PLoS ONE: Bakterinė mikrofloros profiliavimo gastritas be Helicobacter pylori infekcijos ar nesteroidiniams priešuždegiminis vaistas Naudojimosi

Anotacija

Naujausi 16S ribosomos RNR genas (rRNR) Molekulinė profiliavimas skrandžio gleivinės atskleidė stebina sudėtingumą mikrofloros. Helicobacter pylori
infekcija ir nesteroidinis vaistas nuo uždegimo (NVNU) vartojimas yra dvi pagrindinės prisideda prie gastritu ir skrandžio opa. Tačiau mažai žinoma apie ryšį tarp kitų narių skrandžio mikrofloros ir skrandžio ligų asociacijos. Šio tyrimo metu, klonavimas ir eiliškumo 16S rRNR buvo naudojamas profilis skrandžio mikrobiotą nuo normalių ir gastritas pacientams. buvo nustatyti vieną šimtą trisdešimt tris phylotypes iš aštuonių bakterijų phyla. buvo nustatyta, kad skrandžio mikroflora būti glaudžiai prisijungusios prie gleivinės. Vienuolika , Streptococcus
phylotypes buvo sėkmingai auginami nuo biopsijų. Vienas su dviem gentims atstovavo klonų balsų dauguma per bet kurią nustatytą phyla. Mes taip pat sukūrė du realaus laiko kiekybine PGR kiekybiškai santykinę gausą firmicutes phylum ir Streptococcus
gentis. Žymiai didesnė gausa iš firmicutes phylum ir buvo stebimas pacientams, sergantiems antralinių gastritas Streptococcus
gentis per firmicutes phylum, palyginti su kontrolinės grupės. Šis tyrimas rodo, kad genties taksonas lygis gali labai atstovauti daug aukštesniųjų taksonų pvz phylum. Klinikinė reikšmė ir mechanizmas, kuriuo grindžiama pakitusi mikroflora sudėtį gastritas reikalauja toliau funkcines studijas

nurodomoji dalis:. Li XX Wong GL-H Norėdami KF, Wong VW-S, Lai LH, Čiau DK-L, ir kt. (2009) Bakterinė mikrofloros profiliavimo gastritas be Helicobacter pylori
infekcijos ar Nesteroidiniai priešuždegiminiai narkotikų vartojimo. PLoS ONE 4 (11): e7985. Doi: 10,1371 /journal.pone.0007985

redaktorius: Niyaz Ahmedas universiteto Hyderabad, Indija

Įstojo: Birželis 4, 2009 m Priėmė: Balandis 27, 2009 m Paskelbta: Lapkričio 24, 2009

Visos teisės saugomos: © 2009 Li et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas remia Kinijos universiteto Honkonge. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

simbiotinėje mikroflora yra neatskiriama žmogaus būties [1]. Dauguma mikrobų gyvena mūsų virškinamajame trakte, su daugiau nei 800 rūšių iš devynių bakterijų ir vienas archaeal phyla. Tai įvairi mikroflora skatina žarnų brendimą [2], [3], [4], priimančiosios mityba ir atsparumas patogenas [5]. Mikrobai taip pat tiesiogiai bendrauti su užkrėsto žmogaus, reguliuojant žarnyno epitelio proliferaciją, riebalų saugojimo ir uždegiminių atsakymus [3], [6], [7]. Nors kai kurie mikrobai gali vienas šimtų sukelti sunkias ligas, daugelis lėtinių ligų yra tikriausiai dėl to pasipiktinimas bendrą mikrofloros. Pavyzdžiui, alergijos ir astmos yra susijęs su vaikystės antibiotikams, kurie gali pakeisti žarnyno mikrobiotą [8]. Kitos sąlygos, susijusios su žarnyno mikrofloros yra vėlai prasidėję autizmas [9], uždegiminė žarnų liga [10], ir vėžys [11].

Tradiciškai, auginimo pagrindu metodai yra naudojami gauti išskirtiems mikrobams toliau apibūdinimo. Tokie tyrimai pateikė mūsų supratimą mikrobiologijos pagrindus. Tačiau auginimas yra dažnai daug darbo ir gali nepavykti daugelį mikrobų. Mikroskopinis stebėjimas taip pat naudojamas įvertinti gausa mikrobų ir ribotai, priskiria mikrobais taksonus [12]. Neseniai 16S ribosomos RNR genas (rRNR) seka profiliai naudojami išsiaiškinti mikrobų įvairovę, dažnai į phylotype lygiu. Naudojant 16S rRNR sekos, mikrobai iš burnos [13], [14], stemplė [15], skrandžio [16], plonoji žarna [17], storosios žarnos [18], [19] ir makšties [20] buvo tirta. Šie tyrimai ištirti mikrobų įvairovę per žmogaus kūną ir atskleidė didelę gyventojų nedirbamų ir nežinomo mikrobų, kurie buvo nepagaunamas ir auginimo pagrįsti metodai. Per šiuos didelio našumo 16S rRNR sekos ir kitų metagenomic sekos pastangų, buvo rasta mikroflora pasipiktinimas būti susijęs su periodonto ligos [21] ir nutukimo [22], [23], [24].

skrandį , skrandžio rūgštingumas žudo daug praryti mikrobus. Tai paprastai buvo manoma, kad skrandis yra ne tinkamomis gyventi bet mikrobas iki atradimu, Helicobacter pylori parsisiųsti ir jo asociacija su gastritu ir pepsinė opa [25]. Išskyrus keletą kitų Helicobacter
rūšių [26], [27], [28], jis nebuvo tikimasi, kad skrandis būtų pateikiama daug kitų gyvų mikrobų. Sumažintas rūgštingumas dėl progresuojančio atrofinį gastritas gali padidinti mikrobų įvairovę [29]. Atliktas tyrimas Monstein et al.
Naudojant laiko temperatūros gradientas gelio elektroforezės (TTGE) ir nedidelio masto 16S rRNR sekos pasiūlė kitus mikrobus, pavyzdžiui, Enterococcus pervežimas Pseudomonas
Streptococcus
Staphylococcus parsisiųsti ir Stomatococcus
taip pat dalyvavo skrandyje [30]. Naujesnis didelio masto 16S rRNR sekos pastangų nustatyti 128 phylotypes nuo 8 phyla 23 Šiaurės Amerikos pacientų [16]. Įdomu tai, kad H buvimas. pylori
skrandyje neturėjo įtakos bendrą sudėtį tuo phylum lygio mikrofloros.

Šiame tyrime mes nuėjome toliau tirti galimą asociacijas tarp skrandžio mikrofloros pokyčių ir ne H. pylori parsisiųsti ir ne NVNU (NHNN) gastritas. Mes iškėlė hipotezę, kad kai H. pylori
nėra, kiti bakterinių grupės /rūšys gali prisidėti prie arba būti susijęs su gastritas vystymosi. Dėl mikrofloros lygio, mes taip pat norėtų spręsti pagrindinį klausimą srityje: kokia taksonas gylis (-ų) Ar mikroflora yra palyginti stabili tokia, kad pasipiktinimas šiais lygmenimis gali būti susiję su žmonių sveikata? Mes naudojome 16S rRNR geno klonavimas ir seka į profilį skrandžio mikrobiotą nuo normalu ir NHNN gastritas pacientus ir taksono konkrečių realaus laiko kiekybine PGR (qPCR) tyrimai kiekybiškai santykinę gausą firmicutes phylum ir Streptococcus
gentis.

rezultatai

Taksonas medžio analizė

analizuojami tiek kūno ir Ertmė biopsijos iš 5 normalių individų ir 5 NHNN antralinių gastritas asmenų (visų moterų, amžiaus atitikimo) , Visi pacientai, h. pylori
neigiamas tiek greito ureazės testą ir 16S rRNR sekos. Nė vienas iš pacientų ėmėsi NVNU per 6 mėnesius iki išgyvena endoskopija. Bent 60 klonai iš kiekvienos biopsija (įstaigos ar antralinėje dalyje, todėl bent 120 klonai iš kiekvieno) sekos buvo naudojant plataus diapazono 16S rRNR PGR produktus. Iš 1223 ne- , bendras h. buvo gauti pylori
mikrobų sekas. Šie mikrobai priklauso 8 phyla (133 phylotypes), iš kurių 5 phyla (firmicutes, bacteroidetes, Actinobacteia, Fusobacteria ir proteobakterijos) yra toje didžioji dauguma (1211 iš 1223, arba 99,0%). buvo nustatyti devyni phylotypes su sekos panašumo mažiau nei 97% iki sekų esančių viešųjų duomenų bazių. Šeši iš šių 9 phylotypes atstovavo vieno klonų (S1 Papildoma lentelė).

Jei ištirti bendrą atstovavimą įvairiose taksono lygių skrandžio biotos, mes sukonstravo taksono medį (1 pav ir papildoma S1 paveiksle). Įdomu tai, kad kiekvienas phylum vyravo tik viena ar dvi žemesnio taksono lygių (klasė, intonacija, šeimos arba genties). Kaip iš tiesų, kiekvienas phylum vyravo tik 1-2 genčių. Pavyzdžiui, gausiausi phylum firmicutes atstovavo 383 klonai, iš tų 333 klonai yra iš klasės bacilos. Vėliau 273 klonai buvo iš nutarties lactobacillales. Du šimtai penkiasdešimt keturi klonai buvo iš šeimos streptococcaceae. Ir visi 254 klonai buvo iš genties Streptococcus
. Penki labiausiai paplitusi genčių, įskaitant Streptococcus
(254 klonai) Prevotella
(243) Neisseria
(175) Haemophilus
(122) Porphyromonas
(68), sudarė 70,5% visų mikrobų klonai.

Rūšys turtingumas ir įvairovė

buvo naudojamas visas duomenų rinkinys (1223 klonai), geras aprėptis buvo 96%, tai rodo, kad keturi papildomi phylotypes tikėtina, kas 100 papildomų klonai turi būti sekos. Šis aprėpties lygis rodo, kad dauguma bakterijų sekos buvo tose sekvenuotuose klonai. Įvairovė įvertinimas apskaičiavimus 8.0 versijoje nurodoma, kad apie 200 phylotypes gali būti pateikti į žmogaus skrandžio biopsijos mėginių (Papildoma S2 pav). Mes taip pat įvertino rūšių turtingumą keturių skirtingų biopsijos mėginių (NMA (normalus Ertmė), NMB (normalus organas) AGA (antralinių Gastritas Ertmė), AGB (antralinių Gastritas įstaiga); Papildoma lentelė S2). Rūšis turtingumas nesiskyrė tarp antralinių gastritas biopsijos ir normalių biopsijų (p > 0,1, neporiniai T-testas)

Bakterinė mikroflora Palyginimas tarp dviejų skirtingų anatominių vietose (Ertmė ir kūno) Įprastomis pacientų
<. p> įprastų pacientams, nėra reikšmingas skirtumas buvo pastebėtas tarp dviejų anatominių vietose (Ertmė ir kūno) dėl bet kurios iš taksono grupių, išskyrus šeimos Prevotellaceae ir genties Prevotella pervežimas, kur p vertes (Pirsono chi -square testas) buvo tarp 0,01 iki 0,05 (1 paveikslas).

firmicutes phylum ir , Streptococcus
gentis buvo prisodrintas skrandžio antralinių gastritas pacientai

remiantis 1223 16S rRNR sekas, The firmicutes phylum buvo gausiausias phylum 383 klonai. Proteobakterijos phylum buvo artimas sekundę 345 klonai. Įdomu tai, kad firmicutes phylum buvo gausiai antralinių gastritas biopsijų negu įprastos biopsijų (41% vs 22%, 1 lentelė), o proteobakterijos phylum buvo gausiai normaliomis biopsijų (37% vs 20%). Nuo 16S rRNR sekos yra ekonomiškai pernelyg didesnio imties dydžio, mes sukūrėme taksono konkrečių realaus laiko kiekybine PGR (qPCR) metodą kiekybiškai įvertinti firmicutes gausa ir Streptococcus
(2 pav.) Taksono konkrečių qPCR duomenys firmicutes stipriai koreliavo su 16S rRNR sekos duomenų minėtų 20 biopsijos mėginių (2 biopsijos už kiekvieną iš 5 normalu ir 5 antralinių gastritas pacientų) (S3 Papildoma pav.)

septyniolika papildomos poros Ertmė ir kūno biopsijos mėginių iš normalių pacientų ir 18 papildomų poros Ertmė ir kūno biopsijos mėginių iš antralinių gastritas pacientų buvo analizuojami firmicutes specifinio qPCR. Visiškai, 90 biopsijos (46 mėginiai iš 23 antralinių gastritas pacientų ir 44 mėginių iš 22 normalių pacientų) buvo analizuojami (2 lentelė). Vidutinis amžius antralinių gastritas pacientams buvo 67,6 ± 11,4 (mediana: 69, diapazonas: 46 į 86), o vidutinis amžius kontrolės buvo 58,3 ± 14,7 (mediana: 52, diapazonas: nuo 40 iki 87). Vidutinis amžius įprastą grupės buvo jaunesnis negu antralinių gastritas grupės. Tačiau statistinė analizė parodė, kad nėra koreliacijos tarp amžiaus ir firmicutes arba , Streptococcus
gausa (p > 0,1) (Papildomas S4 pav.) Šie mėginiai buvo suskirstyti į 4 grupes, antralinių gastritas Ertmė (AGA), antralinių gastritas kūno (AGB), normalus Ertmė (NMA) ir normalaus kūno (NMB). Iš firmicutes gausa buvo reikšmingai didesnis AGA nei NMA ar NMB (ANOVA (dispersinė analizė) testas, p = 0,004 ir p = 0,046, atitinkamai), o AGB nei NMA (į vieną pusę ANOVA, p = 0,039 ) (3A pav). Reikšmingo skirtumo nepastebėta tarp AGA ir AGB (į vieną pusę ANOVA, p = 0,855), arba NMA ir NMB (p = 0,832).

Dėl tų pačių biopsijos mėginių, gentis , Streptococcus pervežimas taip pat buvo analizuojami Streptococcus
specifinę qPCR. , Streptococcus
gausa buvo 72% ir 76% didesnis AGA vs NMA ar NMB, atitinkamai, ir 66% ir 70% didesnis AGB vs NMA ar NMB, atitinkamai (3b pav.) P vertės ANOVA testas rodomi 3B pav. Panašus į firmicutes tyrime, nėra reikšmingas skirtumas buvo pastebėtas tarp AGA ir AGB (į vieną pusę ANOVA, p = 0,999), arba NMA ir NMB (p = 0,999).

, Streptococcus
auginimas ir biopsija skalbimo

vien aptikimas 16S rRNR genų sekų nereiškia, kad yra gyvų bakterijų ar bakterijos yra iš tiesų gyvena vietoj praeivių į skrandį. Mes taip atliekami du papildomus eksperimentus.

Pirmiausia, mes bandėme bakterijų auginimas iš biopsijos. Kultūra tinkamos būklės Streptococcus
buvo naudojamas, nes jie pasirodė per mažai atstovaujama antralinių gastritas pacientams. Šešiolika porų (Ertmė ir kūno) biopsijos buvo naudojami kultūros ant kraujo agaro lėkštelių. Kolonijos sekos buvo 16S rRNR geno identifikavimo. Vienuolika phylotypes yra Streptococcus
buvo izoliuotas (papildomą lentelę S3). Šie 11 phylotypes sudarė 93,3% (arba 237 iš 254 klonai) visų klonų nustatytiems plataus diapazono 16S rRNR sekos, nurodant, kad daugumą Streptococcus
phylotypes yra gyvas skrandžio biopsijos.

Antra, 14 biopsijomis iš abiejų antralinių gastritas ir paprastų pacientų buvo plaunami fosfatinio buferio druskų tirpalu (PBS) su trimis vis atšiauriomis sąlygomis. Jei atšiaurių skalbimo sąlygos neišimkite bakterijas iš biopsijos, tai įtaigus, kad šios bakterijos glaudžiai pridėti prie skrandžio gleivinę. Daugiau kaip 90% visų bakterijų liko pritvirtinti prie biopsijos po trijų iš eilės plaudami vis atšiauriomis sąlygomis (Papildoma S5A pav). Paskutinis plovimo etapas buvo padaryta didelės galios ant darbastalio sūkurinės mašina. Be to, dauguma Streptococcus
bakterijos liko pritvirtinti prie biopsijos po 3 skalbimo žingsnių (Papildoma S5B pav.)

Diskusijos

Šiame tyrime mes profiliuoti bakterijų mikroflora į suporuotas skrandžio biopsijos (Ertmė ir kūno) dėl įprastos ir antralinių gastritas pacientams. Visi pacientai yra h. pylori
neigiamas ir be NVNU vartojimas. Per plataus diapazono 16S rRNR genų sekos, mes nustatyti 1223 NPI H pylori
bakterijų klonai, panašus į ankstesnį tyrimą (BIK tyrimą, 1056 ne- H.pylori
bakterijų klonai) [16 ]. Nors du tyrimai analizavo du geografiškai (Honkongas vs Kalifornijoje) ir etniškai (kinų vs Kaukazo, lotynų ir Afro-amerikitiškas) skirtingų populiacijų, bendra mikroflora sudėtingumo yra stebėtinai panašus (3 lentelė). Abiejų tyrimų metu nustatyta maždaug 130 (133 ir 127 už tai ir Bik tyrimas, atitinkamai) phylotypes nuo septynių iki aštuonių phyla. Dauguma klonų (77,4% šio tyrimo ir 79,8% iš Bik tyrimo) buvo dalijamasi. Dvi labiausiai paplitęs genčių (, Streptococcus parsisiųsti ir Prevotella
) taip pat buvo identiški. Šios dvi gentys sudarė 40,6% ir 41,5% visų klonų šiame tyrime ir Bik tyrimas. Abu tyrimai parodė, kad maždaug 200 įvairių phylotypes gali būti pateikti į skrandžio gleivinę. Toks dramatiškas panašumas tarp šių dviejų tyrimų pabrėžiama, kad selektyvus spaudimą dėl mikrofloros pagal atšiaurių skrandžio aplinkoje. Be to, mes nustatėme, didelės įtakos bakterijų mikrofloros tarp dviejų anatominių vietų (Ertmė ir kūno) Įprastomis pacientams, nepaisant iš klinikinės reikšmės, biopsijos mėginių ėmimo skirtingu anatominių vietų [31].

Kadangi griežtas skalbimo žingsniai negalėjome atskirti mikrobiotą nuo biopsijų, mes iškėlė hipotezę, kad dauguma nustatytų bakterijų yra susiję sandariai skrandžio gleivinę. Be to, mes galėjome auginti daugumą Streptococcus
phylotypes identifikuojamos per plati nuotolio 16S rRNR sekos, o tai rodo, kad šios bakterijos gali iš tiesų būti tikri gyventojai skrandžio gleivinę.

Jei dar vertiname bendras sudėtingumas skrandžio mikrofloros, mes sukonstravo taksono medį remiantis nustatytais klonų pažvelgti į kiekvieno taksono lygiu, įskaitant phylum, klase, tam, šeimos ir genties. Įdomu tai, kad mes nustatėme, kad kiekvienam phylum, vienas arba du genčių, daugiausia buvo metu. Penki labiausiai paplitusi genčių, įskaitant , Streptococcus
(phylum firmicutes) Prevotella parsisiųsti ir Porphyromonas
(bacteroidetes), taip pat , Neisseria parsisiųsti ir Haemophilus
(proteobakterijos), sudarė 70,5% visų mikrobų klonai.

Įdomu tai, kad 16S rRNR profiliavimas atskleidė reikšmingas per atstovavimo firmicutes phylum (pirmiausia dėl per didelės atstovavimo mygtuką , Streptococcus
gentis per phylum) ir nepakankamo atstovavimas proteobakterijos phylum į biopsijų iš antralinių gastritas pacientams. Mes sukūrėme taksono konkrečių qPCR požiūrį į išanalizuoti firmicutes gausa ir Streptococcus
taksonai 90 biopsijų (46 mėginiai iš 23 antralinių gastritas pacientų ir 44 mėginių iš 22 normalių pacientų) ir patvirtino per atstovavimą šių dviejų taksonų į antralinių gastritas, skrandžio 42% ir 71%, atitinkamai. Dauguma Streptococcus
phylotypes identifikuotos sekos buvo alfa hemoliziniai bakterijos, kurios yra potencialūs patogenų (pvz , Streptococcus pneumoniae,
, Streptococcus mitis parsisiųsti ir , Streptococcus salivarius
). Tam tikri , Streptococcus
rūšys yra atsparios mažo pH sąlygomis ir gali išgyventi skrandžio [32]. Mūsų auginimo duomenys ir skalbimo eksperimentas taip pat parodė, kad tai buvo iš tikrųjų gyvena, gyventojo biotos skrandyje.

Ar yra , Streptococcus
gausa priežastinis už antralinių gastritas ar vietos aplinkos pokyčių didinimas dėl antralinių gastritas išliko būti atsakyta. Viena iš galimų požiūrio naudojant gemalų be pelės modelį [33]. Kitas intriguojantis klausimas yra tai, kad ar tam tikros mikrofloros sudėtį apsaugoti, arba alternatyviai, įjautrinti skrandžio gleivinę nuo invazija patogenų, tokių kaip H. pylori
. Galiausiai, naujas aukštos našumo sekos technologijos gali teikti išsamesnius duomenis apie mikrofloros iš skirtingų anatominių vietose palei žmogaus virškinimo trakte ir skirtingu laiku kiekis [34].

Medžiagos ir metodai

Skrandžio biopsijomis

Šis tyrimas patvirtino Kinijos universiteto Honkonge klinikinių tyrimų etikos komiteto. Visi pacientai davė parašyta informuoto sutikimo gavimo studijų pavyzdžius. Du skrandžio gleivinės biopsijos (Ertmė ir kūno skrandžio) buvo renkami iš kiekvieno paciento atliekant įprastinius endoskopijos metu Velso ligoninės Prince, Honkonge. Siekiant išvengti užkrėtimo, naujas sterilizuoti endoskopija žnyplės buvo naudojamas, priimdama antrąjį biopsiją iš to paties paciento. Į biopsijos buvo Snap-šaldyta ant sauso ledo ir saugomi -80 ° C temperatūroje. Pacientai, vartojantys antibiotikus ar NVNU (apibrėžiamas kaip bet NVNU naudojimo mažiausiai vieną savaitę per pastaruosius 3 mėnesius iki endoskopijos) arba išbandyti teigiamas H. pylori
greitas ureazės testas (RUT) arba histologinio testas buvo atmesti. Paciento demografija yra parodyta 2 lentelėje

Statybos 16S rRNR klonas bibliotekų ir sekos

Viso genomo DNR buvo išskirta iš biopsijos naudojant DNR mini rinkinys (Qiagen, Valencia, CA, USA ) su stiklu įveikti spragilas metodą kaip buvo aprašyta anksčiau [16]. Du neigiama kontrolė, turintys tik sterilaus vandens taip pat buvo ekstrahuojamas naudojant tą patį protokolą. Išimtos DNR koncentracija buvo matuojama NanoDrop 1000 Spektrofotometru (Thermo Scientific, Minneapolis, MN, JAV). Du universalūs bakterinės 16S rRNR gruntai, B8F20 [35] (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) ir B806R20 [36] (5'-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3 ") buvo naudojami sustiprinti regioną, atitinkančio 8 poziciją 806 iš Escherichia coli
16S rRNR geno. Į 25 pL PGR mišiniai įtraukta 1 × PGR buferis, įskaitant 1,5 mm MgCl _{2 (Qiagen), 20 mm Tetrametilamonio chlorido, 0,1 mM dNTP, 0,4 mikromolių kiekvieno gruntas, 1 vienetas Hotstar Taq DNR polimerazės (Qiagen) ir 2 pL išgauti DNR. Trisdešimt ciklas PGR buvo atliekama siekiant sustiprinti su 799 bp fragmentas. PGR produktai buvo patikrinti agarozės gelyje. Kiekvieno produkto vieno juosta gali būti stebima UV šviesoje, o ne juosta buvo pastebėtas už neigiamus kontrolės. 16S rRNR produktai buvo išvalytas su Sefadekse-50 kolonėlės (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, JAV) liguojami T vektorių ir virsta E. coli
JM109 ląsteles naudojant pGEM-T yra lengva vektoriaus sistema (PROMEGA, Madison, WI, JAV). Mes pasirinkome 5 pacientams (10 biopsijos mėginiai) su antralinių gastritas ir 5 normalius kontrolę (10 biopsijomis) statyti 20 16S rRNR genų bibliotekos. Kiekvienam skrandžio biopsijos bibliotekoje, ne mažiau kaip 60 kolonijų buvo atrinkti dėl sekos. PGR produktai buvo sekos naudojant BigDye terminatorius v3.1 ciklas sekvenavimo komplektas (taikoma BIOSYSTEMS Foster City, CA, JAV). Sekos reakcijos naudojant B8F20 kaip sekos gruntas buvo atliekamas ABI 3730xl sequencer (Applied Biosystems)}

Filogenetinė analizė ir mikrobų įvairovė įvertinimas

chimeriniq bandymą, naudojant Belerofonas serverio (http.: //foo.maths.uq.edu.au/~huber/bellerophon.pl) [37] buvo išbandyti potencialius chimerinius sekas. Vienas klonas buvo nustatyta, kad chimerinis ir vėliau neįtraukiami. Tada 1223 nonchimeric sekos buvo analizuojami KPP II (Ribosominš Duomenų bazės projektas II) klasifikatorius (http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp) remiantis naivus Bajeso rRNR klasifikatoriaus [38]. Pagrindinis vietos suderinimas paieškos įrankis (BLAST) pateikė Žaliųjų genų (http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-blast_interface.cgi) buvo atliktas rasti labiausiai panašus sekas duomenų bazėje. Mes naudojome 97% sekos identiškumą kaip apibrėžti phylotypes [39] nukirpimas. Sekas su tapatybės < 97% iki esamų sekų duomenų bazėje buvo laikomas romanas. Taksonas medis buvo apskaičiuota naudojant klasifikavimo rezultatą RPD II klasifikatorių. Chao1 prognozė sąmatos 8 programos (http://viceroy.eeb.uconn.edu/estimates~~HEAD=pobj) buvo naudojamas įvertinti mikrobų įvairovę. Geras metodas buvo naudojamas apskaičiuoti sekvenavimo aprėptį [40].

Realaus laiko kiekybine PGR (qPCR)

"Q-PCR pradmenys ir zondai buvo sukurta remiantis sekų, gautų iš klonuotų bibliotekose. Mes pirmą kartą suderintos visų klonuoti sekomis clustalw (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) su numatytuosius parametrus. Į qPCR pradmenys buvo B8F20 ir B801R21 (5'-ACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3 "). MGB zondas sekos yra: bendrinis zondas (VIC) 5'-CAGCAGCCGCGGTAA-3 ", firmicutes zondas (FAM) 5'-AAGATTCCCTACTGCTGCCT-3" ir , Streptococcus
zondas (FAM) 5'-TACACATGGAATTCCAC-3 " , Norint išmatuoti tam tikro taksono gausa, du zondai (vienas konkretus palūkanoms taksono o antrasis bendruosius visų bakterijų) buvo naudojami tuo pačiu PGR amplifikacijos. (2 pav.) 25 pL PGR mišinys Included 1 x buferio A, 3,5 mm MgCl _{2, 200 mkm dNTP su dUTP vietoj dTTF, 400 Nm kiekvieno gruntas, 100 Nm kiekvieno zondo 0,01 V /pL Uracilas N-glikozilazė, ir 0,05 V /pL TaqGold (Taikomoji Biosystems). Dėl firmicutes specifinio testą, dviračių sąlyga buvo: 1) 50 ° C temperatūroje 2 min; 2) 95 ° C temperatūroje 10 min; 3) 40 ciklai 95 ° C temperatūroje 20 sekundžių, 58 ° C temperatūroje 15 sekundžių, 70 ° C temperatūroje 80 sek. Dėl Streptococcus
specifinę testą, dviračių sąlyga buvo: 1) 50 ° C temperatūroje 2 min; 2) 95 ° C temperatūroje 10 min; 3) 40 ciklai 95 ° C temperatūroje 20 sekundžių, 57 ° C temperatūroje 1 min, 70 ° C temperatūroje 1 min. Streptococcus
16S rRNR fragmentas (DQ346438) klonuotas į pGEM-T yra lengva vektorius buvo naudojamas kaip qPCR standartą (tiek firmicutes ir Streptococcus
tyrimų) į ABI 7500 nekilnojamojo Game PGR sistema (Applied Biosystems). Gavęs nedidelį skirtumą tarp bendrųjų ir taksono konkrečių zondai, Delta Delta riba ciklas (ddCt) buvo naudojamas nurodyti konkretaus taksono gausa visai bakterijų populiacijos (Ct TSU:. Ct taksono konkretaus zondo iš Nežinoma mėginiai, Cl BUU: Ct bakterijų universalus zondas nežinomų pavyzdžių, Cl PSD: Ct taksono konkretaus zondo iš plazmidžių standartą, Cl BSS: Ct bakterijų universalus zondas iš plazmidžių standartą)}

Teoriškai taksono gausa 2 ^-ddCt.

, Streptococcus
įdirbimo

gauti 32 papildomų biopsijų iš 16 pacientų, bakterinė kultūra. Į biopsijos buvo įdėti į fosfatinio buferio druskų tirpalu (PBS, pH = 7,2) ir supjaustyti į mažesnius gabalus skalpeliu. Tada bandiniai buvo paskleidžiamas ant kraujo agaro lėkštelių (CM331, OXOID Basingstoke, Jungtinė Karalystė) su 5% arklių kraujo. Plokštelės buvo dedamas į 5% CO _{2 inkubatorių 37 ° C temperatūroje 24 valandas. Kolonijos su hemolizės dėl kraujo agaro buvo atrinktos siekiant 16S rRNR sekos.}

Biopsija skalbimo

biopsija skalbimo bandymas, buvo surinkti 14 papildomi mėginiai iš abiejų antralinių gastritas pacientų ir normalių žmonių. Kiekvienas mėginys buvo dedamas į 2,0 ml mėgintuvėlį ir plaunami 3 kartus (200 pL PBS kiekvienam plovimui) pagal labiau atšiauriomis sąlygomis. Pirmasis skalbimo buvo padaryta švelniai ranka purtant. Supernatantas buvo perduodamas iš. Nauja PBS buvo įtraukta į tolesnio plovimo biopsijos. Dėl antrojo ir trečiojo plovimo, vamzdžiai buvo pavartomas pagal vamzdis maišytuvo Trio TM-2F (All-Lab mokslo, AS), esant 3 klasė bei lygis 6 galios lygis atitinkamai, maždaug atitinkantis švelnus ir energingai intensyvų maišymą. Tada dvipusis realaus laiko PGR buvo atliekama siekiant patikrinti bendrą bakterijas ir Streptococcus
kiekiai LPS nuopile iš trijų skalbimo žingsnius ir nuplauti biopsijų.

Statistika analizė

Pearson chi-kvadrato testas buvo naudojamas palyginti klonas skaičių skirtingų taksonų tarp skirtingų imčių grupių (NMA: normalus Ertmė, NMB: normalus kūno AGA: antralinių gastritas Ertmė, AGB: antralinių gastritas kūno) nuo 16S rRNR sekos rezultatas, kai klonas numeris kiekvienam mėginio grupės buvo bent 10. dispersinė bandymas buvo naudojamas palyginti bakterijų gausa duomenis iš qPCR tyrimų. Visi tyrimai buvo atliekami naudojant SPSS for Windows versija 11.5 (SPSS Inc., Chicago, IL, JAV). P < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas. Lyginti rūšių gausos tarp įprastų ir antralinių gastritas pacientams, faktinis phylotype numeris kiekvienam pacientui buvo skaičiuojamas pirmas. tada neporiniai T-testas buvo naudojamas palyginti dvi pacientų grupes.

Pagalbinė informacija
S1 paveiksle.
Detali taksonas medis
Doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s001
(2.00 MB TIF)
S2 pav.
rūšių gausos įvertinimas
Doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s002
(0,97 MB TIF)
S3 pav.
Koreliacija tarp qPCR ir 16S rRNR klonavimo ir sekos
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s003
(0.98 MB TIF) pervežimas S4 pav.
Trūksta koreliacija tarp pacientų amžiaus ir firmicutes arba Streptococcus gausa
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s004
(2.01 MB TIF) pervežimas S5 pav.
Griežtas skalbimo nepašalina bakterijas iš biopsijos
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s005
(1.90 MB TIF)
Stalo S1.
Nauji phyltoypes
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s006
(0,03 MB XLS)
Lentelė S2.
rūšių gausos įvertinimas skirtingose ​​biopsijos mėginių
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s007
(0,02 MB XLS)
S3 lentelėje.
Doi: /journal.pone.0007985.s008
(0,02 MB XLS)
10,1371

• PLoS ONE: Glaudesnis M1 makrofagų poliarizacija Žmogaus Helicobacter pylori Associated atrofijos gastritas ir paskiepyti Mice
• PLoS ONE: izocitrato dehidrogenazės Helicobacter pylori potencialiai sukelia humoralinį imuninį atsaką Asmenų, sergančių dvylikapirštės žarnos opa ir Gastritis