PLoS One: Bakteriális Microbiota profilalkotás gyomorhurut nélkül Helicobacter pylori fertőzés vagy nem-szteroid gyulladáscsökkentő szer használata

absztrakt katalógusa

A legutóbbi 16S riboszóma RNS gén (rRNS) molekuláris profilalkotás a gyomor nyálkahártya kiderült meglepő komplexitása mikrobióta. Helicobacter pylori
fertőzés és a nem-szteroid gyulladásgátló szer (NSAID) használat két fő hozzájáruló gyomorhurut és a peptikus fekély. Azonban keveset tudunk a szövetség között más tagjai a gyomor mikroorganizmusok és gyomorbetegségek. Ebben a vizsgálatban, klónozása és szekvenálása a 16S rRNS-t használt profil a gyomorban mikrobióta a szokásos és a gyomorhurut betegeknél. Száz és harminchárom phylotypes nyolc bakteriális törzsek azonosítottak. A gyomrot mikrobióta találták, hogy szorosan tapad a nyálkahártyát. Tizenegy Streptococcus katalógusa phylotypes sikeresen művelt a biopsziát. Egy-két nemzetséget képviselők többsége klónok belül bármely azonosított törzsek. Mi továbbfejlesztette két valós idejű kvantitatív PCR-vizsgálatokhoz számszerűsíteni relatív gyakorisága firmicutes törzs és a Streptococcus katalógusa nemzetség. Szignifikánsan magasabb bősége firmicutes törzs és a Streptococcus katalógusa nemzetségbe tartozó firmicutes törzs volt észlelték antrális gyomorhurut, mint a normál kontroll. Ez a tanulmány azt sugallja, hogy a nemzetség taxon szint nagyrészt képviseli sokkal magasabb taxon, mint a törzs. A klinikai és a mechanizmus alapjául a megváltozott bélflóra összetételét gyomorhurut igényelnek további funkcionális vizsgálatok. Katalógusa

Citation: Li XX, Wong GL-H, KF, Wong VW-S, Lai LH, Chow DK-L, et al. (2009) Bakteriális Microbiota profilalkotás gyomorhurut nélkül Helicobacter pylori fertőzés katalógusa vagy nem-szteroid gyulladáscsökkentő szer használata. PLoS ONE 4 (11): e7985. doi: 10,1371 /journal.pone.0007985 katalógusa

Szerkesztő: Niyaz Ahmed, University of Hyderabad, India katalógusa

Beérkezett: június 4, 2009; Elfogadva: október 27, 2009; Megjelent: november 24, 2009 katalógusa

Copyright: © 2009 Li et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatja a kínai University of Hong Kong. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

Kommenzális mikrobióta szerves része az emberi lény [1]. A túlnyomó többsége mikrobák élnek a gyomor-bél traktus, több mint 800 faj kilenc bakteriális és egy archaeal törzsekbe. Ez a változatos bélflóra hozzájárul a bél érésének [2], [3], [4], fogadó táplálkozás és patogénrezisztencia [5]. A mikrobák is közvetlenül hatnak az emberi gazda szabályozása által bél epiteliális proliferáció, a zsír lerakódását és a gyulladásos reakciókat [3], [6], [7]. Míg bizonyos mikrobák egymaga komoly betegséget okozhat, számos krónikus betegség valószínűleg miatt zavarok a teljes mikroorganizmusok. Például, allergiák és asztma kapcsolódó gyermekkori antibiotikum használat, amelyek megváltoztathatják a bél mikrobióta [8]. Egyéb állapotok társított intesztinális mikrobióta közé késői autizmus [9], a gyulladásos bélbetegség, [10] és a rák [11].

Hagyományosan, a termesztési alapú módszerek alkalmazásával érik mikrobiális izolátumok a további jellemzéshez. Az ilyen vizsgálatok alapján az alapja, hogy megértsük a mikrobiológia. Azonban termesztés gyakran munkaigényes, és nem sok mikrobák. Mikroszkópos megfigyelés is használják becslésére bőség mikrobák, és korlátozott mértékben, hozzárendeli mikrobák taxon [12]. Nemrégiben 16S riboszóma RNS gén (rRNS) szekvenciát profilokat használni tisztázása mikrobiális sokféleség, gyakran a phylotype szinten. A 16S rRNS-szekvenálás, mikrobák száj [13], [14], a nyelőcső [15], a gyomor [16], a vékonybél [17], a vastagbél [18], [19], és a hüvely [20] vizsgálták. Ezek a vizsgálatok feltárt mikrobiális sokféleség az emberi szervezetben, és kiderült, egy hatalmas népessége műveletlen és nem jellemzett mikrobák volt, amely megfoghatatlan termesztésre alapú módszerek. Ezeken a nagy áteresztőképességű 16S rRNS szekvenálása és egyéb Metagenomika szekvenálás erőfeszítések bélflóra zavarok találták társítható fogágybetegség [21] és az elhízás [22], [23], [24]. Katalógusa

A gyomorban , a gyomor savasságát megöl sok lenyelt mikrobák. Ez általában úgy vélték, hogy a gyomor nem lakható semmilyen mikroba, amíg a felfedezés Helicobacter pylori katalógusa és kapcsolata gyomorhurut és a peptikus fekély [25]. Más, mint néhány más Helicobacter katalógusa fajok [26], [27], [28], nem volt várható, hogy a gyomor tartalmazna sok más élő mikrobák. Csökkentett savtartalma miatt progresszív sorvadásos gyomorhurut növelheti mikrobiális sokszínűség [29]. Egy tanulmány szerint Monstein et al.
Alkalmazásával időbeli hőmérsékleti gradiens gélelektroforézis (TTGE) és egy kisméretű 16S rRNS szekvenálása javasolt egyéb mikrobák, mint a Enterococcus katalógusa, Pseudomonas katalógusa Streptococcus katalógusa, Staphylococcus katalógusa és Stomato katalógusa is jelen voltak a gyomorban [30]. Egy újabb nagyszabású 16S rRNS szekvenálása erőfeszítés azonosított 128 phylotypes 8 törzsek 23 észak-amerikai betegek [16]. Érdekes, hogy a jelenléte H. pylori
a gyomorban nem érinti az általános összetétele a bélflóra, a törzs szinten. katalógusa

Ebben a tanulmányban, mentünk tovább, hogy vizsgálja meg a lehetséges összefüggéseket gyomor mikroorganizmusok változások és non H. pylori katalógusa és nem NSAID (NHNN) gastritis. Azt feltételeztük, hogy ha a H. pylori
nincs jelen, más bakteriális csoportok /fajok hozzájárulhat vagy társul gyomorhurut fejlődését. A mikroorganizmusok szintjét, azt is szeretnék foglalkozni kulcskérdés a területen: a mi taxon mélység (ek) nem a bélflóra tűnik viszonylag stabil, hogy zavarok ezeken a szinteken relevánsak lehetnek az emberi egészségre? Mi használt 16S rRNS gén klónozása és szekvenálása a profil a gyomor mikroorganizmusok a szokásos és NHNN gyomorhurut betegek, és taxon-specifikus, valós idejű, kvantitatív PCR (qPCR) vizsgálatokban számszerűsíteni relatív gyakorisága firmicutes törzs és a Streptococcus
nemzetség. katalógusa

Eredmények katalógusa

Taxon fa elemzés katalógusa

elemeztük a test és antrumban biopszia 5 normál egyének és 5 NHNN antrális gastritis egyének (minden nő, életkor szerint illesztett) . Minden beteg H. pylori
negatív egyaránt gyors ureáz teszt és 16S rRNS szekvenálása. Egyik beteg vett NSAID belül megelőző 6 hónap alatt endoszkópia. Legalább 60 klónok mindegyikéből biopszia (szervezet vagy antrum, így legalább 120 klónt egyes) szekvenáltuk segítségével széles spektrumú 16S rRNS PCR-termékek. Összesen 1223 nem H. pylori
mikrobiális szekvenciákat kapunk. Ezek a mikrobák tartoznak 8 törzsek (133 phylotypes), ebből 5 törzsek (firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteia, Fusobacteria és Proteobacteria) vannak jelen a túlnyomó többség (1211 out of 1223, vagy 99,0%). Kilenc phylotypes szekvencia hasonlóság kevesebb, mint 97% a szekvenciák jelen vannak a nyilvános adatbázisokban azonosítottuk. Ezek közül hat 9 phylotypes képviselte egyetlen klónt (kiegészítő táblázat S1). Katalógusa

Annak vizsgálatára, a teljes képviseletét a különböző taxon szinten a gyomorban élővilág létrehoztunk egy taxon fát (1. ábra és kiegészítő ábra S1). Érdekes, hogy minden törzs uralta csak egy vagy két alsó taxon szinten (osztály, rend, család vagy nemzetség). Ami azt illeti, minden törzs uralta csak 1-2 nemzetségek. Például, a leggyakoribb Törzs firmicutes képviselte 383 klónt, az említett 333 klónok az osztály baktériumok. Ezt követően 273 klónokat a sorrendben Lactobacillales. Kétszázötven négy klón volt a család Streptococcaceae. És 254 klónt nemzetségből származó Streptococcus katalógusa. Az öt leggyakoribb nemzetségek beleértve Streptococcus katalógusa (254 klón), Prevotella katalógusa (243), Neisseria katalógusa (175), Haemophilus katalógusa (122) Porphyromonas katalógusa (68), alkotja 70,5% -a az összes mikroba klónok. katalógusa

a fajgazdagság és a sokszínűség katalógusa

Ha az egész adatbázisba (1223 klónok) használtuk, jó lefedettsége volt 96%, jelezve, hogy négy további phylotypes lenne várható, minden 100 további klónokat kell szekvenáltuk. Ez a szint a lefedettség jelezte, hogy többsége a bakteriális szekvenciák voltak jelen a szekvenált klónok. Diversity becslés A becslések verzió 8.0 azt jelezte, hogy körülbelül 200 phylotypes jelen lehetnek az emberi gyomorban biopsziás mintákban (kiegészítő ábra S2). Mi tovább becsülte a fajgazdagság négy különböző biopsziás mintákban (NMA (normál Antrum), NMB (Normal Body) AGA (antrális gyomorhurut Antrum), AGB (antrális gyomorhurut Body) Kiegészítő táblázat S2). Fajgazdagság között nem volt különbség az antrális gastritis biopszia, és normális biopszia (p > 0,1, páratlan t-teszt). Katalógusa

A bakteriális mikrobák összehasonlítása két különböző anatómiai területeken (antrumban és test) normál betegek katalógusa

a normál betegeknél nem volt szignifikáns különbség a két lokalizációjú (antrumban és test) bármelyik taxon csoportok, kivéve a családi Prevotellaceae és a nemzetség Prevotella katalógusa, ahol a p-értékek (Pearson-féle chi négyzet próbát) között volt 0,01-0,05 (1. ábra). katalógusa

firmicutes törzs és Streptococcus katalógusa nemzetség gazdagodott a gyomorban antrális gyomorhurut betegek katalógusa

Ennek alapján a 1223 16S rRNS szekvenciák, a firmicutes törzs volt a leggyakoribb törzs 383 klón. A Proteobacteria törzs volt szoros második, 345 klón. Érdekes, hogy a firmicutes törzs volt sokkal nagyobb a antrális gastritis biopsziák, mint normál biopsziák (41% vs. 22%, 1. táblázat), míg a Proteobacteria Törzs volt sokkal nagyobb a normál biopsziák (37% vs. 20%). Mivel 16S rRNS szekvenálás költsége megfizethetetlen egy nagyobb minta, kifejlesztettünk egy taxon-specifikus, valós idejű, kvantitatív PCR (qPCR) megközelítés számszerűsíteni a rengeteg firmicutes és Streptococcus katalógusa (2. ábra). A taxon-specifikus qPCR adatok firmicutes nagymértékben korreláltak a 16S rRNS szekvenálási adatok a fent említett 20 biopsziás mintákban (2 biopsziát az egyes 5 normál és 5 antrális gastritis beteg) (kiegészítő ábra S3).

tizenhét további pár antrumból és test biopsziás mintákban normál egyénektől és további 18 pár antrumból és test nyert minták antrális gyomorhurut betegek elemeztük firmicutes-specifikus qPCR. Teljesen, 90 biopsziák (46 minta a 23 antrális gyomorhurut betegek és 44 származó minták 22 normál beteg) elemeztük (2. táblázat). Az átlagéletkor a antrális gyomorhurut betegek 67,6 ± 11,4 (medián: 69, tartomány: 46-86), míg az átlagos életkora a kontrollok 58,3 ± 14,7 (medián: 52, tartomány: 40-87). Az átlagéletkor a normál csoporthoz fiatalabb volt, mint az antrális gyomorhurut csoport. De a statisztikai elemzés azt mutatta, hogy nincs összefüggés az életkor és a firmicutes vagy Streptococcus katalógusa bőség (p > 0,1) (Kiegészítő ábra S4). Ezeket a mintákat 4 csoportba osztjuk, antrális gastritis antrum (AGA), antrális gastritis test (AGB), normális antrum (NMA), és a normál test (NMB). A rengeteg firmicutes szignifikánsan magasabb volt AGA mint NMA vagy NMB (one-way ANOVA (varianciaanalízis) teszt, p = 0,004 és p = 0,046, sorrendben), és az AGB, mint NMA (egyutas ANOVA, p = 0,039 ) (3A ábra). Nem volt szignifikáns különbség között AGA és AGB (egyutas ANOVA, p = 0,855), illetve NMA és az NMB (p = 0,832). Katalógusa

Az azonos biopsziás mintákban, a nemzetség Streptococcus katalógusa is elemeztük Streptococcus katalógusa specifikus qPCR. Streptococcus katalógusa bőség volt 72% és 76% -kal volt magasabb az AGA vs. NMA vagy NMB -kal, és 66%, illetve 70% -kal volt magasabb az AGB vs. NMA vagy NMB, illetőleg (3B). A p értékeket ANOVA teszt ábrán mutatjuk be a 3B. Hasonló a firmicutes vizsgálatban nem volt szignifikáns különbség a között AGA és AGB (egyutas ANOVA, p = 0,999), illetve NMA és az NMB (p = 0,999). Katalógusa

Streptococcus katalógusa termesztés és biopszia mosás katalógusa

a puszta észlelése 16S rRNS gén szekvenciák nem jelenti azt, hogy az élő baktériumok vannak jelen, vagy a baktériumok valóban rezidens helyett járókelők a gyomorban. Mi így elvégzett két további kísérleteket. Katalógusa

Először megpróbáltuk baktériumok termesztés a biopsziát. A kultúra alkalmas állapotban Streptococcus katalógusa használták, mivel úgy tűnt, hogy felülreprezentáltak antrális gyomorhurut betegek. Tizenhat párok (antrumban és test) a biopsziát használt táptalaj a véres agar lemezeken. A telepeket ütemezni a 16S rRNS gén azonosításához. Tizenegy phylotypes a Streptococcus katalógusa izoláltunk (kiegészítő táblázat S3). Ezek 11 phylotypes alkotja 93,3% (vagy 237 közül 254 klón) az összes klón azonosított széles körű 16S rRNS szekvenálása, jelezve, hogy nagy része a Streptococcus katalógusa phylotypes él a gyomor biopszia.

Másodszor, 14 biopsziás mintákban mind antrális gyomorhurut és a normál betegeknél mostuk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) háromszor egyre mostoha körülmények között. Ha durva mosási körülmények ne távolítsa el a baktériumokat a biopszia, hogy azt sugallják, hogy ezek a baktériumok tulajdonítanak szorosan a gyomor nyálkahártyáját. Több mint 90% a teljes baktérium maradt csatolt a biopsziát, miután három egymást követő mosások egyre zord körülmények (kiegészítő ábra S5A). Az utolsó mosási lépést tenni a nagyteljesítményű asztali gép örvény. Hasonlóképpen többsége Streptococcus baktériumok katalógusa tapadva maradt a biopszia után 3 mosási lépések (kiegészítő ábra S5B). Katalógusa

Vita katalógusa

Ebben a tanulmányban már felmértük az bakteriális mikroorganizmusok páros gyomor biopszia (antrumban és test) a szokásos és a antrum gastritis betegeknél. Minden beteg H. pylori
negatív nélkül NSAID alkalmazása. Keresztül széles spektrumú 16S rRNS gén szekvenálás azonosítottunk 1223 nem H pylori baktérium katalógusa klónok, hasonlóan egy korábbi tanulmány (Bik tanulmány 1056 nem H pylori baktérium katalógusa klónok) [16 ]. Bár a két tanulmány elemzett két, földrajzilag (Hong Kong vs. California) és az etnikai (kínai vs. kaukázusi, Spanyolok és afroamerikai) eltérő populációk, az általános mikroorganizmusok bonyodalmak meglepően hasonló (3. táblázat). Mindkét tanulmány feltárt mintegy 130 (133 és 127 erre a Bik tanulmány -kal) phylotypes héttől nyolcig törzsekbe. Többsége a klónok (77,4% E tanulmány és 79,8% -a Bik tanulmány) osztottak. A két legelterjedtebb nemzetségek ( Streptococcus katalógusa és Prevotella katalógusa) is azonos. Ez a két nemzetségek képviselte 40,6% és 41,5% -a az összes klón ebben a vizsgálatban és a Bik tanulmány. Mindkét tanulmány azt mutatta, hogy körülbelül 200 különböző phylotypes lehetnek jelen a gyomor nyálkahártyáját. Az ilyen drámai hasonlóság a két vizsgálat között kiemeli a szelekciós nyomás a bélflóra alatt a kemény gyomor környezetet. Továbbá, azt találtuk, kicsi a különbség a bakteriális mikrobióta a két anatómiai helyek (antrum és test) normál betegeknél, annak ellenére, hogy a klinikai jelentősége mintavétel, a különböző anatómiai helyeken [31].

Tekintettel arra, hogy a szigorú mosási lépések nem voltak képesek elválasztani a mikrobióta a biopsziák, feltételezzük, hogy többsége az azonosított baktérium összefüggésbe szorosan a gyomor nyálkahártyáját. Továbbá, tudtuk művelni többsége Streptococcus katalógusa phylotypes révén azonosított széles körű 16S rRNS szekvenálása, ami arra utal, hogy ezek a baktériumok lehet igaz lakosok a gyomor nyálkahártyáját. Katalógusa

Hogy tovább értékeljük a teljes összetettségét gyomor mikrobióta létrehoztunk egy taxon fa alapján azonosított klónok nézni minden taxon szinten, beleértve törzs, osztály, rend, család és nemzetség. Érdekes módon azt találtuk, hogy minden egyes törzs, egy vagy két nemzetségek voltak túlnyomórészt jelen. Az öt leggyakoribb nemzetségek beleértve Streptococcus katalógusa (törzsben firmicutes), Prevotella katalógusa és Porphyromonas katalógusa (Bacteroidetes), valamint a Neisseria katalógusa és Haemophilus katalógusa (Proteobacteria) alkotja 70,5% -a az összes mikroba klónok. katalógusa

Érdekes, hogy a 16S rRNS profilalkotás kiderült jelentős felülreprezentáltsága a firmicutes törzs (elsősorban a felülreprezentáltsága a Streptococcus katalógusa nemzetségbe tartozó törzs) és egy alulreprezentáltak a Proteobacteria törzs a biopsziás mintáit antrum gastritis betegeknél. Kidolgoztunk egy taxon-specifikus qPCR megközelítés, hogy elemezze a bőség a firmicutes és streptococcus katalógusa taxon 90 biopszia (46 minta 23 antrális gyomorhurut betegek és 44 minta a 22 normál beteg), és megerősítette a felülreprezentáltsága E két taxon antrális gyomor gyomor 42%, illetve 71% volt. A legtöbb Streptococcus katalógusa phylotypes azonosított szekvenálás volt alfa-hemolitikus baktériumok, amelyek potenciális kórokozók (pl Streptococcus pneumoniae katalógusa, Streptococcus mitis katalógusa és Streptococcus salivarius
). Egyes Streptococcus
fajok ellenállóak az alacsony pH-jú körülmények, és túlélni a gyomorban [32]. A gazdálkodási adatok és mosási kísérlet is javasolta, hogy ezek valóban élő, lakó élőlények összességében a gyomorban. Katalógusa

Azt, hogy a növekedés Streptococcus katalógusa bőség okozója az antrális gyomorhurut vagy eredményeként a helyi környezeti változások miatt antrális gyomorhurut maradt meg kell válaszolni. Az egyik lehetséges megközelítés segítségével csíramentes egérmodellben [33]. Egy másik érdekes kérdés, hogy vajon bizonyos mikroorganizmusok készítmények védik, vagy pedig tudatosítani kell a gyomornyálkahártya betörő kórokozókat, mint a H. pylori
. Végül, az új nagy teljesítményű szekvenálás technológiák várhatóan több átfogó adatok mikroorganizmusok különböző anatómiai helyeken mentén az emberi emésztőrendszert, és különböző időpontokban. [34] katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

A gyomor biopsziás

Ez a tanulmány által jóváhagyott kínai University of Hong Kong klinikai kutatások etikai bizottság. Minden beteg írásban beleegyezését megszerezze a tanulmány példányok. Két gyomor nyálkahártya biopsziát (antrumban és a test a gyomorban) vettünk minden egyes beteg rutin endoszkópia a Prince of Wales Kórház, Hong Kong. A szennyeződés elkerülése érdekében egy új sterilizált endoszkópos csipeszek használtunk, ha figyelembe egy második biopsziát az azonos beteg. A biopsziákat Snap-szárazjégen megfagyasztjuk, és -80 ° C-on. A betegek antibiotikum szedése vagy NSAID (definíció szerint bármely felhasználása NSAID legalább egy héttel az elmúlt 3 hónapban előtt endoszkópia), vagy pozitív eredményt mutatott, H. pylori katalógusa gyors ureáz teszt (RUT) vagy szövettani vizsgálat kizárták. A beteg demográfiai mutatja a 2. táblázat

Építőipari 16S rRNS klón könyvtárak és szekvenálás

teljes genomiális DNS-t izoláltunk a biopsziák segítségével a DNS-Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA ) üveg verte verő módszer a korábban leírt [16]. Két negatív kontrollok csak steril vízzel is extraháljuk azonos protokoll. A kivont DNS-koncentrációkat mértük NanoDrop 1000 spektrofotométerrel (Thermo Scientific, Minneapolis, MN, USA). Két univerzális bakteriális 16S rRNS alapozók, B8F20 [35] (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') és B806R20 [36] (5'GGACTACCAGGGTATCTAAT-3') amplifikálására alkalmaztuk a régió megfelelő pozícióban 8-806 Escherichia coli katalógusa 16S rRNS gén. A 25 ul PCR-keverékeket tartalmaz 1 × PCR puffer, beleértve 1,5 mM MgCI _{2 (Qiagen), 20 mM tetrametil-klorid, 0,1 mM mindegyik dNTP-ből, 0,4 uM mindegyik primerből, 1 egység HotStar Taq DNS-polimeráz (Qiagen), és 2 jii kivont DNS-t. A harminc ciklus PCR segítségével erősíti fel a 799 bp fragmentum. A PCR-termékeket ellenőrzött agaróz gél elektroforézissel. Az egyes termékek esetében, egyetlen sáv volt megfigyelhető UV-fény alatt, miközben nincs sáv volt megfigyelhető a negatív kontrollok. A 16S rRNS-termékeket tisztítottuk Sephadex G-50 oszlopon (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ligáltuk a T vektorok és átalakul E. coli
JM109 sejtek segítségével a pGEM-T Easy vektorba rendszer (Promega, Madison, WI, USA). Kiválasztottunk 5 beteg (10 biopsziás minta) az antrális gyomor és 5 normál kontrollok (10 biopsziás minta) építésére 20 16S rRNS gén könyvtárak. Minden egyes gyomor-biopszia Library, legalább 60 telepeket szelektáltunk szekvenálás céljából. A PCR-termékeket szekvenáltuk alkalmazásával BigDye terminátor v3.1 ciklus szekvenáló kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). A szekvenálás reakciókat B8F20 a szekvenálás primer végeztük ABI 3730xl szekvenátorral (Applied Biosystems). Katalógusa}

filogenetikai elemzés és mikrobiális sokféleség becslése katalógusa

A kiméra teszt segítségével Bellerophon szerver (http: //foo.maths.uq.edu.au/~huber/bellerophon.pl) [37] a használt teszt potenciális kiméra szekvenciákat. Egy olyan klónt találtunk, hogy kiméra és ezt követően kizárt. Ezután a 1223 nem kiméra szekvenciákat elemeztek RDP II (riboszóma Database Project II) osztályozó (http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp) alapján naiv Bayes osztályozó rRNS [38]. Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) által nyújtott Zöld gének (http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-blast_interface.cgi) végeztünk, hogy megtalálják a leginkább hasonló szekvenciákat az adatbázisban. Mi használt 97% -os szekvencia azonosság, mint a cutoff meghatározásáért phylotypes [39]. Szekvenciák identitás < 97% a meglévő szekvenciák a adatbázisra újszerűnek tekinthető. A taxon fa került kialakításra, a besorolás eredménye RPD II osztályozó. Chao1 becslő becslések 8 programot (http://viceroy.eeb.uconn.edu/estimates) alkalmaztak a mikrobiális sokféleség. Jó-módszer segítségével számítottuk szekvenálás lefedettség [40].

Valós idejű kvantitatív PCR (qPCR)

Q-PCR primereket és próbákat terveztünk szekvenciák alapján nyert klónozott könyvtárakban. Mi első illesztett valamennyi klónozott szekvenciák által ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) az alapértelmezett paraméterekkel. A qPCR primereket voltak B8F20 és B801R21 (5'ACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3 '). Az MGB próba szekvenciák a következők: általános szonda (VIC) 5'CAGCAGCCGCGGTAA-3 ', firmicutes szonda (FAM) 5'-AAGATTCCCTACTGCTGCCT-3', és a Streptococcus
szonda (FAM) 5'-TACACATGGAATTCCAC-3 ' . Méréséhez a rengeteg adott taxon, két próba (az egyik specifikus taxon az érdeklődés, és a második generikus minden baktériumot) alkalmaztunk az azonos PCR-fragmentum. (2. ábra). A 25 ul PCR-keverék tartalmaz 1 × A puffert, 3,5 mM MgCI _{2, 200 jiM dNTP-t a dUTP helyett dTTP, 400 nM mindegyik primerből, 100 nM mindegyik próba, 0,01 egység /pl uracil-N-glikoziláz, és 0,05 egység /ml koncentrációjú TaqGold (Applied Biosystems). A firmicutes-specifikus assay, a kerékpáros feltétel volt: 1) 50 ° C-on 2 perc; 2) 95 ° C-on 10 perc; 3) 40 ciklus 95 ° C-on 20 másodpercig, 58 ° C-on 15 másodperc, 70 ° C-on 80 mp. A Streptococcus katalógusa specifikus vizsgálat, a kerékpáros feltétel volt: 1) 50 ° C-on 2 perc; 2) 95 ° C-on 10 perc; 3) 40 ciklus 95 ° C-on 20 másodperc, 57 ° C-on 1 percig, 70 ° C-on 1 percig. A Streptococcus
16S rRNS fragmenst (DQ346438) pGEM-T Easy vektorba használtuk, mint a standard qPCR (mind az firmicutes, és a Streptococcus
assay) az ABI 7500 valódi -time PCR System (Applied Biosystems). Mivel némi különbség a generikus és taxon-specifikus próbákat, delta delta küszöb ciklus (ddCt) használtunk, hogy jelezze a bőség a specifikus taxon az egész baktériumok populációban. (Ct TSU: Ct taxon specifikus próbát ismeretlen minta Ct Buu: Ct bakteriális univerzális szondát ismeretlen minta Ct TSS: Ct taxon specifikus próba plazmid-szabvány, Ct BSS: Ct bakteriális univerzális szonda plazmid-szabvány)}

Elméletileg a rengeteg taxon 2 ^{-ddCt. katalógusa}

Streptococcus katalógusa termesztése katalógusa

Mi kapott további 32 biopsziát 16 beteg baktérium kultúrát. A biopsziák kerültek foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS, pH = 7,2), és vágjuk kisebb darabokra egy szikével. A mintákat ezután elterítjük a vér agar lemezeken (CM331, Oxoid, Basingstoke, Egyesült Királyság), 5% ló vér. A lemezeket helyeztük, 5% CO _{2 inkubátorban 37 ° C-on 24 órán át keverjük. A telepeket hemolízis a véres agar szedték a 16S rRNS szekvenálása. Katalógusa}

biopszia mosás katalógusa

A biopsziás mosási teszt, 14 további minták mind antrális gyomorhurut betegek és a normális emberek gyűjtötték. Minden egyes mintát helyeztünk egy 2,0 ml-es csőbe és 3-szor mostuk (200 ni PBS minden egyes mosás) mellett egyre inkább mostoha körülmények között. Az első mosás végezték enyhe kézzel rázás. A felülúszót átvittük ki. Új PBS-t adunk a biopsziák a további mosás. A második és harmadik mosás, a csöveket vortexeljük a cső keverő Trio TM-2F (All-Lab tudományos, AU) a 3-as fokozatú és fokozat 6 teljesítményszint rendre nagyjából megfelelő gyengéd és erőteljes vortexeléssel. Ezután duplex valós idejű PCR-t végeztünk, hogy teszteljék a teljes baktériumok és a Streptococcus
mennyiségek a PBS felülúszóit a három mosási lépést, és a mosott biopsziák.

Statisztika elemzés

Pearson-féle chi-négyzet tesztet használtunk, hogy összehasonlítsuk a klón számát különböző faj különböző minta csoportban (NMA: normál antrumban, NMB: a szervezet normális, AGA: antrális gyomorhurut antrumban, AGB: antrális gyomorhurut szerv) a 16S rRNS szekvenálás eredményeként amikor a klón szám az egyes minta-csoport volt legalább 10. ANOVA teszt, hogy összehasonlítsuk a bakteriális bőség adatokat qPCR vizsgálatokban. Minden analíziseket az SPSS for Windows, version 11.5 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). P < 0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Összehasonlítására a fajgazdagság a normális és antrális gyomorhurut betegek, a tényleges phylotype szám minden beteg számít az első. Párosítatlan t-tesztet használtuk, hogy összehasonlítsuk a két betegcsoport. Katalógusa

alátámasztó információk
ábra S1. katalógusa Részletes taxon fa katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s001 katalógusa (2,00 MB TIF) hotelben ábra S2.
fajgazdagság becslés katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s002 katalógusa (0,97 MB TIF) hotelben ábra S3.
korrelációja qPCR és 16S rRNS klónozása és szekvenálása katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s003 katalógusa (0,98 MB TIF) hotelben ábra S4.
közötti korreláció hiánya a beteg életkora és firmicutes vagy Streptococcus bőség katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s004 katalógusa (2,01 MB TIF) hotelben ábra S5.
Kemény mosás nem távolítja el a baktériumokat a biopsziás katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s005 katalógusa (1,90 MB TIF) hotelben táblázat S1.
Novel phyltoypes katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s006 katalógusa (0,03 MB XLS) hotelben táblázat S2.
fajgazdagság becslése különböző biopsziás minták katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s007 katalógusa (0,02 MB XLS) hotelben táblázat S3.
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s008 katalógusa (0,02 MB XLS) hotelben

• PLoS One: Enhanced M1 makrofág polarizáció Human Helicobacter pylori-asszociált sorvadásos gyomorhurut és a beoltott Mice
• PLoS One: izocitrát dehidrogenáz Helicobacter pylori Potenciálisan indukál humorális immunválasz alanyoknál peptikus fekélybetegség és Gastritis