PLOS ONE: Bakteriell Microbiota profilering i gastrit utan Helicobacter pylori-infektion eller icke-steroida antiinflammatoriska droganvändning

Abstrakt

Nya 16S ribosomal RNA-genen (rRNA) molekylär profilering av magslemhinnan visade en överraskande komplexitet mikrobiota. Helicobacter pylori
infektion och icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID) är två huvudbidragsgivare till gastrit och magsår. Men lite är känt om sambandet mellan andra medlemmar i magen mikroorganismer och gastric sjukdomar. I denna studie, kloning och sekvensering av 16S rRNA användes för att profilera magen mikrobiota vid normala och gastrit patienter. Hundra och trettio tre phylotypes från åtta bakterie phyla identifierades. Magen mikrobiota befanns vara nära vidhäftad till slemhinnan. Eleven Streptococcus
phylotypes framgångsrikt odlat från biopsier. En till två släkten representerade en majoritet av kloner inom någon av de identifierade fyla. Vi vidareutvecklas två realtid kvantitativ PCR-analyser för att kvantifiera den relativa förekomsten av Firmicutes stammen och Streptococcus
släkte. Betydligt högre förekomst av Firmicutes stammen och Streptococcus
släkte inom Firmicutes stammen observerades hos patienter med antral gastrit, jämfört med normala kontroller. Denna studie visar att släktet taxon nivån i stort sett kan representera mycket högre taxa såsom stammen. Den kliniska relevansen och mekanismen bakom den förändrade floran sammansättning gastrit kräver ytterligare funktionella studier

Citation. Li XX, Wong GL-H, att KF, Wong VW-S, Lai LH, Chow DK-L, et al. (2009) Bacterial Microbiota profilering i gastrit utan Helicobacter pylori
infektion eller icke-steroida antiinflammatoriska droganvändning. PLoS ONE 4 (11): e7985. doi: 10.1371 /journal.pone.0007985

Redaktör: Niyaz Ahmed, University of Hyderabad, Indien

Mottagna: 4 juni, 2009; Accepteras: 27 oktober, 2009; Publicerad: 24 november 2009

Copyright: © 2009 Li et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöds av den kinesiska University of Hong Kong. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Commensal mikrobiota är en integrerad del av en människa [1]. De allra flesta av mikrober lever vårt mag-tarmkanalen, med mer än 800 arter från nio bakterier och en archaeal phyla. Denna mångskiftande mikrobiota bidrar till gut mognad [2], [3], [4], värd näring och patogenresistens [5]. Mikrober också direkt interagera med mänskliga värden genom att reglera tarm epitel spridning, fett lagring och inflammatoriska svar [3], [6], [7]. Medan vissa mikrober kan på egen hand orsaka allvarlig sjukdom, många kroniska sjukdomar är troligen på grund av störningar av den totala mikroorganismer. Till exempel allergier och astma kopplat till barndomen antibiotika som kan förändra tarmfloran [8]. Andra villkor som är förknippade med tarmfloran inkluderar sen debut autism [9], inflammatorisk tarmsjukdom [10], och cancer [11].

Traditionellt är odlingsbaserade metoder som används för att erhålla mikrobiell isolat för ytterligare karakterisering. Sådana studier under förutsättning att grunden för vår förståelse av mikrobiologi. Dock är odlingen ofta arbetsintensiv och kan misslyckas av många mikrober. Mikroskopisk observation används också för att uppskatta överflöd av mikrober, och, i begränsad utsträckning, tilldelar mikrober för att taxa [12]. Nyligen har 16S ribosomal RNA-genen (rRNA) sekvensprofiler som används för att belysa mikrobiell mångfald, ofta till phylotype nivå. Använda 16S rRNA-sekvensering, mikrober från munnen [13], [14], matstrupe [15], mage [16], tunntarmen [17], kolon [18], [19] och vagina [20] har studerats. Dessa studier undersökte mikrobiella mångfalden i den mänskliga kroppen och avslöjade en stor population av vilda och okarakteriserade mikrober, som varit svårfångade för odlingsbaserade metoder. Genom dessa hög genomströmning 16S rRNA-sekvensering och andra metagenomic sekvense ansträngningar har mikrobiota störningar befunnits vara associerad med tandlossning [21] och fetma [22], [23], [24].

I magen , magsyran dödar många intagna mikrober. Det ansågs allmänt att magen är inte beboeliga av någon mikrob tills upptäckten av Helicobacter pylori Köpa och dess samband med gastrit och magsår [25]. Annat än några andra Helicobacter
arter [26], [27], [28], var det inte väntat att magen skulle innehålla många andra levande mikrober. Minskad surhet på grund av progressiv atrofisk gastrit kan öka mikrobiell mångfald [29]. En studie av Monstein et al.
Att använda tids temperaturgradient gelelektrofores (TTGE) och en småskalig 16S rRNA-sekvensering föreslog andra mikrober såsom Enterococcus
, Pseudo
, Streptococcus
, Staphylococcus Mössor och Stomatococcus
var också närvarande i magen [30]. En nyare storskalig 16S rRNA-sekvensering ansträngning identifierat 128 phylotypes från 8 phyla i 23 nordamerikanska patienter [16]. Intressant, förekomsten av H. pylori
i magen inte påverkar den totala sammansättningen av mikroorganismer på stammen nivå.

I denna studie gick vi vidare för att undersöka eventuella samband mellan magen mikrobiota förändringar och Icke H. pylori Köpa och icke-NSAID (NHNN) gastrit. Vi antar att när H. pylori
inte är närvarande, andra bakteriegrupper /arter kan bidra till eller vara associerad med gastrit utveckling. På mikrobiota nivå, vi också skulle vilja ta upp en nyckelfråga när det gäller: vid vilken taxon djup (s) gör de mikroorganismer verkar relativt stabil så att störningar på dessa nivåer kan vara relevanta för människors hälsa? Vi använde 16S rRNA-genen kloning och sekvensering för att profilera magen mikroorganismer från normal och NHNN gastrit patienter, och taxon specifik kvantitativ realtids-PCR (qPCR) analyser för att kvantifiera den relativa förekomsten av Firmicutes stammen och Streptococcus
släkte.

Resultat

Taxon rädsanalys

Vi har analyserat både kropp och antrum biopsier från 5 normala individer och 5 NHNN antral gastrit individer (alla kvinnor, åldersmatchade) . Alla patienter var H. pylori
negativa vid både snabb ureastest och 16S rRNA-sekvensering. Ingen av patienterna hade tagit NSAID inom 6 månader före genomgå endoskopi. Minst 60 kloner från varje biopsi (kropp eller antrum, alltså minst 120 kloner från varje individ) sekvenserades med användning brett utbud 16S rRNA PCR-produkter. Totalt 1223 icke- H. pylori
mikrobiella sekvenser erhölls. Dessa mikrober tillhör 8 phyla (133 phylotypes), varav 5 phyla (Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteia, Fusobacteria och Proteobacteria) är närvarande i en stor majoritet (1211 av 1223, eller 99,0%). Nio phylotypes med sekvenslikhet mindre än 97% till sekvenser närvarande i de offentliga databaser identifierades. Sex av dessa 9 phylotypes representerades av enskilda kloner (Kompletterande tabell S1).

För att undersöka den totala representationen av olika taxon nivåer i magen biota, konstruerade vi en taxon träd (Figur 1 och kompletterande figur S1). Intressant nog var phylum domineras av endast en eller två underart nivåer (klass, ordning, familj eller genus). I själva verket var varje phylum domineras av endast 1-2 släkten. Till exempel var de vanligast förekommande Stam Firmicutes representeras av 383 kloner, av dessa 333 kloner från klassen Bacilli. Därefter 273 kloner från ordningen lactobacillales. Tvåhundrafemtio fyra kloner var från familjen Streptococcaceae. Och alla 254 kloner var från släktet Streptococcus
. De fem vanligaste släkten inklusive Streptococcus
(254 kloner), Prevotella
(243), Neisseria
(175), Haemophilus
(122) , Porphyromonas
(68), utgjorde 70,5% av alla mikrobiella kloner.

Art rikedom och mångfald

När hela datauppsättningen (1223 kloner) användes, var god täckning 96%, vilket indikerar att ytterligare fyra phylotypes skulle förväntas för varje 100 ytterligare kloner som skall sekvenseras. Denna nivå av täckning indikerade att majoriteten av bakteriella sekvenser var närvarande i de sekvense kloner. Mångfald uppskattning av uppskattningar version 8.0 anges att cirka 200 phylotypes kan vara närvarande i den mänskliga magen biopsiprover (Kompletterande Figur S2). Vi uppskattade ytterligare artrikedom i fyra olika biopsiprov (NMA (Normal Antrum), NMB (normal kropps), AGA (Antral Gastrit Antrum), AGB (Antral Gastrit Body), Kompletterande tabell S2). Artrikedom var inte annorlunda mellan antral gastrit biopsier och normala biopsier (p > 0,1, oparade t-test) katalog

Bakteriell jämförelse mikrobiota mellan två olika anatomiska platser (antrum och kroppen) i normala patienter
<. p> i normala patienter, var ingen signifikant skillnad mellan två anatomiska platser (antrum och kroppen) för någon av taxon grupperna, med undantag för familjen Prevotellaceae och släktet Prevotella
där p-värden (Pearsons chi fyrkant test) var mellan 0,01-0,05 (Figur 1).

Firmicutes fylum och Streptococcus
släktet anrikades i magen hos antral gastrit patienter

Baserat på 1223 16S rRNA-sekvenser, den Firmicutes stammen var den mest förekommande stammen med 383 kloner. Den Proteobacteria stammen var en god tvåa med 345 kloner. Intressant nog Firmicutes stammen var mer rikligt förekommande i antral gastrit biopsier än i normala biopsier (41% vs 22%, tabell 1), medan Proteobacteria stammen var mer rikligt förekommande i normala biopsier (37% vs 20%). Eftersom 16S rRNA-sekvensering är kostnaden oöverkomliga för en större provstorlek har vi utvecklat en taxon specifik realtids kvantitativ PCR (qPCR) metod för att kvantifiera förekomsten av Firmicutes och Streptococcus
(Figur 2). De taxon-specifik qPCR data för Firmicutes var starkt korrelerade med sekvenseringsdata 16S rRNA för de tidigare nämnda 20 biopsiprover (2 biopsier för var och en av de 5 normalt och 5 antral gastrit patienter) (Supplementary Fig S3).

sjutton ytterligare par av antrum och kroppen biopsiprov från normala patienter och 18 ytterligare par av antrum och kroppen biopsiprov från antral gastrit patienter analyserades med Firmicutes specifika qPCR. Helt, var 90 biopsier (46 prover från 23 antral gastrit patienter och 44 prover från 22 normala patienter) analyseras (tabell 2). Medelåldern för de antral gastrit patienter var 67,6 ± 11,4 (median: 69, intervall: 46-86), medan den genomsnittliga åldern för kontrollerna var 58,3 ± 14,7 (median: 52, intervall: 40-87). Medelåldern för den normala gruppen var yngre än den antral gastrit gruppen. Men statistisk analys visade att det inte fanns något samband mellan ålder och Firmicutes eller Streptococcus
överflöd (p > 0,1) (kompletterande figur S4). Dessa prover var uppdelade i 4 grupper, antral gastrit antrum (AGA), antral gastrit kropps (AGB), normal antrum (NMA), och normal kropps (NMB). Överflödet av Firmicutes var signifikant högre hos AGA än i NMA eller NMB (envägs ANOVA (variansanalys) test, p = 0,004 och p = 0,046 respektive) och i AGB än i NMA (ett sätt ANOVA, p = 0,039 ) (figur 3A). Ingen signifikant skillnad observerades mellan AGA och AGB (ett sätt ANOVA, p = 0,855), eller NMA och NMB (p = 0,832).

Av samma biopsiprover, släktet Streptococcus
analyserades också av Streptococcus
specifika qPCR. Streptococcus
överflöd var 72% och 76% högre i AGA vs. NMA eller NMB, respektive, och 66% och 70% högre i AGB vs. NMA eller NMB, respektive (figur 3B). P-värden för ANOVA test visas i figur 3B. I likhet med Firmicutes analysen var ingen signifikant skillnad mellan AGA och AGB (ett sätt ANOVA, p = 0,999), eller NMA och NMB (p = 0,999).

Streptococcus
odling och biopsi tvätt

enbart detektion av 16S rRNA gensekvenser innebär inte att levande bakterier är närvarande eller bakterierna faktiskt bosatt i stället för förbipasserande i magen. Vi genomförde därför ut ytterligare två experiment.

För det första försökte vi bakterieodling från biopsier. En odlingsbetingelser som lämpar sig för Streptococcus
användes eftersom de verkade vara överrepresenterade i antral gastrit patienter. Sexton par (antrum och kroppen) av biopsier användes för odling på blodagarplattor. Kolonier sekvenserades för 16S rRNA-genen för identifiering. Elva phylotypes av Streptococcus
isolerades (Kompletterande tabell S3). Dessa 11 phylotypes utgjorde 93,3% (eller 237 av de 254 kloner) av alla kloner som identifierats i det breda intervallet 16S rRNA-sekvensering, vilket tyder på att majoriteten av Streptococcus
phylotypes lever i mag biopsier.

För det andra, var 14 biopsiprov från både antral gastrit och normala patienter tvättas i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med tre alltmer tuffa förhållanden. Om hårda tvättbetingelser inte tar bort bakterierna från biopsi, är det suggestiva att dessa bakterier fäster tätt till magslemhinnan. Över 90% av den totala bakterierna förblev fästa vid biopsier efter tre på varandra följande tvättar med allt svåra förhållanden (Kompletterande Figur S5A). Det sista tvättsteget gjordes på hög effekt på en stationär virvelmaskin. På samma sätt, majoriteten av Streptococcus
bakterier förblev fästa vid biopsier efter tvättningsstegen 3 (kompletterande figur S5B).

Diskussion

I denna studie har vi profilerat den bakteriefloran i de parade gastriska biopsier (antrum och kroppen) från normala och antral gastrit patienter. Alla patienter är H. pylori
negativ och utan NSAID-användning. Genom brett utbud 16S rRNA gensekvenser, identifierade vi 1223 icke- H pylori
bakterier kloner, som liknar en tidigare studie (Bik studie, 1056 icke- H pylori
bakterier kloner) [16 ]. Även om de två studierna analyserade två geografiskt (Hong Kong vs. Kalifornien) och etniskt (kinesiska vs. kaukasiska, latinamerikaner och African American) olika populationer, den totala mikrobiota komplexiteten är förvånansvärt lika (tabell 3). Båda studierna identifierade cirka 130 (133 och 127 för detta och Bik studien, respektive) phylotypes från sju till åtta phyla. Majoriteten av klonerna (77,4% av denna studie och 79,8% av Bik studien) delades. De två mest förekommande släkten ( Streptococcus Mössor och Prevotella
) var också identiska. Dessa två släkten representerade 40,6% och 41,5% av alla kloner i denna studie och Bik studien. Båda studierna visade att cirka 200 olika phylotypes kan vara närvarande i magslemhinnan. Sådan dramatisk likhet mellan de två studierna belyser selektivt tryck för mikrobiota under hårda magmiljön. Dessutom fann vi ingen större skillnad i bakteriefloran mellan de två anatomiska platser (antrum och kroppen) i normala patienter, trots den kliniska relevansen för biopsi provtagning på olika anatomiska platser [31].

Med tanke på att rigorösa tvättsteg kunde inte separera mikroorganismer från biopsier, hypotes vi att majoriteten av de identifierade bakterierna är associerade tätt med magslemhinnan. Dessutom kunde vi odla majoriteten av Streptococcus
phylotypes identifieras genom ett brett utbud 16S rRNA-sekvensering, vilket tyder på att dessa bakterier verkligen kan vara sant invånare i magslemhinnan.

För att ytterligare uppskatta den totala komplexiteten i magen mikroorganismer, konstruerade vi en taxon träd baserad på de identifierade klonerna att undersöka varje taxon nivå inklusive fylum, klass, ordning, familj och genus. Intressant nog fann vi att för varje provins, en eller två släkten var övervägande närvarande. De fem vanligaste släkten inklusive Streptococcus
(fylum Firmicutes), Prevotella Mössor och Porphyromonas
(Bacteroidetes), samt Neisseria Mössor och Haemophilus
(Proteobacteria) utgjorde 70,5% av alla mikrobiella kloner.

Intressant visade 16S rRNA profilering en betydande överrepresentation av Firmicutes stammen (främst på grund av överrepresentation av Streptococcus
släkte inom stammen) och en underrepresentation av Proteobacteria stammen i biopsier från antral gastrit patienter. Vi utvecklade en taxon-specifik qPCR strategi för att analysera förekomsten av den Firmicutes och streptokocker
taxa för 90 biopsier (46 prover från 23 antral gastrit patienter och 44 prover från 22 normala patienter) och bekräftade överrepresentation av dessa två taxa i antral gastrit magen med 42% och 71%, respektive. De flesta av Streptococcus
phylotypes identifieras genom sekvensering var alfa-hemolytiska bakterier som är potentiella patogener (t.ex. Streptococcus pneumoniae
, Streptococcus mitis Mössor och Streptococcus saliv
). Vissa Streptococcus
arter är resistenta mot låga pH-betingelser och kan överleva i magsäcken [32]. Vår odlingsdata och tvätt experiment föreslog också att dessa verkligen var levande, bosatt biota i magen.

Huruvida ökningen av Streptococcus
överflöd är orsak för antral gastrit eller ett resultat av lokal miljöförändringar på grund av antral gastrit återstod att besvaras. En potentiell strategi är att använda bakteriefria musmodell [33]. En annan intressant fråga är att om vissa mikroorganismer kompositioner skydda eller alternativt, sensibilisera magslemhinnan från invaderande patogener som H. pylori
. Slutligen nya hög genomströmning sekvense teknik kommer sannolikt att ge mer omfattande uppgifter om mikroorganismer från olika anatomiska platser längs människans mag-tarmkanalen och vid olika tidpunkter [34].

Material och metoder

Gastric biopsiprover

Denna studie har godkänts av den kinesiska University of Hong Kong kliniska forskningsetisk kommitté. Alla patienter gav skriftligt informerat samtycke för att erhålla studieprover. Två magslemhinnan biopsier (antrum och kroppen i magen) samlades från varje patient under rutin endoskopi vid Prince of Wales Hospital, Hong Kong. För att undvika kontaminering, var en ny steriliserade endoskopi pincett används när du tar en andra biopsi från samma patient. Biopsierna snabbfrystes på torris och förvarades vid -80 ° C. Patienter som tar antibiotika eller NSAID (definierat som all användning av NSAID för åtminstone en vecka under de senaste 3 månaderna före endoskopi) eller testat positivt för H. pylori Musik av snabb ureastest (RUT) eller histologiska prov uteslöts. Patienten demografi visas i tabell 2.

Konstruktion av 16S rRNA-klonbibliotek och sekvense

Totalt genomiskt DNA isolerades från biopsier genom användning av DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA ) med glas slå visp metod som tidigare beskrivits [16]. Två negativa kontroller med endast sterilt vatten även extraheras med användning av samma protokoll. De extraherade DNA-koncentrationer mättes genom Nanodrop 1000 Spektrofotometer (Thermo Scientific, Minneapolis, MN, USA). Två universella bakteriella 16S rRNA-primrar, B8F20 [35] (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') och B806R20 [36] (5'GGACTACCAGGGTATCTAAT-3') användes för att amplifiera den region som motsvarar position 8 till 806 i den Escherichia coli
16S rRNA-genen. De 25 mikroliter PCR-blandningar ingår 1 x PCR-buffert inklusive 1,5 mM MgCl _{2 (Qiagen), 20 mM tetrametylammoniumklorid, 0,1 mM av varje dNTP, 0,4 ^ M av varje primer, 1 enhet HotStar Taq DNA-polymeras (Qiagen), och 2}

• PLOS ONE: Förbättrad M1 Macrophage Polarisering i Human Helicobacter pylori-associerad atrofisk gastrit och i Vaccinerade Mice
• PLOS ONE: isocitratdehydrogenas av Helicobacter pylori Potentiellt inducerar humoralt immunsvar hos patienter med magsår och Gastritis