPM serologiniai tyrimai buvo rekomenduojama ir sukūrė už H diagnozę. pylori
infekcija. Tarp jų, imunofermentinės analizės (IFA) yra vienas iš labiausiai plačiai naudojamas metodas, nes yra gana prieinamą, greitai, paprasta atlikti, ir gali būti lengvai priimtos atrankos didelį skaičių mėginių [7]. Exploring anti H. pylori
antikūnai yra dažnai skiriami prieš endoskopiją arba prieš pradedant gydymą. Nors dėl imunologinės atminties, serodiagnosis negali būti teikiama pirmenybė patikrinti sėkmę ar rezultato likvidavimo gydymo, jis lieka pasirinkimas kaip jautrus metodas tikriausiai, nes jos neinvaziniai pobūdžio [8].

Šiuo metu nebuvo nei vienos "aukso standartas" antigenas, kuris vienareikšmiškai gali būti naudojamas visose populiacijose. Vienas iš svarbiausių priežasčių, dėl kurių tai gali būti neeilinis įvairovė esantis H. pylori
[9] - [13] ir taip pat jo specialiai pritaikyti skirtingų kompiuterių [12], [13]. Nors baltymai, pvz Katalazė, GRO
EL, ir flagelino tvirtai imunogeniška, jie suteikia nespecifinių kryžmines reakcijas su kitais gramneigiamų bakterijų ir ypač Campylobacter jejuni
[14], [15]. Priešingai, virulentiškumo susijęs antigenai, pvz CagA ar Vaca, rodo gana aukštą sekos kintamumo, nes egzistuoja H. pylori
padermės, kurios genetiškai įvairus ir fenotipą kintamasis vienos ar abiejų antigenų [16] - [18]. Nepaisant to, patenkinami asociacijos tarp antikūnų kraujo serume ir invazinės ligos buvo aprašyta [19].

Namų ūkis genai H. pylori
buvo naudojamas neseniai sekti gyventojų migraciją ir buvo nustatyta, kad stabilus genomo visoje amžių [20]. Tačiau namų ruošos baltymai, nebuvo išbandytas ir didelis jų naudojimo diagnostikos ar vakcinomis. Metaboliniai fermentai, atrodo, būti geras kandidatas turi būti įtrauktos į immunodiagnostycznej tyrimo rinkinio, nes jie dažnai neturi kryžmiškai reaguoja su serumu sveikų [21]. Taip pat, atsižvelgiant į savo namų ūkio funkcija, jie yra labai konservatyvi, tai skirtingų H. pylori
padermės nepriklausomai nuo jų genotipų ir todėl gali tarnauti kaip idealus immunodiagnostycznej kandidatus.

baltymai, kurie atleidžiami nuo bakterijų pabaigoje logaritminis augimo etape, pavyzdžiui, superoksido dismutazės ir izocitrato dehidrogenazės (TLK), yra apibūdinamas kaip autolizė žymenų [22] - [24] ir kai kurie iš jų buvo įrodyta, kad būti puikūs diagnostikos antigenai. Pavyzdžiui, TLK iš M. tuberkuliozės
buvo aprašytas kaip potencialus antigeno diskriminuoti plaučių tuberkulioze pacientai sveikų [24]. Tačiau ankstesni palyginimai su antigeno modelius H. pylori
baltymų (įskaitant kai kuriuos namų ruošos baltymų) ligonių serumo pripažintos neatskleidė konkrečių H asociacija. pylori
antigenai su atvejais ypač skrandžio patologijos [21].

Šis tyrimas parodo sąveiką priimančiosios imuninės sistemos su H. pylori
ICD esant reikšmingiems humoralinių atsakymų matyti liga tiriamųjų forma. Be to, mes aprašome H. pylori
TLK antigenas atskirti opa ir gastritu pacientus nuo sveikų sveikų asmenų.

Rezultatai

in silico modeliavimo, saviraiškos ir valymo H. pylori TLK baltymų

baltymų sekos TLK yra H. pylori
buvo analizuojami prognozuoti savo imunogeniškumo remiantis antigeno indeksas, hidrofiliškumą ir paviršiaus tikimybė. 1A pav rodo silikochromatas pervežimas antigeno profilių TLK generuojami naudojant Protean programinę įrangą (DNAStar Inc JAV). Trumpai tariant, buvo nustatyti keli pėdsakai atitinkantys imunoreaktyviųjų amino rūgščių motyvai su nuspėjamai aukštojo antigeno indeksų (~3.4). h. taip pylori
TLK rodomas didelių antigeninėmis ruožai (1A pav) paskatino mus pažvelgti į tai, kaip putatively imunologiniame baltymų. Į Antigeniškumas indeksai TLK buvo panašūs į anksčiau nustatytą AAP antigeno Rv2430c nuo mikobakterijų kilmės, kuris buvo toliau pasirodė esąs imunodominuojantis antigeno [25]. El. coli
TLK taip pat buvo analizuojami panašiai ir atrodė putatively imunogeniška; ten buvo aiškus skirtumas rastas, palyginti su H. pylori
ICD, kiek tai susiję su gausa ir antigeno likučių poziciją. Vėliau mes sukonstravo Homologijos modelį H. pylori
TLK remiasi kristalinės struktūros E. coli
TLK (PBP kodas 1AI2) ir galėjo vaizduoti stuburą organizavimą H. Pylori
(26.695) TLK kartu su, kad E. coli
. Buvo nustatyta, kad du ICDS būti gerokai panašus (RMS Nuokrypis 0,45) dar skyrėsi atsižvelgiant į 3 svarbi paviršinių veikiami kilpa regionams, kurie gali kelti struktūrinių skirtumų, atitinkančių tariamų antigeno epitopq, galbūt perteikiant skirtumas antikūnų atsakas sritis (1B pav )

per-išreikštas N-terminalas His-tagowaniem TLK buvo gryninamas į >. 95% homogeniškumo ant nikelio afininės skiltyje (2 pav.) Molekulinė masė rekombinantinio TLK buvo nustatyta, kad 47 kDa. Baltymų gryninimas buvo atliktas pagal natūralioms sąlygoms su 2,0 mg baltymų vienam 500 ml pradžios kultūros derlius.

Sąveika H. pylori TLK su žmogaus imuninės sistemos

humoralinį imuninis atsakas nukreiptas prieš H. pylori
TLK buvo palyginti tarp pacientų, kuriems H. pylori
infekcija (gastritas, nud, DU ir GC) ir sveikų (3 paveikslas). Kad reaktyvumas duomenys buvo statistiškai analizuojami ir lyginami su prijungimo prie tiek užkrėsto ir sveiką serumais. Šie duomenys parodė, kad iš visų užsikrėtusių pacientų, priklausančių gastritas ir dvylikapirštės žarnos opa serumai (DU) kategorijos atlikti statistiškai reikšmingas ( P
< 0,0001) anti TLK antikūnų lygis, palyginti su tų, iš sveikų. Taigi TLK baltymas, kurio, matyt, svarbus medžiagų apykaitos vaidmenį buvo nustatyta, kad būtų galima išsiaiškinti tvirtą humoralinį atsaką, kuriems yra gastritas ir DU. Tačiau tais atvejais, kai ne opa dispepsija (nud) ir skrandžio vėžio (GC), sumažėjęs humoralinis atsakas buvo vertinamas. Atsižvelgiant į šias pastabas, tai tikėtina, kad TLK baltymų išsiskyrimas susijęs su aktyvus, h. pylori
infekcija. Priešingai stebimų humoralinių atsakymų, rekombinantinis, H. pylori
TLK nesukėlė jokių didelių ląstelinį imuninį atsaką, kaip matyti iš sekrecijos IL-8 nuo žmogaus makrofagų sukeltų rekombinantiniu O trūkumo. pylori
TLK in vitro
(4 paveikslas). Todėl, rodo, kad TLK jaudina tik humoralinį skyrių ir negali prisidėti prie skrandžio patologijos ar citokinų sukeltų pokyčių skrandžio fiziologija.

Diskusijos

identifikavimas ir charakterizavimas labai imunologiniame H. pylori
baltymai yra privalomas reikalavimas dėl serologinių tyrimų, remiantis rekombinantinių išgrynintų antigenų plėtrą. Kartu su karbamido iškvepiamo oro testu, serologiniai yra neinvazinis metodas aptikti H. Helicobacter pylori infekcija
, ir keletas serologinis tyrimas rinkiniai remiantis daug įvairių H. pylori
antigenai yra komerciškai prieinamas. Nors humoralinį imuninį atsaką į H. pylori
atrodo gana įvairi, deriniai dažnai pripažintų antigenų galėtų būti naudingas ir diagnostikos tikslais [21]. Metaboliniai fermentai, pvz TLK atrodo geri kandidatai būti išnaudotas serologiniams Test Kit plėtros daugiausia, nes jie ne kryžmiškai reaguoja su serumu ne užkrėstos arba sveikų asmenų [24].

Daugelio reikšmė imunogeniniai baltymai H. pylori
įskaitant kai medžiagų apykaitos fermentai nebuvo vertinama daug klinikinių mėginių ankstesnėje proteomiką atliktame tyrime [21]. Tačiau mūsų tyrimas buvo nukreiptas įvertinti išgrynintas rekombinantinis H. pylori
ICD savo imunologinių savybių skirtingų klasių H. pylori
užsikrėtę rūgšties virškinimu liga sergančių pacientų. Mes bandėme sistemingai išnagrinėti buvimą ir naudingumą imuninis atsakas į TLK baltymų H. pylori
infekuotiems pacientams.

Mūsų analizė naudojant rekombinacinės ICD iš H. pylori
atskleidė žymiai aukštus antikūnų titrai tarp pepsinė opa ir gastritu pacientų, palyginti su nud ir vėžiu sergantiems pacientams (3 paveikslas). Mes spėlioti, kad imuninis atsakas pastebėtas pepsinė opa atvejais ir gastritas galbūt būti dėl didelių apkrovų bakterijų, susijusių su invaziniu patologijos ir taip didesniu skaičiumi suirusiuose patogenų ar patogenų keliančių ICD ant paviršiaus. Tai galbūt paaiškina santykinai aukšto antikūnų atsakas kategorijos pacientų invazinių.

h. pylori
antigenai yra aprašyta būti išleistas į tarpląstelinio erdvę per keletą mechanizmų, tokių kaip konkrečių sekrecijos būdais, autolizė ir formavimo membraninių pūslelių [23] ir paviršiaus savybių H. pylori
buvo siūloma būti unikalus todėl adsorbcija /paviršiaus lokalizacijos tokių baltymų [26]. ICDS tradiciškai žinomas kaip žymenų autolizė [22], [24], [27], išleista pabaigoje logaritminis etape. Ekstraląstelinė spaudai baltymų potencialiai gali būti vyksta tik per in vitro, pervežimas augimo H. pylori
. Tačiau vivo
buvimas tokių mechanizmų, jei įrodyta, galėtų paaiškinti įvairių sekretuojamą baltymų vaidmenį molekulinės patologijos opaligė. Iš H įrašas. pylori
baltymai į skrandžio gleivine erdvėje gali turėti svarbių funkcinių pasekmių, kaip antai skatinimo prouždegiminių ir chemotaksinio atsakymų per išleidimo citokinų nuo aktyvuotų makrofagų. Be to, Ekstraląstelinė spaudai ir ar adsorbcijos ar paviršius lokalizacija [26] potencialiai imunogeniškų baltymų gali padėti bakterijų strategiją nukreipti veiksmingą vietos imuninį atsaką [23]. Išlaikyti šiuos kelis mechanizmus galvoje, mes patikrinti prouždegiminių potencialą TLK su IL-8 ELISA tyrimo pagalba. Mūsų stebėjimo, TLK neturėjo reikšmingos sukelti IL-8 sekreciją diferencijuotų, išaugintų makrofagus. Tačiau, kadangi mes neanalizavo vaidmenį TLK Kalbant apie indukcijos kitų uždegimą sukeliančių citokinų, tokių kaip TNF-alfa ir IL1-beta, tai bus per anksti teisingai paneigti savo dalyvavimą skrandžio uždegimas.

pademonstruotą kad h. pylori
TLK priverčia humoralinį atsaką, mes ištirti imuninės specifiškumo šio baltymo pagrindą kaip atspindi struktūros modeliavimas. Mūsų seka analizuoja ir molekulinės modeliavimas H. pylori parsisiųsti ir El. coli
ICDS neatskleidė konstrukcinės sutapimų tarp dviejų (1 paveikslas); keliuose regionuose struktūrinių dissimilarities buvo išskirti, kuris galbūt sutampa su tariamų antigeno epitopq į H. pylori
ICD. Be problemų, susijusių su struktūrinių išsaugojimo ar įvairove, mes iškėlė hipotezę, kad aukštojo reaktyvumo H. pylori
ICD, palyginti su TLK dėl (simbiotinėje) E. coli
su priimančiąja imuninei sistemai vivo
gali būti susijęs su: 1) skirtingi invazijos iš H. pylori parsisiųsti ir El. coli
2) įvairios apimties bakterijų apkrova, apyvartos ir autolizė 3) skirtingą repertuarą antigenus pateikiančių ląstelių (makrofagų palyginti dendritų ląstelių) dalyvauja ir jų santykinė gausa 4) prieinamumo paviršinių veikiami epitopq į H. pylori
ICD (kaip tie pabrėžė 1B pav) ir 5) buvimas aktyvių pakitimų lėtinis uždegimas, gleivinės pažeidimo ir chemotaksinio poveikį Kita H. pylori
baltymų aplinkoje
.

Nors atsižvelgiant į galimus kryžminio reaktyvumo iš kitų invazinių bakterijų, tokių kaip C. jejuni
, mes patikrinome, H. pylori
ICD prieš 8 mėginiuose C. jejuni
enteritas pacientas serumai ir nustatė, kad ji nebuvo labai kryžminės reakcijos (duomenys neparodyti). h. pylori
nemokamai statusą mūsų C. jejuni
teigiamiems pacientams buvo nustatytas remiantis simptomų nevirškinimas, pilvo skausmas ir rėmuo ir tt Nesant Tačiau, kadangi mes naudojamas tik ribotas serumai mėginius iš C. jejuni
pacientai, mes nesame linkę markės H. pylori
ICD kaip atskirą diagnostikos antigenu. Nepaisant to, C. jejuni
ne visada gali apimti daug konkurencinį foną nebent C. jejuni
pacientai patys kliniškai kolonizavo H. pylori
arba atvirkščiai.

Galiausiai, daug žadantys rezultatai gavome požiūriu reikšmingų humoralinių atsakymų į H. pylori
TLK negali būti aiškinama kaip iš karto taikoma laukas lygio diagnozę. Nepaisant to, tai yra įmanoma, kad mūsų išvados suteikia tvirtą pamatą serologinei diagnostikos testą plėtros H. pylori
susijęs viršutinės virškinamojo trakto patologijos. Mes rodo, šio antigeno ir jos epitopas konkrečių peptidų Galimas tolesnis gali būti analizuojami naudojant didelę baterijos serumo mėginių, atstovaujančių skirtingas ligos dalykus. Be to, statusas ir reikšmė kryžminių reakcijų serume atitinkantis ligų sukelia bakterijos, pavyzdžiui, Salmonella spp., Shigella spp. ir kitos invazinės enteropatogenų taip pat gali būti nustatyta. Tai bus naudinga ištirti nuodugniai į TLK dalyvavimą signalizacijos veiklą gleivine erdvėje, specialiai jo sąveika su aktyvuota makrofagų ir limfocitų. Taip pat, atsižvelgiant į jo svarbų vaidmenį trikarboksirūgšties ciklą ir glioksilato šunto į nebuvimą h. pylori
[27], iš TLK vertinimas kaip įmanoma intervencinės tikslą kelia įdomų pasiūlymą.

Medžiagos ir metodai

in silico antigeniškumo numatomomis H. pylori TLK (HP0023)

nukleotidų seka H. pylori icd
(ORF HP0023), o atitinkamas aminorūgščių seka buvo gauta iš Pylorigene duomenų bazėje (http://genolist.pasteur.fr) ir buvo atliktas analizės DNAStar paketo (DNAStar Inc Madison, JAV). Aminorūgščių seka TLK buvo atliktas tikrinimu bet antigeno veiksnių naudojant Protean programą pagal DNAStar paketą. Parametrus, tokius kaip hidrofiliškumą, paviršiaus tikimybės ir antigeno indeksas buvo skaičiuojamas už visą baltymų, naudojant šią programinę įrangą. Antigeninė indeksai, rodantys daugiau nei 2 pikus > 3,0 svarstyklės buvo laikomas žymiai antigeno

Kompiuterinė modeliavimas TLK struktūros

Naudojant modeliuotojas-6, molekulinis modeliavimas programa, kuri įgyvendina automatizuota požiūris. lyginamajai baltymų struktūros modeliavimas pasitenkinimo erdvinių atramų [28] buvo naudojamas nustatant trimatę modelį H. pylori
ICD. ICD modelis H. pylori
buvo sukurtas remiantis E. coli
TLK šablonas 1A12, kuri dalijasi bendrą 68% sekos identiškumą su H. pylori
ICD.

Gamybos rekombinantinis H. pylori TLK

ORF atitinkantis h. pylori TLK
(HP0023, 1,275 KB) sustiprino PGR iš genomo DNR yra H. pylori
pacientas izoliuoti MS8. Rekombinantinis TLK baltymų baigėsi išreikštas E. coli, parsisiųsti ir išgrynintas homogeniškumą (2 paveikslas), atsižvelgiant į metodų anksčiau aprašytų Banerjee ir kt
[24]. Išgryninto baltymo derlius buvo standartizuotas iki 2,0 mg išgryninto baltymų vienam 500 ml pradedant kultūrą rekombinantinio E. coli
. Išgrynintas rekombinantinis baltymas buvo dializuojamas 20 mM Tris HCl, pH 7,5, su 100 mM NaCl ir 3% glicerolio. Be to, išgrynintas baltymas buvo gydomi polimiksiną B atmesti galimybės, kad bet kuriuo LPS užteršimo. Išvalytas rekombinantinis TLK buvo liofilizuotas ir iš karto saugomi užšaldyti pasroviui naudoti klinikinės diagnozės.

Pacientai ir žmogaus serumo mėginiai

Tyrimas gyventojų ( N
= 82) sudarė 58 h. pylori
užsikrėtę pacientų mėginius (daugiau informacijos apie tirtų kiekvienoje kategorijoje atvejais, žr 3 pav), gautų iš atvejais ataskaitų daugiausia Dekano koledžo medicinos mokslų ir sąjungininkų ligoninėse (DCMS), Hyderabad, ir 24 kliniškai sveiki donorais. Sveiki kontrolinės grupės sudarė 18 įrodytą H. pylori
neigiami atvejai išbandyta su šlapalo kvėpavimo tyrimas (UBA) ir 6 besimptomis asmenų, kurie patvirtino H. pylori
neigiami išbandė komerciškai prieinamų ELISA rinkinys (Pyloriset PAV GIII, Orion, Espo, Suomija). Visose pacientų grupėmis, diagnozė opa arba gastritas buvo patvirtinti arba paneigti endoskopija gydantysis gastroenterologas. Iš H buvimas. pylori
sergančių dalykų įtraukti į šį tyrimą buvo anksčiau patvirtino gramą anketa dažymo, greitas ureazės testas (RUT), 16S rRNR ir PVG
Genų pagrįstos PGR reakcijų ir kultūra [29]. Tyrimas gyventojų neturėjo lyties ar amžiaus šališkumo. Rašytiniai informuoti sutikimai gauti iš visų pacientų ir sveikų bent atitinkamų centrų.

ELISA humoralinių atsakymai

IFA buvo atliekama siekiant patikrinti humoralinį imuninį atsaką žmonėms prieš rekombinantinio TLK. Trumpai, 96-ių šulinėlių mikrotitravimo plokštelės buvo padengtas ~500 ng rekombinantinio ICD baltymų. Šios dengtos plokštelės buvo inkubuojami per naktį 4 ° C, tris kartus plaunamos PBS-T (0,05% Tween 20 1 × PBS) ir du kartus su PBS. tada plokštės buvo blokuotos 100 pL su blokuojančiu buferiu (2% BSA 1 × PBS) 37 ° C temperatūroje 2 val. Plokštelės tris kartus buvo plaunamos su plovimo buferio PBS-T ir du kartus su PBS. h. pylori
-infected žmogaus serumai priklausančių skirtingoms klinikinių grupių buvo serijiniu praskiesti (01:50, 1:100, 1:200 ir 1:400) blokuojančiu buferiu (1% BSA PBS), gauti optimalius titrai. Atskiesti serumai [50 pL 1:200 praskiestų serumo] buvo pridėti prie antigeno dengtos duobutes 1 val 37 ° C temperatūroje. Plokštelės buvo skalaujamas tris kartus su PBS-T ir du kartus su PBS ir toliau inkubuojami su anti-žmogaus IgG krienų peroksidazės (Sigma), esant 37 ° C temperatūroje 1 val. Krienų peroksidazės aktyvumas buvo aptiktas naudojant chromogeniniais medžiaga O
-phenylenediamine tetrahidrochlorido ( "Sigma) yra citrato-fosfato buferyje (pH 5,4) ir H _{2O 2 kaip 1 mikrol /ml. Reakcija stabdoma naudojant 0,5 M H 2SO tirpale 4, ir kad optinio tankio vertės buvo matuojamas prie 492 nm bangos ilgiui, ELISA skaitytuvu (Bio-Rad). Kiekvienas IFA buvo pakartoti bent du kartus su visais klinikiniais serumo izoliatų. Studento , T
bandymas buvo atliktas apskaičiuoti P
vertės grindžiamos serumo antikūnų titras, atitinkančių sveikų ir užsikrėtusius klases, naudojant internetinę mokslo skaičiuoklė GraphPad priemonėmis (www.graphpad.com_quickcalcs_ttest1 Cfm). P
vertes, mažesnes 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas.}

ELISA prouždegiminių citokinų IL-8

THP-1 ląstelių (žmogaus Monocitų, ATCC TIB 202) buvo auginami ir palaikoma RPMI 1640 (Invitrogen) papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo, 2 mM glutaminu ir 1% antibakterinis ir anti-mycotic tirpalo (Gibco). Dėl makrofagų kaip stadijoje, maždaug 1 × 10 ^{-6 ląstelių /gerai buvo diferencijuojami naudojant 5 ng /ml Phorbol-12 miristatas 13C acetato (PMA, Sigma). Po 24 valandų, ląstelės buvo plaunamas vieną kartą RPMI 1640 laikmenos ir stimuliuojama naudojant 10 mikrogramų /ml rekombinantinio TLK. Prouždegiminių baltymai, HP940, iš H. pylori
[30], išgrynintas panašiomis sąlygomis buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė (1 ug /ml). Ląstelės buvo inkubuojamos 24 valandas drėgmėje, atmosferoje 37 ° C temperatūroje. Ląstelės, nepasižyminčios baltymų apdorojimo (Nestimuliuotų ląstelių) tarnavo kaip neigiama kontrolė. Kultūra supernatantas surinkti po 24 valandų buvo naudojamas IL-8 vertinimas naudojant komerciškai prieinamą optEIA ELISA komplektas (BD Biosciences). Tyrimas buvo atliekamas pagal gamintojo ir citokinų lygių nurodymą buvo apskaičiuotas naudojant rekombinantinio standartą rinkinyje tiekiamą. Jautrumas IL-8 buvo 3,1 pg /ml. Vertės buvo išreikštas vidurkis ± SD.}

Padėka

Esame dėkingi SEYED E. Hasnain ir Sharmistha Banerjee diskusijų. Dėkojame mūsų bendradarbių CM Habibullah ir Barik sala pagalbos dėl pacientų medžiagos ir informacijos. Ačiū taip pat dėl ​​to, Francis Megraud teikti įvairias kontrolinio serumo mėginius. NA atitinkamu bendradarbis Europos Helicobacter studijų grupės (EHSG).

• PLoS ONE: Bakterinė mikrofloros profiliavimo gastritas be Helicobacter pylori infekcijos ar nesteroidiniams priešuždegiminis vaistas Naudojimosi
• PLoS ONE: Asocijuotos veiksniai atrofijos gastritas diagnozuojama dukart Kontrastas viršutinės virškinimo trakto dalies bario X-Ray Radiography: skerspjūvio tyrimą, skirtą išanalizuoti 6,901 sv…