PLOS ONE: isocitrate déshydrogénase de Helicobacter pylori potentiellement Induit réponse immunitaire humorale chez les sujets atteints de la maladie ulcère peptique et Gastritis

Résumé

Contexte

H. pylori
provoque la gastrite et les ulcères gastro-duodénaux et est un facteur de risque pour le développement du cancer de l'estomac. La plupart des protéines telles que l'uréase, porines, flagellines et des toxines telles que lipo-polysaccharides ont été identifiés comme des facteurs de virulence potentiels qui induisent la réaction pro-inflammatoire. Nous rapportons les potentiels immunogènes de l'isocitrate déshydrogénase (ICD), une protéine importante maison de maintien de H. pylori
.

Les séquences d'acides aminés de Méthodologie /principales conclusions de H. pylori
ICD ont été soumis à in silico
analyse pour les régions avec des index antigéniques prévisible élevés. En outre, la modélisation informatique de la H. pylori
ICD juxtaposée à la E. coli
CIM a été effectuée pour déterminer les niveaux de la structure similarité et la disponibilité de la surface exposée des motifs, le cas échéant. Le icd
gène a été cloné, exprimé et purifié à une très grande homogénéité. réponse humorale dirigée contre H. pylori
CIM a été détectée grâce à une enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) dans 82 sujets humains comprenant de 58 patients avec H. pylori Associées gastrite ou d'ulcère et 24 témoins sains asymptomatiques. Le H. pylori
CIM a suscité potentiellement élevé réponse immunitaire humorale et a révélé des titres d'anticorps élevés dans les sérums correspondant à endoscopically confirmés gastrite et ulcère sujets pathologiques. Cependant, l'urée-souffle-tests négatifs échantillons témoins sains et des échantillons témoins asymptomatiques n'a pas révélé de réponses immunitaires détectables. Le test ELISA pour la cytokine pro-inflammatoire IL-8 ne présente aucune activité proinflammatoire significative de la CIM.

Conclusions /Importance

CIM de H. pylori
est un immunogène qui interagit avec le système immunitaire de l'hôte suite à une possible autolytique libération et suscite des réponses humorales chez les individus avec invasive H ainsi de manière significative. pylori
infection. Cependant, la CIM ne pouvait pas stimuler de manière significative IL8 induction dans une lignée cellulaire macrophage culture (THP1) et, par conséquent, ne peut pas être un agent proinflammatoire notable

Citation:. Hussain MA, Naveed SA, Sechi LA, Ranjan S, Alvi A, Ahmed I, et al. (2008) isocitrate déshydrogénase de Helicobacter pylori
Potentiellement Induit humorale réponse immunitaire chez des sujets atteints de la maladie ulcère peptique et Gastrite. PLoS ONE 3 (1): e1481. doi: 10.1371 /journal.pone.0001481

Academic Editor: Keertan Dheda, University College London, Royaume-Uni

Reçu: 29 Août 2007; Accepté le 24 Décembre 2007; Publié le 23 Janvier, 2008

Droit d'auteur: © 2008 Hussain et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Le financement de subventions de base CDFD (Département de la biotechnologie, gouvernement de l'Inde)

intérêts concurrents:. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Helicobacter pylori
Présentation
est un négatif, d'une bactérie Gram courbe qui établit des infections chroniques dans l'estomac humain. Il est un agent pathogène important que l'on croit avoir co-évolué avec les humains [1], [2]. Il habite près de la moitié de la population mondiale et est considéré comme un facteur de risque potentiel pour le développement de l'adénocarcinome gastrique [3]. H. pylori
est une cause reconnue de la gastrite chronique, la maladie de l'ulcère gastro-duodénal, le cancer gastrique, et le tissu lymphoïde associé aux muqueuses (MALT) lymphome. Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer son rôle dans la pathogenèse de l'intestin. Malgré des taux de colonisation élevés seulement un petit sous-ensemble de personnes infectées expérience H. maladies -Associated de pylori [2]. Associations de H. pylori
avec des facteurs spécifiques à la maladie sont restés plus ou moins énigmatique, même si les séquences du génome ont été déchiffrés il y a près d'une décennie [2].

L'un des traits les plus distinctifs de H. pylori
est la diversité génétique entre les isolats cliniques obtenus à partir de différentes populations de patients [3]. Refonte du génome est la norme avec cette bactérie, créant ainsi un grand nombre de allélique et de la variation de phase [3], ce qui pose des difficultés dans le développement de diagnostics et de vaccins.

Une fois acquis, l'infection persiste pendant des années et, provoque des réponses immunitaires détectables chez les personnes infectées [4], [5], caractérisé par des niveaux accrus d'IgG spécifiques et IgA dans le sérum et une augmentation de la sécrétion IgA et IgM dans l'estomac [6]. Par conséquent, les tests sérologiques non invasifs ont été recommandés et mis au point pour le diagnostic de H. pylori
infection. Parmi ceux-ci, le dosage immuno-enzymatique (ELISA) est l'une des méthodes les plus largement utilisés comme il est relativement abordable, rapide, simple à réaliser, et pourrait être facilement adopté pour le dépistage grand nombre d'échantillons [7]. Exploration anti H. Les anticorps pylori de est souvent prescrits avant endoscopie ou avant le début du traitement. Bien que en raison de la mémoire immunologique, sérodiagnostic ne peut être préférable de vérifier le succès ou l'issue du traitement d'éradication, il reste un choix comme une méthode sensible sans doute à cause de sa nature non invasive [8].

Actuellement, n'a pas été tout seul antigène «gold standard», qui peut être utilisé sans ambiguïté dans toutes les populations. L'une des raisons importantes pour cela pourrait être l'extraordinaire diversité présente dans H. pylori
[9] - [13], ainsi que son adaptation spécifique dans différents hôtes [12], [13]. Bien que les protéines telles que la catalase, gro
EL et flagelline sont fortement immunogènes, ils donnent des réactions croisées non spécifiques avec d'autres bactéries Gram-négatives et, plus particulièrement, Campylobacter jejuni
[14], [15]. En revanche, la virulence liée antigènes tels que CagA ou VacA, montrent un degré assez élevé de la variabilité de la séquence, comme il existe des H. pylori des souches qui sont génétiquement diverse et phénotypiquement variable pour un ou les deux antigènes [16] - [18]. Malgré cela, les associations satisfaisantes entre les anticorps sériques et les maladies invasives ont été décrites [19].

gènes de ménage de H. pylori
ont été utilisés récemment pour suivre les migrations de population et ont été trouvés pour être stable dans le génome à travers les siècles [20]. protéines Ménage cependant, n'a pas été testée en gros pour leur utilisation dans le diagnostic ou de vaccins. Les enzymes métaboliques semblent être un bon candidat pour être inclus dans un kit de test immuno-diagnostic, car ils font souvent pas de réaction croisée avec des sérums de témoins sains [21]. En outre, en raison de leur fonction d'entretien ménager, ils sont hautement conservés parmi différentes H. pylori des souches, quel que soit leur génotype, et peut donc servir candidats immuno-diagnostique comme idéales.

Les protéines qui sont libérées par les bactéries au cours de la phase de croissance logarithmique tardive, tels que superoxyde dismutase et de l'isocitrate déshydrogénase (ICD), sont décrit comme marqueurs d'autolyse [22] - [24] et certains d'entre eux ont été révélés être d'excellents antigènes de diagnostic. Par exemple, la CIM de M. la tuberculose
a été décrit comme un antigène potentiel de discriminer les patients atteints de tuberculose pulmonaire de témoins sains [24]. Cependant, les comparaisons précédentes des motifs antigéniques de H. pylori de protéines (y compris certaines des protéines d'entretien ménager) reconnues par les sérums des patients ont révélé aucune association de spécifique H. pylori de antigènes avec des cas de pathologie particulière gastroduodénal [21].

Cette étude démontre l'interaction du système immunitaire de l'hôte avec H. pylori
CIM sous la forme de réponses humorales significatives observées chez les sujets de la maladie. En outre, nous décrivons H. antigène pylori
CIM pour distinguer les patients atteints de la maladie de l'ulcère et gastrite d'individus sains non infectés.

Résultats

Dans la modélisation de silico, l'expression et la purification de la protéine H. pylori CIM

séquence protéique de la CIM de H. pylori
a été analysé pour prédire son immunogénicité basée sur l'indice antigénique, hydrophilie et probabilité de surface. Figure 1A montre in silico
profils antigéniques de la CIM générés en utilisant le logiciel Protean (DNAStar Inc. USA). En bref, plusieurs traces correspondant à immunoréactifs motifs d'acides aminés avec des indices antigéniques prévisible supérieurs (~3.4) ont été identifiés. Le H. pylori
ICD ainsi affiché grandes étendues antigéniques (figure 1A) nous incitant à regarder comme une protéine putative immunogène. Les indices d'antigénicité de la CIM étaient comparables à ceux rapportés précédemment pour un Rv2430c antigène PPE d'origine mycobactérienne, qui a été en outre avéré être un antigène immunodominant [25]. Le E. coli
CIM ont également été analysées d'une manière similaire et ont semblé être putativement immunogène; il y avait une nette différence trouvée par rapport à H. pylori
ICD, par rapport à l'abondance et la position des résidus antigéniques. Plus tard, nous avons construit un modèle d'homologie de la H. pylori
CIM basée sur la structure cristalline de E. coli
CIM (code PDB 1AI2) et ont été en mesure de décrire l'organisation du squelette de H. (26695) CIM de Pylori ainsi que celle de E. coli
. Les deux DAI se sont avérés significativement similaires (RMS Déviation 0,45), mais diffère par rapport aux régions de boucle exposées 3 de surface importante qui sont susceptibles de constituer des zones de différences structurelles correspondant aux épitopes antigéniques putatifs, éventuellement transmettre des réponses d'anticorps différentiel (Figure 1B )

Le surexprimé N-terminale marquée par His CIM a été purifié à >. l'homogénéité de 95% sur une colonne d'affinité de nickel (figure 2). La masse moléculaire de la CIM recombinante a été déterminée à 47 kDa. La purification des protéines a été effectuée dans des conditions natives avec un rendement de 2,0 mg de protéine par 500 ml de culture de départ

Interaction de H. pylori CIM avec le système immunitaire humain
réponses immunitaires

humorale dirigée. contre le H. pylori
ICD ont été comparés chez les patients avec H. pylori
infection (gastrite, NUD, DU et GC) et des contrôles sains (figure 3). Les données d'immunoréactivité ont été statistiquement analysées et comparées avec une connexion à la fois des sérums infectés et en bonne santé. Ces données ont démontré que les sérums de tous les patients infectés appartenant à la gastrite et l'ulcère duodénal (UD) catégories effectuées statistiquement significative ( P
< 0,0001) les taux d'anticorps anti-ICD par rapport à ceux des témoins en bonne santé. La protéine de la CIM, qui a un rôle métabolique apparemment importante, a donc été trouvé pour être en mesure de provoquer une forte réponse humorale chez des sujets souffrant de gastrite et DU. Toutefois, dans les cas de dyspepsie non ulcéreuse (NUD) et le cancer gastrique (GC), la réponse humorale réduite a été observée. Compte tenu de ces observations, il est probable que la libération de la protéine CIM est associée à actif, H. pylori
infection. Contrairement aux réponses humorales observées, le recombinant, H. pylori
CIM n'a pas induit de réponses immunitaires cellulaires importantes comme en témoigne d'un manque de sécrétion d'IL-8 à partir de macrophages humains induits par recombinant, H. pylori
CIM in vitro
(Figure 4). Par conséquent, nous suggérons que la CIM excite uniquement le compartiment humorale et ne peut pas contribuer à la pathologie gastrique ou changements induits de cytokines dans la physiologie gastrique.

Discussion

Identification et caractérisation de très immunogène H. Les protéines pylori de est une exigence obligatoire pour le développement de tests sérologiques basés sur des antigènes purifiés recombinants. Combiné avec le test respiratoire à l'urée, la sérologie est une approche non invasive pour détecter H. pylori
infection, et plusieurs kits de tests sérologiques basés sur de nombreux différents H. pylori d'antigènes sont disponibles dans le commerce. Bien que la réponse immunitaire humorale à H. pylori
semble être très variable, des combinaisons d'antigènes fréquemment reconnus pourraient être utiles à des fins de diagnostic [21]. Les enzymes métaboliques telles que la CIM semblent être de bons candidats pour être mis à profit pour sérologique développement de kit de test, principalement parce qu'ils ne le font pas de réaction croisée avec des sérums d'individus sains non infectés ou [24].

La signification de beaucoup protéines immunogènes de H. pylori
y compris certaines enzymes métaboliques n'a pas été apprécié beaucoup dans des échantillons cliniques dans une étude sur la base de protéomique précédentes [21]. Notre étude a cependant été réalisé pour évaluer purifié, recombinant H. pylori
CIM pour ses propriétés immunologiques dans différentes classes de H. pylori
patients infectés par la maladie gastro-duodénaux acide. Nous avons tenté d'examiner systématiquement la présence et l'utilité des réponses immunitaires induites par la protéine CIM dans H. pylori
patients infectés.

Notre analyse à l'aide de la CIM recombinant de H. pylori
a révélé des titres d'anticorps significativement élevés chez les maladies de l'ulcère et gastrite patients peptiques, par rapport à NUD et patients atteints de cancer (figure 3). Nous supposons que la réponse immunitaire vu dans le cas de l'ulcère peptique et la gastrite pourrait peut-être dû à des charges élevées de bactéries associées à une pathologie invasive et ainsi un plus grand nombre d'agents pathogènes ou des agents pathogènes présentant autolysés CIM sur la surface. Cela peut éventuellement expliquer la réponse relativement élevé d'anticorps dans la catégorie des patients invasives.

H. pylori de antigènes sont décrits d'être libérés dans l'espace extracellulaire par l'intermédiaire de plusieurs mécanismes tels que des voies spécifiques de la sécrétion, l'autolyse et la formation de vésicules membranaires [23] et les propriétés de surface de H. pylori
ont été suggérés pour être unique en permettant la localisation d'adsorption /de surface de ces protéines [26]. DAI sont traditionnellement connus comme marqueurs de l'autolyse [22], [24], [27], libérés au cours de la phase logarithmique tardive. La libération extracellulaire de protéines pourrait potentiellement être survenant uniquement pendant in vitro
croissance de H. pylori
. Cependant, existence in vivo
de tels mécanismes, si démontrée, pourrait être en mesure d'expliquer le rôle de différentes protéines sécrétées dans la pathologie moléculaire de la maladie de l'ulcère. L'entrée de H. pylori de protéines dans l'espace sous-muqueux gastrique peuvent avoir des conséquences fonctionnelles importantes telles que la promotion des proinflammatoire et les réponses chimiotactiques par la libération de cytokines par les macrophages activés. En outre, la libération extracellulaire et ou l'adsorption ou la surface de localisation [26] des protéines potentiellement immunogènes pourraient soutenir une stratégie bactérienne pour dévier une réponse immunitaire locale efficace [23]. Compte tenu de ces mécanismes multiples à l'esprit, nous avons vérifié les potentiels proinflammatoires de la CIM à l'aide d'un test ELISA IL-8. Dans notre observation, la CIM n'a pas induit de manière significative l'IL-8 sécrétion différenciées, les macrophages en culture. Cependant, étant donné que nous n'avons pas analysé le rôle de la CIM en ce qui concerne l'induction d'autres cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF-α et IL1-β, il est prématuré de se prononcer justement sur son implication dans l'inflammation gastrique.

Après avoir montré que H. pylori
ICD suscite une réponse humorale, nous avons étudié la base de la spécificité immunitaire de cette protéine comme reflété par la structure de modélisation basée. Notre analyse la séquence et la modélisation moléculaire de H. pylori
et E. coli
DAI ne se révèlent pas de chevauchement complet de structure entre les deux (figure 1); plusieurs régions de dissemblances structurelles ont été discernées qui correspondent probablement aux épitopes antigéniques putatifs dans H. pylori
CIM. Outre les questions liées à la conservation ou à la diversité structurelle, nous émettons l'hypothèse que la réactivité plus élevée de H. pylori
CIM par rapport à la CIM de (commensal) E. coli
avec le système immunitaire de l'hôte in vivo
pourrait être associé à 1) différente de l'invasivité de H. pylori
et E. coli
2) différentes grandeurs de la charge bactérienne, le chiffre d'affaires et de l'autolyse 3) différent répertoire de cellules présentatrices d'antigènes (macrophages par rapport aux cellules dendritiques) impliquées et leur abondance relative 4) la disponibilité des épitopes exposés de surface dans H. pylori
CIM (comme ceux mis en évidence dans la figure 1B), et 5) la présence de lésions actives de l'inflammation chronique, lésions des muqueuses et des effets chimiotactiques de l'autre H. pylori de protéines dans le milieu
.

Tout en considérant une réactivité croisée possible à partir d'autres bactéries invasives telles que C. jejuni
, nous avons testé H. pylori
CIM contre 8 échantillons de C. sérums entérites patient de jejuni et a constaté qu'il n'a pas de réaction croisée significative (données non présentées). Le H. pylori
statut indemne de notre C. patients positifs jejuni a été déterminée sur la base de l'absence de symptômes de l'indigestion, maux d'estomac et les brûlures d'estomac, etc. Cependant, étant donné que nous avons utilisé seulement des échantillons de sérum limités de C. Les patients jejuni de, nous ne sommes pas enclins à la marque H. pylori
CIM comme antigène de diagnostic autonome. Néanmoins, C. jejuni
ne peut pas toujours comprendre un fond beaucoup moins concurrentiel C. Les patients jejuni de se sont cliniquement colonisées par H. pylori
ou vice-versa.

Enfin, les résultats prometteurs obtenus nous en termes de réponses humorales importantes à H. pylori
CIM ne peut être interprétée comme immédiatement applicable pour le diagnostic de terrain. Néanmoins, il est possible que nos résultats fournissent une base solide pour le développement d'un test de séro-diagnostic pour H. pylori Associées pathologies gastro-duodénales. Nous suggérons que le potentiel de cet antigène et les peptides spécifiques d'épitope peut en outre être analysé en utilisant une grande pile d'échantillons de sérums qui représentent différents sujets pathologiques. De même, le statut et l'importance des réactions croisées des anticorps dans le sérum correspondant à des maladies causées par des bactéries telles que Salmonella spp., Shigella spp. et d'autres entéropathogènes invasives pourraient également être déterminés. Il sera intéressant d'explorer en profondeur l'implication de la CIM dans les activités de signalisation dans l'espace sous-muqueux, spécialement son interaction avec les macrophages et les lymphocytes activés. En outre, compte tenu de son rôle important dans le cycle de l'acide tricarboxylique et l'absence de glyoxylate shunt dans H. pylori
[27], l'évaluation de la CIM en tant que cible possible interventionnelle pose une proposition passionnante.

Matériel et méthodes

Dans silico antigénicité prédit H. pylori CIM (HP0023)

séquence nucléotidique de H. pylori icd
(ORF HP0023) et la séquence d'acides aminés correspondante a été obtenue à partir de la base de données PyloriGene (http://genolist.pasteur.fr) et a été soumis à une analyse par le paquet DNAStar (DNAStar Inc. Madison, États-Unis). séquence d'acides aminés de la CIM a été soumis à l'examen de tout déterminants antigéniques en utilisant le programme Protean dans le package DNAStar. Des paramètres tels que hydrophilicité, de probabilité de surface et l'indice antigénique a été calculé pour la protéine entière à l'aide de ce logiciel. indices antigéniques montrant plus de 2 pics à > 3,0 échelles ont été considérés comme significativement plus antigénique

La modélisation informatique de la structure de la CIM

Utilisation de Modeller-6, un programme de modélisation moléculaire qui met en œuvre une approche automatisée. à la modélisation comparative de la structure des protéines par la satisfaction des contraintes spatiales [28] a été utilisé pour déterminer le modèle en trois dimensions de H. pylori
CIM. Le modèle de la CIM de H. pylori
a été généré sur la base du E. coli
CIM modèle 1A12 qui partage une identité de séquence de 68% dans l'ensemble avec le H. pylori
CIM.

Production de

L'ORF de recombinant H. pylori CIM correspondant à H. pylori icd
(HP0023, 1.275 kb) a été amplifié par PCR à partir de l'ADN génomique d'un H. pylori de la patiente isoler MS8. La protéine recombinante de la CIM a été surexprimé dans E. coli
et purifiée jusqu'à homogénéité (figure 2) selon les méthodes décrites précédemment par Banerjee
et al [24]. La récolte de la protéine purifiée a été standardisé à 2,0 mg de protéine purifiée par 500 ml de culture de départ recombinant E. coli
. La protéine recombinante purifiée a été dialysée contre 20 mM de Tris HCl, pH 7,5, avec 100 mM de NaCl et 3% de glycérol. En outre, la protéine purifiée a été traitée avec la polymixine B pour exclure les effets de toute contamination LPS. La CIM recombinante purifiée a été lyophilisée et immédiatement conservé congelé pour une utilisation en aval dans le diagnostic clinique.

Patients et échantillons de sérum humain

La population d'étude ( n
= 82) comprenait 58 H. pylori
infecté des échantillons de patients (pour plus de détails de nombre de cas analysés dans chaque catégorie, s'il vous plaît voir la figure 3) obtenus à partir des cas de rapports principalement au Collège Deccan des sciences médicales et alliées Hôpitaux, (DCMS), Hyderabad, et 24 cliniquement sains les bailleurs de fonds. Le groupe témoin sain était composé de 18 prouvé H. cas négatifs de pylori testés avec Urée Breath Assay (UBA) et 6 personnes asymptomatiques qui ont été confirmés H. pylori
négatif testé par disponible dans le commerce kit ELISA (Pyloriset EIA-GIII, Orion, Espoo, Finlande). Dans tous les groupes de patients, le diagnostic de l'ulcère ou de gastrite a été confirmée ou infirmée par endoscopie par le gastroentérologue traitant. La présence de H. pylori
chez les sujets malades inclus dans cette étude a déjà été confirmée par la coloration de Gram, un test rapide à l'uréase (RUT), ARNr 16S et cag
Un gène RFP et la culture [29] sur la base. La population étudiée avait pas de biais de sexe ou d'âge. Écrit consentement éclairé ont été obtenus à partir de tous les patients et les témoins en bonne santé dans les centres respectifs.

ELISA pour la réponse humorale
test

ELISA a été effectué pour vérifier la réponse immunitaire humorale chez les humains contre la CIM recombinant. En bref, des plaques de microtitrage à 96 puits ont été revêtues avec -500 ng de protéine recombinante de la CIM. Les plaques revêtues ont été incubées pendant une nuit à 4 ° C, lavées trois fois avec du PBS-T (0,05% de Tween 20 dans 1 x PBS) et deux fois avec du PBS. Les plaques ont été ensuite bloquées avec 100 pi de tampon de blocage (BSA à 2% dans 1 x PBS) à 37 ° C pendant 2 heures. Les plaques ont été lavées trois fois avec du tampon de lavage PBS-T et deux fois avec du PBS. Le H. pylori de sérum humain infecté par appartenant à différents groupes cliniques ont été dilués en série (1:50, 1:100, et 1:200 1:400) dans un tampon de blocage (BSA à 1% dans du PBS) pour obtenir des titres optimaux. sérums dilués [50 pi de sérums dilués 1:200] ont été ajoutés aux puits recouverts d'antigène et on a incubé pendant 1 heure à 37 ° C. Les plaques ont été rincées trois fois avec du PBS-T et deux fois avec du PBS et on a continué l'incubation avec des anticorps anti-IgG humaine-peroxydase de raifort (Sigma) à 37 ° C pendant 1 heure. une activité de peroxydase de raifort a été détectée en utilisant une substance chromogénique o-phénylènediamine
tétrachlorhydrate (Sigma) dans un tampon citrate-phosphate (pH 5,4) et H _{2 O 2 en 1 pl /ml. Les réactions ont été arrêtées en utilisant 0,5 M H 2SO 4, et les valeurs d'absorbance ont été mesurées à 492 nm dans un lecteur ELISA (Bio-Rad). Chaque test ELISA a été répétée au moins deux fois avec tous les isolats cliniques de sérum. Student t
test a été effectué pour calculer des valeurs basées sur les moyennes des titres d'anticorps sériques correspondant à des classes saines et infectées en utilisant la calculatrice scientifique en ligne de GraphPad p
(www.graphpad.com_quickcalcs_ttest1 .cfm). P
valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.}

ELISA pour cytokine pro-inflammatoire IL-8

cellules THP-1 (Monocyte humaine, ATCC TIB 202) ont été cultivées et maintenues dans un milieu RPMI 1640 (Invitrogen) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 2 mM de glutamine et 1% de solution anti-bactérien et anti-mycosique (Gibco). Pour macrophage comme étape, environ 1 x 10 ^{-6 cellules /puits ont été différenciées en utilisant 5 ng /ml de phorbol-12 myristate 13c acétate (PMA, Sigma). Au bout de 24 heures, les cellules ont été lavées une fois avec du milieu RPMI 1640 et stimulées avec 10 pg /ml de CIM recombinante. Une protéine proinflammatoire, HP940, de H.
pylori [30], purifié dans des conditions semblables a été utilisé comme témoin positif (1 pg /ml). Les cellules ont été incubées pendant 24 heures dans une atmosphère humidifiée à 37 ° C. Des cellules sans traitement de la protéine (cellules non stimulées) a servi de contrôle négatif. Le surnageant de culture recueilli au bout de 24 heures ont été utilisées pour l'estimation de l'IL-8 en utilisant une trousse disponible dans le commerce OptEIA ELISA (BD Biosciences). L'analyse a été effectuée selon les instructions du fabricant niveaux de cytokines et ont été calculés selon la norme recombinante fournie dans le kit. La sensibilité de l'IL-8 était de 3,1 pg /ml. Les valeurs ont été exprimées en moyenne ± SD.}

Remerciements

Nous sommes reconnaissants à Seyed E. Hasnain et Sharmistha Banerjee pour les discussions. Nous remercions nos collaborateurs CM Habibullah et Barik A Salih de l'aide sur le matériel du patient et de l'information. Merci aussi à Francis Mégraud pour fournir divers échantillons de sérum de contrôle. NA est le membre correspondant du groupe européen d'étude Helicobacter (EHSG).

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