PLoS ONE: isositraattidehydrogenaasin Helicobacter pylori mahdollisesti indusoi humoraalisen immuunivasteen henkilöillä, joilla on mahahaavan ja gastriitti

tiivistelmä

Background

H. pylori
aiheuttaa gastriitti ja mahahaava ja on riskitekijä kehittämiseen mahalaukun syöpä. Monet proteiinit, kuten ureaasia, poriinit, flagelliinit ja toksiinit, kuten lipo-polysakkaridit ovat potentiaalisia virulenssitekijöitä, jotka aiheuttavat tulehdusta edistävien reaktion. Raportoimme immunogeeninen potentiaalit isositraattidehydrogenaasin (ICD), tärkeä talon pitäminen proteiinia H. pylori
.

Menetelmät /Principal Havainnot

aminohapposekvenssit H. pylori
ICD alistettiin in silico
analyysin alueilla, joilla ennustettavasti korkea antigeenisten indeksit. Myös laskennallinen mallinnus H. pylori
ICD kuin asetettu rinnakkain E. coli
ICD suoritettiin tasojen määrittämiseksi rakenteen samankaltaisuuden ja saatavuus pinnalla esillä motiiveja, jos sellaisia ​​on. icd
geeni kloonattiin, ilmennettiin ja puhdistettiin erittäin korkea homogeenisuus. Humoraalisen vasteen suunnattu H. pylori
ICD havaittiin läpi entsyymi immunologinen määritys (ELISA) 82 ihmiseen kohdistuvan koostuu 58 potilailla, joilla on H. pylori
liittyy gastriitti tai haavaumia tauti ja 24 oireeton terveillä verrokeilla. H. pylori
ICD esiin potentiaalisesti humoraalisen immuunivasteen ja paljasti korkeat vasta-ainetitterit seerumissa vastaa endoskooppisesti varmennettu gastriitti ja haavatauti aiheita. Kuitenkin urea-hengitys-testi negatiivinen terveillä verrokeilla näytteitä ja oireetonta kontrollinäytteiden ei paljastunut havaittava immuunivaste. ELISA for tulehdusta edistäviä sytokiini IL-8 eivät osoittaneet mitään merkittävää tulehdusta edistävä aktiivisuus ICD.

Johtopäätökset /merkitys

ICD on H. pylori
on immunogeeni, joka on vuorovaikutuksessa isännän immuunijärjestelmän myöhemmin mahdolliseen autolyyttistä vapauttava ja siten merkittävästi saa aikaan humoraalivasteiden yksilöiden invasiivisia H. pylori
infektio. Kuitenkin, ICD ei merkittävästi edistää IL8 induktio viljellyssä makrofagisolulinjassa (THP1), ja näin ollen ei voi olla merkittävä proinflammatorinen aine.

Citation: Hussain MA, Naveed SA, Sechi LA, Ranjan S, Alvi A Ahmed I, et al. (2008) isositraattidehydrogenaasin on Helicobacter pylori
mahdollisesti indusoi humoraalisen immuunivasteen henkilöillä, joilla on mahahaavan ja gastriitti. PLoS ONE 3 (1): e1481. doi: 10,1371 /journal.pone.0001481

Academic Editor: Keertan Dheda, University College London, Iso-Britannia

vastaanotettu: 29., 2007; Hyväksytty: 24 joulukuu 2007; Julkaistu: 23 tammikuu 2008

Copyright: © 2008 Hussain et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoitus CDFD Core Avustukset (Dept. of Biotechnology, Intian hallitus) B

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Helicobacter pylori
on gramnegatiivisen, kaareva bakteeri perustetaan kroonisia infektioita ihmisen vatsassa. Se on tärkeä taudinaiheuttaja, joka arvellaan yhteistyötä kehittynyt ihmisen kanssa [1], [2]. Se elää noin puolet maailman väestöstä ja pidetään mahdollisena riskitekijänä kehittämiseen mahalaukun adenokarsinoomaa [3]. H. pylori
on tunnustettu kroonisen gastriitin, mahahaavan, mahasyöpä ja limakalvo-liittyvässä imukudoksessa (MALT) lymfooma. Useita mekanismeja on ehdotettu selittämään rooliaan synnyssä suolistossa. Huolimatta suurista siirtokuntien hinnat vain pienessä määrässä tartunnan ihmiset kokevat H. pylori
-associated sairauksia [2]. Associations of H. pylori
tiettyyn tautiin ovat pysyneet enemmän tai vähemmän arvoituksellinen vaikka genomin sekvenssit avannut lähes vuosikymmen sitten [2].

Yksi erottavia piirteitä H. pylori
on geneettisen monimuotoisuuden välinen kliinisiä isolaatteja on saatu eri potilasryhmissä [3]. Uudelleenmuotoileminen genomi on normi kanssa tämän bakteerin, luoden näin paljon alleelista ja vaiheen vaihtelu [3], poseeraa vaikeuksia diagnosoinnin kehittämiseen ja rokotteiden.

Kun osti, infektio kestää vuosia ja, saa aikaan havaittava immuunivaste tartunnan saaneiden henkilöiden [4], [5] ominaista kohonneeseen IgG ja IgA seerumissa ja augmentation sekretorisen IgA ja IgM vatsassa [6]. Siksi noninvasive serologisia testejä suositeltiin ja kehitetty diagnosoinnissa H. pylori
infektio. Näistä entsyymi-immunologinen määritys (ELISA), on yksi laajimmin käytetty menetelmä, koska se on suhteellisen edullinen, nopea, yksinkertainen suorittaa, ja voidaan helposti hyväksytään seulontaan suuri määrä näytteitä [7]. Etsimiseksi anti H. pylori
vasta usein säädetään ennen tähystys tai ennen hoidon aloittamista. Vaikka takia immunologinen muisti, diagnostiikassa nähdään toisinaan ei saa edullista tarkistaa onnistumisen tai tuloksesta häätöhoidosta se on edelleen valinta herkkä menetelmä luultavasti koska sen ei-invasiivisia luonteeltaan [8].

Tällä hetkellä ei ole mitään yhtä "gold Standard" antigeeni, jota voidaan yksiselitteisesti käyttää kaikissa populaatioissa. Yksi tärkeä syy tähän voi olla poikkeuksellisen monimuotoisuuden läsnä H. pylori
[9] - [13] ja myös sen mukautumista eri isännät [12], [13]. Vaikka proteiineja, kuten katalaasi, gro
EL, ja flagelliini ovat voimakkaasti immunogeenisiä, ne antavat epäspesifinen ristireaktioita muiden Gram-negatiivisten bakteerien ja erityisesti, Campylobacter jejuni
[14], [15]. Sen sijaan, virulenssi liittyvät antigeenit, kuten CagA tai VacA, näyttää varsin korkea sekvenssin vaihtelevuus, koska on olemassa H. pylori
kantoja, jotka ovat geneettisesti monimuotoisia ja fenotyypiltään muuttuja toinen tai molemmat antigeenit [16] - [18]. Tästä huolimatta tyydyttävä yhdistysten välillä seerumin vasta-aineiden ja invasiivista tautia on kuvattu [19].

Housekeeping geenit H. pylori
on käytetty viime aikoina seurata väestöliikkeet ja havaittiin olevan stabiili genomin poikki vuosisatojen [20]. Taloudenhoito proteiineja kuitenkaan ole testattu ja suuret niiden käyttöä diagnostiikassa tai rokotteiden. Metabolinen entsyymit näyttävät olevan hyvä ehdokas sisällyttää osaksi immuniteettia diagnostinen testipakkaus, koska ne eivät useinkaan ristireagoi seerumit terveiden verrokkien [21]. Myös koska niiden taloudenhoito toiminto, ne ovat hyvin konservoitunut eri H. pylori
kantoja riippumatta niiden genotyyppien ja siten voivat toimia erinomaisesti immunologiseen diagnostisia ehdokkaita.

Proteiinit, joita vapautuu bakteereista aikana myöhäisessä logaritmisessa kasvuvaiheessa, kuten superoksididismutaasi ja isositraattidehydrogenaasin (ICD), ovat kuvata autolyysi markkereita [22] - [24], ja jotkut niistä ovat osoittautuneet erinomaisiksi diagnostinen antigeenejä. Esimerkiksi ICD on M. tuberkuloosi
on kuvattu mahdollisena antigeeninä syrjiä keuhkotuberkuloosi potilaita terveisiin kontrolleihin [24]. Kuitenkin aiemmat vertailut antigeenisen malleja H. pylori
proteiineja (mukaan lukien joitakin taloudenhoito proteiinit) tunnustettu potilaiden seerumit eivät paljastaneet yhdistys erityisiä H. pylori
antigeenejä tapauksia erityisen maha- patologian [21].

Tämä tutkimus osoittaa, vuorovaikutus isännän immuunijärjestelmän kanssa H. pylori
ICD muodossa merkittävien humoraalivasteiden nähty tauti aiheista. Lisäksi kuvaamme H. pylori
ICD antigeeni erottaa haavatauti ja gastriitti potilaiden infektoimattomilta terveitä yksilöitä.

Tulokset

In silico mallintaminen, ilmentyminen ja puhdistus H. pylori ICD proteiini

proteiinisekvenssiä ICD on H. pylori
analysoitiin ennustaa sen immunogeenisyyttä perustuu antigeenisyysindeksi, hydrofiilisyys ja pinnan todennäköisyys. Kuvio 1A esittää in silico
antigeeniprofiileissa ICD generoidaan käyttäen muuttuvaiseksi ohjelmistoa (DNAStar Inc. USA). Lyhyesti, useita jälkiä vastaa immunoreaktiivisia aminohapon motiivia kanssa ennustettavasti suurempi antigeenisiä indeksit (~3.4) tunnistettiin. H. pylori
ICD siten näy suuria antigeenisten osuuksilla (kuvio 1A) kannustavat katsomaan sitä oletettavasti immunogeeninen proteiini. Antigeenisyys indeksit ICD olivat verrattavissa aikaisemmin raportoitu PPE: antigeenin Rv2430c mykobakteeri alkuperää, joka on edelleen osoittautunut olevan immunodominantti antigeeni [25]. E. coli
ICD analysoitiin myös samalla tavalla, ja näytti olevan oletettavasti immunogeeninen; oli selkeä ero todettu verrattuna H. pylori
ICD, suhteessa runsautta ja sijainti antigeenisten jäämiä. Myöhemmin olemme rakentaneet homologia malli H. pylori
ICD perustuu kiderakenne E. coli
ICD (ATE koodi 1AI2) ja pystyivät kuvaamaan selkäranka järjestämiseen H. Pylori
(26695) ICD yhdessä, että on E. coli
. Kaksi ICDs todettiin olevan merkittävästi samankaltainen (RMS poikkeama 0,45) mutta erosivat suhteessa 3 tärkeitä pinnalla esillä silmukka-alueita, jotka muodostavat todennäköisesti alueilla rakenteellisia eroja vastaa oletetun antigeeniset epitoopit, mahdollisesti antamalla ero vasta-vasteita (kuvio 1 B ).

yli-ilmaistu N-terminaalinen His-ICD puhdistettiin, joka > 95% homogeenisuus on nikkeli-affiniteettipylvääseen (kuvio 2). Molekyylimassa rekombinantti ICD määritettiin 47 kDa. Proteiinin puhdistus suoritettiin natiivi olosuhteissa, jonka tuotto on 2,0 mg proteiinia per 500 ml alusta kulttuurin.

vuorovaikutus helikobakteeri ICD ihmisen immuunijärjestelmä

humoraalisia immuunivasteita suunnattu vastaan ​​ H. pylori
ICD verrattiin potilailla, joilla on H. pylori
infektio (gastriitti, NUD, DU ja GC) ja terveillä verrokeilla (kuva 3). Immunoreaktiivisuuden tiedot analysoitiin tilastollisesti ja verrattiin yhteydet molemmille tartunnan saaneiden ja terveiden seerumit. Nämä tiedot osoittivat, että seerumit kaikista tartunnan saaneiden potilaiden kuuluvat gastriitti ja pohjukaissuolihaava (DU) luokat suorittaa tilastollisesti merkitsevä ( P
< 0,0001) anti ICD vasta-ainetasot verrattuna kuin terveillä verrokeilla. ICD-proteiini, joka on ilmeisesti tärkeä osuus aineenvaihdunnassa, osoittautui pystyä tuomaan esiin vahvan humoraalisen vasteen henkilöillä, joilla gastriitti ja DU. Kuitenkin tapauksissa dyspepsia (NUD) ja mahasyövän (GC), vähentää humoraalinen vaste nähtiin. Näiden havaintojen, on todennäköistä, että vapauttaminen ICD proteiini liittyy aktiivinen, H. pylori
infektio. Toisin kuin havaittu humoraalivasteiden, rekombinantti, H. pylori
ICD ei aiheuttanut merkittäviä immuunivasteita osoituksena puutteesta erityksen IL-8 ihmisen makrofageissa indusoidun rekombinantti, H. pylori
ICD in vitro
(kuva 4). Siksi, viittaavat siihen, että ICD innostaa ainoastaan ​​humoraalisen lokero ja eivät saa osallistua mahalaukun patologian tai sytokiinin aiheuttamiin muutoksiin mahalaukun fysiologiassa.

Keskustelu

tunnistaminen ja luonnehdinta erittäin immunogeeninen H. pylori
proteiinit on pakollinen vaatimus kehittämiseen perustuvia serologisia testejä rekombinantti puhdistettuja antigeenejä. Yhdessä ureahengitystestiä, serologia on noninvasive lähestymistapaa havaitsemiseksi H. pylori
infektio, ja useat serologinen testikittejä perustuu moniin eri H. pylori
antigeenit ovat kaupallisesti saatavilla. Vaikka humoraalisen immuunivasteen H. pylori
näyttää olevan melko vaihteleva, yhdistelmät tunnistetaan usein antigeenejä voi osoittautua hyödylliseksi diagnostisiin tarkoituksiin [21]. Metabolinen entsyymit kuten ICD näyttävät olevan hyviä ehdokkaita voidaan valjastaa serologinen testi Kit kehittämistä lähinnä koska ne eivät ristireagoi sera ei-tartunnan tai terveillä yksilöillä [24].

merkitys monien immunogeenisiä proteiineja H. pylori
kuten jotkut metabolisia entsyymejä ei ole arvostettu paljon kliinisissä näytteissä aikaisemmassa proteomiikan perustuva tutkimus [21]. Tutkimuksemme oli kuitenkin suunnattu arvioimaan puhdistettua rekombinantti, H. pylori
ICD sen immunologisia ominaisuuksia eri luokkiin H. pylori
tartunnan happo maha- ja tautia sairastavilla potilailla. Yritimme systemaattisesti tutkia läsnäolon ja hyödyllisyyttä aikaansaamat immuunivasteet ICD proteiini H. pylori
tartunnan saaneilla potilailla.

analyysi yhdistelmä-ICD on H. pylori
paljasti huomattavan korkeita vasta-ainetiittereitä keskuudessa mahahaavan ja gastriitti potilailla, verrattuna NUD ja syöpäpotilailla (kuvio 3). Me spekuloida, että immuunivaste nähdään mahahaava tapauksissa ja gastriitti voitaisiin ehkä johtua korkeita kuormia bakteerien liittyy invasiivisia patologian ja siten suuremman määrän autolysoituneissa taudinaiheuttajia tai taudinaiheuttajien esittää ICD pinnalla. Tämä voi mahdollisesti selittää verrattain korkean vasta-ainevasteen invasiivisia luokkaan potilailla.

H. pylori
antigeenejä kuvataan vapautuvan solunulkoiseen tilaan kautta useita mekanismeja, kuten erityinen erityksen polkuja, autolyysin, ja muodostuminen kalvovesikkeleiden [23] ja pintaominaisuuksien H. pylori
on ehdotettu olevan ainutlaatuinen salliessaan adsorptio /pinta lokalisointi tällaisista proteiineista [26]. ICDs ovat perinteisesti tunnettu merkkiaineiden autolyysin [22], [24], [27], julkaistiin aikana myöhään logaritmisessa vaiheessa. Solunulkoiset vapautuminen proteiineja saattaa olla esiintyviä ainoastaan ​​ in vitro
kasvuun H. pylori
. Kuitenkin in vivo
tällaisista mekanismeista, jos osoittanut, ehkä selittää rooli eri eritettyjen proteiinien molekyyli- patologiaan haavatautiin. Merkintä H. pylori
proteiineja mahan limakalvon alaista tilaa saattaa olla merkittäviä toiminnallisia seurauksia, kuten edistäminen proinflammatoristen ja kemotaktinen vastauksia kautta sytokiinien aktivoiduista makrofageissa. Myös ekstrasellulaarista vapautumista ja tai adsorptio- tai pinta lokalisointi [26] mahdollisesti immunogeenisten proteiinien saattavat tukea bakteeri- strategiaa toisaalle tehokkaan paikallisen immuunivasteen [23]. Pitämällä nämä useita mekanismeja mielessä, pyysimme proinflammatoristen potentiaalit ICD avulla IL-8-ELISA-määrityksessä. Meidän havainto, ICD ei merkittävästi indusoi IL-8 eritystä eriytetty, viljellyissä makrofageja. Koska emme analysoi roolia ICD osalta induktion muiden proinflammatoristen sytokiinien, kuten TNF-α ja IL1-β, se on ennenaikaista oikeutetusti sulkea pois sen osallistumista mahalaukun tulehdus.

oltuaan että H. pylori
ICD herättää Humoraalivasteen, tutkimme perusteella immuuni erityispiirteenä proteiinin osoituksena rakenteen mallinnus. Meidän sekvenssianalyysit ja molekyylimallinnuksesta on H. pylori
ja E. coli
ICDs ei ilmennyt täydellistä rakenteellista päällekkäisyyksiä kahden (kuva 1); useita alueita rakenteellisten olosuhde oli havaittavissa jotka mahdollisesti vastaavat otaksuttu antigeeniset epitoopit H. pylori
ICD. Sen lisäksi, että kysymykset liittyvät rakenteellisiin säilyttämistä tai monimuotoisuuden oletamme, että korkeampi reaktiivisuus H. pylori
ICD verrattuna ICD of (kommensaalisissa) E. coli
kanssa isännän immuunijärjestelmän in vivo
voisi liittyä 1) eri invasiivisuus on H. pylori
ja E. coli
2) erisuuruisten bakteeri- kuormitus, liikevaihdon ja autolyysi 3) eri ohjelmistoon antigeeniä esittelevien solujen (makrofagien versus dendriittisolut) mukana ja niiden suhteellinen runsaus 4) saatavuus pinnalla esillä epitooppien H. pylori
ICD (kuin korostettu kuvio 1 B), ja 5) läsnäolo aktiivisia vauriot krooninen tulehdus, limakalvovauriot ja kemotaktinen vaikutukset muiden H. pylori
proteiinit miljöö
.

Vaikka harkitsee mahdollisia ristireaktiivisuutta muiden invasiivisia bakteerit, kuten C. jejuni
testasimme H. pylori
ICD vastaan ​​8 näytettä C. jejuni
suolitulehdusta potilaiden seerumit ja todennut, että se ei reagoi ristiin merkitsevästi (tuloksia ei ole esitetty). H. pylori
vapaa asema meidän C. jejuni
positiiviset potilaat määritettiin perustuen ilman oireita ruoansulatushäiriöt, vatsakipu ja närästys jne Koska käytimme vain rajoitetusti seeruminäytteitä C. jejuni
potilaat, emme ole taipuvaisia ​​brändin H. pylori
ICD erillisenä diagnostisen antigeenin. Siitä huolimatta, C. jejuni
ehkä aina sisältää paljon kilpailukykyinen tausta ellei C. jejuni
potilaat itse kliinisesti asuttaneet H. pylori
tai päinvastoin.

Lopuksi lupaavia tuloksia saimme kannalta merkittävien humoraalisia vasteita H. pylori
ICD ei saa tulkita välittömästi sovellettavissa kenttätasolla diagnoosia. On kuitenkin mahdollista, että havainnot tarjoavat hyvän pohjan kehittää sero-diagnostinen testi H. pylori
liittyvä maha- sairauksista. Ehdotamme mahdollisuuksia tämän antigeenin ja sen epitooppispesifisiä peptidejä voidaan lisäksi analysoitiin suuren akun seeruminäytteet edustavat eri sairaus aiheista. Samoin asemaa ja merkitystä rajat reagoivat vasta-aineita seerumista vastaa sairauksia bakteerien aiheuttamia, kuten Salmonella spp., Shigella spp. ja muut invasiiviset suolistopatogeenien voi määrittää. On syytä tutkia syvällistä osallistumista ICD signaloinnissa toimintaa submukosaalisen tilaan, erityisesti sen vuorovaikutus aktivoitujen makrofagien ja lymfosyyttien. Myös otetaan huomioon sen tärkeä rooli trikarboksyylihapposyklin ja puuttuminen glykoksylaattia shunttia H. pylori
[27], arviointi ICD mahdollisena toimenpideradiologian tavoite muodostaa jännittävän ehdotuksen.

Materiaalit ja menetelmät

In silico antigeenisyyttä ennustetun helikobakteeri ICD (HP0023)

nukleotidisekvenssi H. pylori icd
(ORF HP0023) ja vastaava aminohapposekvenssi saatiin Pylorigene tietokannasta (http://genolist.pasteur.fr) ja sille suoritettiin analyysi DNAStar paketti (DNAStar Inc. Madison, USA). Aminohapposekvenssi ICD saatettiin valvonnan mistään antigeenideterminantteja käyttäen muuttuvaiseksi ohjelman sisällä DNAStar paketti. Parametrit, kuten hydrofiilisyys, pinta todennäköisyys ja antigeenisyysindeksi laskettiin koko proteiinin Käyttämällä tätä ohjelmistoa. Antigeenisia indeksit osoittavat yli 2 piikit > 3,0 asteikot katsottiin merkittävästi antigeenisempi.

Computational mallintaminen ICD rakenne

Käyttämällä Modeller-6, joka on molekyylimallitus ohjelma, joka toteuttaa automaattisen lähestymistapa vertailevaan proteiinien rakenteeseen mallinnus tyydyttävällä paikkatietojen rajoitusten [28] käytettiin määritettäessä kolmiulotteisen mallin H. pylori
ICD. ICD-malli H. pylori
syntyi perustuu E. coli
ICD mallin 1A12 joka jakaa yleistä 68% sekvenssi-identiteetti H. pylori
ICD.

Rekombinantin H. pylori ICD

ORF vastaa H. pylori icd
(HP0023, 1,275 kb) monistettiin PCR: llä genomisesta DNA: sta H. pylori
potilaan eristää MS8. Rekombinantti ICD-proteiini oli yli ilmaistaan ​​ E. coli
ja puhdistettiin homogeeniseksi (kuvio 2) mukaisesti edellä kuvattujen menetelmien mukaan Banerjee et ai
[24]. Sato Puhdistettu proteiini standardoitu enintään 2,0 mg puhdistettua proteiinia per 500 ml lähtöviljelmää rekombinanttien E. coli
. Puhdistettu rekombinanttiproteiini dialysoitiin 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl: lla ja 3% glyserolia. Lisäksi, puhdistettu proteiini käsiteltiin polymyksiini B sulkea pois kaikki vaikutukset LPS-kontaminaation. Puhdistettu rekombinantti ICD lyofilisoitiin ja varastoitiin välittömästi jäädytettynä loppupään käytettäväksi kliininen diagnoosi.

Potilaiden ja ihmisseeruminäytteitä

Tutkimusaineiston ( n
= 82) koostui 58 H. pylori
tartunnan potilaan näytteitä (yksityiskohdat tapausten määrä analysoidaan kussakin luokassa, katso kuva 3) saatu tapausten raportoinnin pääasiassa Deccan College of Medical Sciences ja Allied sairaalat, (DCMS), Hyderabad, ja 24 kliinisesti terveitä luovuttajia. Terve kontrolliryhmä käsitti 18 osoittautunut H. pylori
negatiivinen tapauksissa testattu Urea hengityksen Pitoisuus (UBA) ja 6 oireettomilla henkilöillä, jotka olivat vahvistaneet H. pylori
negatiivinen testattiin kaupallisesti saatavilla ELISA Kit (Pyloriset EIA-GIII, Orion, Espoo, Suomi). Kaikissa potilasryhmissä, diagnoosi haavauma tai gastriitti on varmistaa tai sulkea pois endoskopialla hoitava gastroenterologist. Läsnäolo H. pylori
sairaassa aiheita mukana tässä tutkimuksessa on aiemmin vahvistettu gram-värjäys, nopean ureaasin testi (RUT), 16S rRNA ja CAG
geeniä perustuva PCR: ää ja kulttuuri [29]. Tutkimuksen populaatio ei ollut sukupuolen tai iän puolueellisuudesta. Kirjallinen tietoon perustuva suostumus saatiin kaikki potilaat ja terveillä verrokeilla vastaavissa keskuksissa.

ELISA humoraalivasteiden

ELISA-määritys suoritettiin tarkistaa humoraalisen immuunivasteen ihmisissä rekombinantti ICD. Lyhyesti, 96-kuoppaisia ​​mikrotiitterilevyjä päällystettiin ~500 ng yhdistelmä-DNA-ICD-proteiinia. Päällystetyn levyjä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa, pestiin kolme kertaa PBS-T: n (0,05% Tween 20: 1 x PBS: ssä) ja kaksi kertaa PBS: llä. Kuopat blokattiin sitten 100 ul: lla estopuskuria (2% BSA 1 x PBS: ssä) 37 ° C: ssa 2 tunnin ajan. Levyt pestiin kolme kertaa pesupuskurilla PBS-T: n ja kahdesti PBS: llä. H. pylori
infektoiduista ihmisen seerumeita, jotka kuuluvat eri kliinisten ryhmien laimennettiin sarjassa (1:50, 1:100, 1:200 ja 1:400) estopuskurissa (1% BSA PBS: ssä), jolloin saatiin optimaalinen tiitterit. Laimennettu sera [50 ui 1:200 laimennettua seerumia] lisättiin antigeenin päällystettyihin kuoppiin ja inkuboitiin 1 h 37 ° C: ssa. Levyt huuhdottiin kolme kertaa PBS-T: n ja kahdesti PBS: llä ja inkuboitiin edelleen anti-ihmis-IgG-piparjuuriperoksidaasi (Sigma) 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Piparjuuriperoksidaasi aktiivisuutta havaittiin käyttäen kromogeenista ainetta, o
fenyleenidiamiinia tetrahydrochloride (Sigma) sitraatti-fosfaattipuskurissa (pH 5,4) ja H _{2O 2, kuten 1 ul /ml. Reaktiot pysäytettiin käyttäen 0,5 M H 2SO 4, ja absorbanssi mitattiin 492 nm: ssä ELISA-lukijalla (Bio-Rad). Kukin ELISA toistettiin vähintään kahdesti kaikkien kliinisten sera isolaatteja. Opiskelijan t
Testi suoritettiin laskea p
arvot perustuvat keinot seerumin vasta-ainetiitterit vastaavat terveitä ja tartunnan luokat käyttämällä online tieteellinen laskin of GraphPad (www.graphpad.com_quickcalcs_ttest1 .cfm). P
-arvot olivat alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.}

ELISA tulehdusta edistävä sytokiini IL-8

THP-1-soluja (ihmisen monosyyttien, ATCC TIB 202), kasvatettiin ja ylläpidettiin RPMI 1640 (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM glutamiinia ja 1% anti-bakteeri ja anti-sieni-liuosta (Gibco). Makrofagin kuten vaiheessa, noin 1 x 10 ^{-6 solua /kuoppa eroteltiin käyttämällä 5 ng /ml forboli-12 myristaatti 13c asetaattia (PMA, Sigma). 24 tunnin kuluttua solut pestiin kerran RPMI 1640 median ja stimuloitiin käyttäen 10 ug /ml yhdistelmä-DNA-ICD. Proinflammatorinen proteiini, HP940, on H. pylori
[30], puhdistettiin samoissa olosuhteissa käytettiin positiivisena kontrollina (1 ug /ml). Soluja inkuboitiin 24 tunnin ajan kosteutetussa ilmakehässä 37 ° C: ssa. Solut ilman proteiinia hoitoa (stimuloimattomia solut) toimi negatiivisena kontrollina. Viljelmän supernatantti kerättiin 24 tunnin kuluttua käytettiin arviointiin IL-8 käyttäen kaupallisesti saatavilla optEIA ELISA Kit (BD Biosciences). Määritys suoritettiin ohjeen valmistajan ja sytokiinien tasot laskettiin käyttämällä yhdistelmä-standardia annetaan kit. Herkkyys IL-8 oli 3,1 pg /ml. Arvot ilmaistiin keskiarvona ± SD.}

Kiitokset

Olemme kiitollisia Seyed E. Hasnain ja Sharmistha Banerjee keskusteluihin. Kiitämme yhteistyökumppaneita CM Habibullah ja Barik Salih apua potilaan aineistoa ja tietoa. Kiitokset myös Francis Megraud tarjoamiseksi eri kontrolliseerumeiden näytteitä. NA on vastaava Fellow European Helicobacter Study Group (EHSG).

• PLoS ONE: Bakteeri Microbiota Profilointi gastriitti ilman helikobakteeri-infektion tai steroideihin tulehduskipulääke Use
• PLoS ONE: Associated Factors gastriitin Diagnosoidaan Double-Contrast ruoansulatuskanavan yläosan barium X-Ray Radiography: poikkileikkaus jossa analysoidaan 6901 terveille Japan