PLoS ONE: Bakterie Microbiota Profilering i gastritt uten Helicobacter pylori infeksjon eller ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler bruk

Abstract

Nye 16S ribosomalt RNA genet (rRNA) molekylær profilering i mageslimhinnene avdekket en overraskende kompleksitet bakterieflora. Helicobacter pylori
infeksjon og ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAID) bruk er to viktigste bidragsyterne til gastritt og magesår. Men lite er kjent om sammenhengen mellom andre medlemmer av magen bakterieflora og mage sykdommer. I denne studien, kloning og sekvensering av 16S rRNA ble anvendt for å profilere magen bakterieflora fra normale og gastritt pasienter. Ett hundre og trettitre phylotypes fra åtte bakterie phyla ble identifisert. Magen bakterieflora ble funnet å være tett festet til slimhinnen. Eleven Streptococcus
phylotypes ble vellykket dyrket fra biopsier. En til to slekter representerte et flertall av kloner innenfor noen av de identifiserte phyla. Vi videreutviklet to real-time kvantitativ PCR-analyser for å kvantifisere den relative overflod av firmicutes phylum og Streptococcus
slekten. Betydelig høyere overflod av firmicutes phylum og Streptococcus
slekten i firmicutes phylum ble observert hos pasienter med antrum gastritt, sammenlignet med normale kontroller. Denne studien tyder på at slekten taxon nivået kan i stor grad representere mye høyere taxa som phylum. Den kliniske relevansen og mekanismen bak den endrede microbiota sammensetningen i gastritt kreve ytterligere funksjonelle studier

Citation. Li XX, Wong GL-H, Å KF, Wong VW-S, Lai LH, Chow DK-L, et al. (2009) Bakteriell Microbiota Profilering i gastritt uten Helicobacter pylori
infeksjon eller ikke-steroide antiinflammatoriske narkotikabruk. PLoS ONE 4 (11): e7985. doi: 10,1371 /journal.pone.0007985

Redaktør: Niyaz Ahmed, University of Hyderabad, India

mottatt: 04.06.2009; Godkjent: 27 oktober 2009; Publisert: 24.11.2009

Copyright: © 2009 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet er støttet av det kinesiske universitetet i Hong Kong. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Commensal microbiota er en integrert del av et menneske [1]. De aller fleste av mikrober bebo vårt fordøyelsessystem, med mer enn 800 arter fra ni bakteriell og en archaeal phyla. Denne mangfoldige microbiota bidrar til gut modning [2], [3], [4], vert ernæring og patogen motstand [5]. Mikrober også direkte kontakt med menneske vert ved å regulere tarm epitelproliferasjon, fettlagring og inflammatoriske responser [3], [6], [7]. Mens noen mikrober kan egenhendig forårsake alvorlig sykdom, mange kroniske tilstander er trolig på grunn av forstyrrelser av den totale bakterieflora. For eksempel er allergi og astma knyttet til barndom bruk av antibiotika som kan endre tarmfloraen [8]. Andre tilstander assosiert med tarmfloraen omfatter sen debut autisme [9], inflammatorisk tarmsykdom [10], og kreft [11].

Tradisjonelt er dyrkings-baserte metoder anvendt for å oppnå mikrobiell isolater for ytterligere karakterisering. Slike studier gitt grunnlaget for vår forståelse av mikrobiologi. Imidlertid er kultivering ofte arbeidskrevende og kan svikte i mange mikrober. Mikroskopisk observasjon blir også brukt til å anslå overflod av mikrober, og i en begrenset utstrekning, tildeler mikrober til taksa [12]. Nylig er 16S ribosomalt RNA genet (rRNA) sekvens profiler brukes til å belyse mikrobiell diversitet, ofte til phylotype nivå. Ved hjelp av 16S rRNA-sekvensering, mikrober fra munnen [13], [14], spiserør [15], mage [16], tynntarm [17], tykktarm [18], [19] og vagina [20] har blitt studert. Disse studiene utforsket mikrobiell diversitet i kroppen og avslørte et stort bestand av utmark og uncharacterized mikrober, som hadde vært unnvikende for dyrkingsbaserte metoder. Gjennom disse high-throughput 16S rRNA-sekvensering og andre metagenomic sekvense innsats, ble bakterieflora forstyrrelser funnet å være assosiert med periodontal sykdom [21] og fedme [22], [23], [24].

I magesekken dreper mage surhet mange inge mikrober. Det ble generelt ansett at magen ikke er beboelig av noen mikrobe til oppdagelsen av Helicobacter pylori Hotell og sin tilknytning til gastritt og magesår [25]. Annet enn noen andre Helicobacter
arter [26], [27], [28], var det ikke forventet at magen ville inneholde mange andre levende mikrober. Redusert surhet på grunn av progressiv atrofisk gastritt kan øke mikrobiell diversitet [29]. En studie av Monstein et al.
Bruker temp temperaturgradient gelelektroforese (TTGE) og en liten skala 16S rRNA sekvense foreslo andre mikrober som Enterococcus
, Pseudo
Streptococcus
, Staphylococcus Hotell og Stomatococcus
var også til stede i magen [30]. En nyere storskala 16S rRNA sekvense innsats identifisert 128 phylotypes fra 8 phyla i 23 nordamerikanske pasienter [16]. Interessant, nærværet av H. pylori
i magen ikke påvirker den totale sammensetningen av bakterieflora på phylum nivå.

I denne studien, gikk vi videre for å undersøke mulige sammenhenger mellom magefloraen endringer og Ikke- H. pylori
og ikke-NSAID (NHNN) gastritt. Vi antok at når H. pylori
er ikke til stede, andre bakterielle grupper /arter kan bidra til eller bli assosiert med gastritt utvikling. På microbiota nivå, vi også ønsker å ta opp et sentralt tema i feltet: hva taxon dybde (e) gjør de microbiota synes relativt stabil slik at forstyrrelsene på disse nivåene kan være relevant for menneskers helse? Vi brukte 16S rRNA-genet kloning og sekvensering for å profilere magen microbiota fra normal og NHNN gastritt pasienter, og takson spesifikke sanntid kvantitative PCR (qPCR) analyser for å kvantifisere den relative overflod av firmicutes phylum og Streptococcus
slekten.

Resultater

taxon treet analyse

Vi analyserte både kropp og antrum biopsier fra 5 normale individer og 5 NHNN antrum gastritt individer (alle kvinner, alder-matchet) . Alle pasientene var H. pylori
negativ med både rask urease test og 16S rRNA sekvensering. Ingen av pasientene hadde tatt NSAID innen 6 måneder før under endoskopi. Minst 60 kloner fra hver biopsi (body eller antrum, og dermed minst 120 kloner fra hver enkelt) ble sekvensert ved hjelp av bredt spekter 16S rRNA PCR-produkter. Totalt 1223 ikke- H. pylori
mikrobielle sekvenser ble oppnådd. Disse mikrobene tilhører 8 phyla (133 phylotypes), hvorav 5 phyla (firmicutes, bacteroidetes, Actinobacteia, Fusobacteria og Proteobacteria) er til stede i et stort flertall (1211 av 1223, eller 99,0%). Ni phylotypes med sekvenslikhet mindre enn 97% til sekvensene som er tilstede i offentlige databaser ble identifisert. Seks av disse 9 phylotypes var representert ved enkelt kloner (Supplementary Tabell S1).

For å undersøke den generelle representasjon av ulike takson nivåer i magen biota, vi bygget et taxon tre (figur 1 og supplerende Figur S1). Interessant, ble hver phylum dominert av bare én eller to lavere takson nivåer (klasse, orden, familie eller slekten). Som et spørsmål om faktum, ble hver phylum dominert av bare 1-2 slekter. For eksempel ble de mest tallrike phylum firmicutes representert av 383 kloner, av disse 333 kloner er fra klassen basiller. Deretter 273 kloner var fra ordren Lactobacillales. To hundre og femtifire kloner var fra familien Streptococcaceae. Og alle 254 kloner var fra slekten Streptococcus
. De fem vanligste slektene inkludert Streptococcus
(254 kloner), Prevotella product: (243), Neisseria product: (175), Haemophilus plakater (122) Porphyromonas product: (68), utgjorde 70,5% av alle mikrobielle kloner.

Arter rikdom og mangfold

Når hele datasettet (1223 kloner) ble brukt, god dekning var 96%, noe som indikerer at fire andre phylotypes ville være forventet for hver 100 ytterligere kloner som skal sekvenseres. Dette nivået av dekningen indikerte at majoriteten av bakterielle sekvenser som var tilstede i de sekvenserte kloner. Mangfold estimering av estimater versjon 8.0 indikerte at ca 200 phylotypes kan være til stede i den menneskelige magen biopsiprøver (Supplerende Figur S2). Vi videre anslått artsrikdom i fire forskjellige biopsiprøver (NMA (Normal antrum), NMB (Normal Body), AGA (Antral gastritt antrum), AGB (Antral gastritt Body); Supplerende Tabell S2). Artsrikdom var ikke forskjellig mellom de antrum gastritt biopsier og normal biopsi (p > 0,1, uparet t-test)

Bakteriell microbiota sammenligning mellom to ulike anatomiske steder (antrum og kropp) i normale pasienter
<. p> i normale pasienter, ble det ikke observert signifikant forskjell mellom to anatomiske steder (antrum og kropp) for noen av arten gruppene, med unntak av familien Prevotellaceae og slekten Prevotella
hvor p-verdiene (Pearsons chi kvadratet test) var mellom 0,01 til 0,05 (figur 1).

firmicutes phylum og Streptococcus
slekten ble beriket i magen av antrum gastritt pasienter

Basert på 1223 16S rRNA-sekvenser, den firmicutes phylum var den mest tallrike phylum med 383 kloner. Proteobacteria phylum var en nær andre med 345 kloner. Interessant, firmicutes rekken var mer tallrike i antrum gastritt biopsier enn i normale biopsier (41% vs 22%, tabell 1), mens den Proteobacteria rekken var mer tallrike i normale biopsier (37% vs. 20%). Siden 16S rRNA sekvensering er kostnadene uoverkommelige for et større utvalg, utviklet vi et taxon-spesifikke real-time kvantitativ PCR (qPCR) tilnærming til å kvantifisere overflod av firmicutes og Streptococcus plakater (figur 2). Arten-spesifikke qPCR data for firmicutes var sterkt korrelert med de 16S rRNA-sekvenseringsdata for de nevnte 20 biopsiprøver (2 biopsier for hver av de 5 normal og 5 antral gastritt pasienter) (Supplementary figur S3).

sytten flere par av antrum og kropp biopsiprøver fra normale pasienter og 18 flere par av antrum og kropp biopsiprøver fra antrum gastritt pasienter ble analysert ved firmicutes spesifikke qPCR. Helt, ble 90 biopsier (46 prøver fra 23 antrum gastritt pasienter og 44 prøver fra 22 normale pasienter) analysert (tabell 2). Gjennomsnittsalderen for de antrum gastritt pasientene var 67,6 ± 11,4 (median: 69, range: 46-86), mens gjennomsnittsalderen for kontrollene var 58,3 ± 14,7 (median: 52, range: 40-87). Gjennomsnittsalderen for normalgruppen var yngre enn den antrum gastritt gruppen. Men statistisk analyse viste at det ikke var noen sammenheng mellom alder og firmicutes eller Streptococcus
overflod (p > 0,1) (Supplementary figur S4). Disse prøvene ble delt inn i 4 grupper, antral gastritt antrum (AGA), antral gastritt kropps (AGB), normal antrum (NMA), og normal kropps (NMB). Overflod av firmicutes var signifikant høyere hos AGA enn i NMA eller NMB (En-veis ANOVA (variansanalyse) test, p = 0,004 og p = 0,046, respektivt), og i AGB enn i NMA (enveis ANOVA, p = 0,039 ) (Figur 3A). ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom AGA og AGB (én vei ANOVA, p = 0,855), eller NMA og NMB (p = 0,832).

For de samme biopsiprøver, slekten Streptococcus
ble også analysert av Streptococcus
-spesifikk qPCR. Streptococcus
overflod var 72% og 76% høyere i AGA vs. NMA eller NMB, henholdsvis, og 66% og 70% høyere i AGB vs. NMA eller NMB, henholdsvis (figur 3B). P-verdiene for ANOVA-testen er vist i figur 3B. Ligner på firmicutes analysen, ble det ikke observert signifikant forskjell mellom AGA og AGB (én vei ANOVA, p = 0,999), eller NMA og NMB (p = 0,999).

Streptococcus
dyrking og biopsi vasking

bare påvisning av 16S rRNA gensekvenser betyr ikke at levende bakterier er tilstede eller bakterier er faktisk bosatt i stedet for forbipasserende i magen. Vi gjennom dermed ut ytterligere to eksperimenter.

Først forsøkte vi bakterier dyrking fra biopsier. En kultur tilstand passende for Streptococcus
ble brukt siden de syntes å være overrepresentert i antrum gastritt pasienter. Seksten par (antrum og kropp) biopsier ble brukt til kultur på blodagarplatene. Kolonier ble sekvensert for 16S rRNA-genet for identifikasjon. Elleve phylotypes av Streptococcus
ble isolert (Supplementary tabell S3). Disse 11 phylotypes utgjorde 93,3% (eller 237 ut av 254 kloner) av alle kloner identifisert i det brede spekter 16S rRNA sekvensering, noe som indikerer at majoriteten av Streptococcus
phylotypes er levende i mage biopsier.

For det andre ble 14 biopsiprøver fra både antral gastritt og normale pasienter vasket i fosfatbufret saltvann (PBS) med tre økende vanskelige forhold. Hvis tøffe klimaforholdene ikke fjerne bakteriene fra biopsi, er det tankevekkende at disse bakteriene fester tett til mageslimhinnene. Over 90% av de totale bakterier forble festet til biopsier etter tre påfølgende vaskinger med stadig mer krevende forhold (Supplerende Figur s5a). Det siste vasketrinn ble utført på høy effekt på en stasjonær vortex maskin. Tilsvarende flertallet av Streptococcus
bakterier forble festet til biopsier etter de 3 vasketrinn (Supplementary figur S5b).

Diskusjoner

I denne studien har vi profilert bakteriell microbiota i sammenkoblede mage biopsier (antrum og kropp) fra normale og antrum gastritt pasienter. Alle pasientene er H. pylori
negativ og uten NSAID bruk. Gjennom et bredt spekter 16S rRNA-genet sekvensering, identifiserte vi 1223 ikke- H pylori
bakteriekloner, ligner på en tidligere studie (Bik studie, 1056 ikke- H pylori
bakteriekloner) [16 ]. Selv om de to studiene analyserte to geografisk (Hong Kong vs. California) og etnisk (kinesisk vs. kaukasisk, latinamerikanere og African American) avvikende bestander, den totale bakterieflora kompleksiteten er overraskende lik (tabell 3). Begge studiene identifisert ca 130 (133 og 127 for dette og Bik studien, henholdsvis) phylotypes 7-8 phyla. Flertallet av kloner (77,4% av denne studien, og 79,8% av Bik studien) ble delt. De to mest tallrike slekter ( Streptococcus Hotell og Prevotella
) var også identiske. Disse to slekter representerte 40,6% og 41,5% av alle kloner i denne studien og Bik studien. Begge studiene indikerte at omtrent 200 forskjellige phylotypes kan være til stede i mageslimhinnene. Slike dramatiske likheten mellom de to studiene fremhever seleksjonspress for bakterieflora under harde magen miljøet. I tillegg har vi funnet liten forskjell i bakterieflora mellom de to anatomiske områder (antrum og kropp) i normale pasienter, til tross for den kliniske relevansen for biopsi prøvetaking på ulike anatomiske områder [31].

Gitt at strenge vasketrinn var ikke i stand til å skille den bakterieflora fra biopsier, hypoteser om vi at flertallet av de identifiserte bakterier er forbundet tett med det mageslimhinnene. I tillegg var vi i stand til å dyrke flertallet av Streptococcus
phylotypes identifisert gjennom et bredt spekter 16S rRNA sekvensering, noe som tyder på at disse bakteriene kan faktisk være sanne innbyggere i mageslimhinnene.

For ytterligere å verdsette den generelle kompleksiteten i magen bakterieflora, bygget vi et taxon treet basert på de identifiserte klonene til å se inn i hver taxon nivå inkludert phylum, klasse, orden, familie og slekt. Interessant nok har vi funnet at for hver rekken, en eller to slekter var hovedsakelig tilstede. De fem vanligste slektene inkludert Streptococcus plakater (phylum firmicutes), Prevotella Hotell og Porphyromonas plakater (bacteroidetes), samt Neisseria Hotell og Haemophilus product: (Proteobacteria), utgjorde 70,5% av alle mikrobielle kloner.

Interessant, avslørte 16S rRNA profilering en betydelig overrepresentasjon av firmicutes phylum (hovedsakelig på grunn av overrepresentasjon av Streptococcus
slekten i phylum) og en underrepresentasjon av Proteobacteria phylum i biopsier fra antrum gastritt pasienter. Vi utviklet et taxon spesifikk qPCR tilnærming til å analysere den overflod av firmicutes og streptokokker
taxa for 90 biopsier (46 prøver fra 23 antrum gastritt pasienter og 44 prøver fra 22 normale pasienter) og bekreftet overrepresentasjon av disse to arter i antral gastritt magen med 42% og 71%, respektivt. Mesteparten av Streptococcus
phylotypes identifisert ved sekvense var alfa-hemolytiske bakterier som er potensielle patogener (f.eks Streptococcus pneumoniae
, Streptococcus mitis Hotell og Streptococcus salivarius
). Visse Streptococcus
arter er motstandsdyktig mot lave pH-betingelser, og kan overleve i magen [32]. Vår dyrking data og vasking eksperiment også foreslått at disse var faktisk bor, bosatt biota i magen.

Enten økningen i Streptococcus
overflod er utløsende for antrum gastritt eller et resultat av lokal miljøendringer på grunn av antrum gastritt forble å bli besvart. En mulig tilnærming er å bruke bakteriefritt musemodell [33]. Et annet interessant spørsmål er at om visse bakterieflora komposisjoner beskytte, eller alternativt, bevisstmageslimhinnene fra invaderende patogener som H. pylori
. Endelig nye high throughput sekvense teknologier vil trolig gi mer omfattende data på bakterieflora fra ulike anatomiske steder langs menneskelige fordøyelseskanalen og på ulike tidspunkter [34].

Materialer og Metoder

Gastric biopsiprøver

Denne studien ble godkjent av kinesiske universitetet i Hong Kong klinisk forskningsetisk komité. Alle pasienter ga skriftlig informert samtykke for å få studie prøver. To mage slimhinne biopsier (antrum og kropps av magen) ble samlet inn fra hver pasient under rutineendoskopi på Prince of Wales Hospital, Hong Kong. For å unngå forurensning, ble en ny steriliserte endoskopi tang brukes når du tar en andre biopsi fra samme pasient. Biopsiene ble hurtigfrosset på tørris og lagret ved -80 ° C. Pasienter som tar antibiotika eller NSAIDs (definert som enhver bruk av NSAID i minst en uke i de siste 3 månedene før endoskopi) eller testet positivt for H. pylori
av rask urease test (RUT) eller histologisk test ble ekskludert. Pasient demografi er vist i Tabell 2.

Bygging av 16S rRNA klone biblioteker og sekvense

Totalt genomisk DNA ble isolert fra biopsier ved hjelp av DNA-mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA ) med glass bak beater metode som tidligere er beskrevet [16]. To negative kontroller med bare sterilt vann ble også ekstrahert ved bruk av samme protokoll. De ekstraherte DNA-konsentrasjonene ble målt ved Nanodrop 1000 spektrofotometer (Thermo Scientific, Minneapolis, Minnesota, USA). To universal bakterielle 16S rRNA-primere, B8F20 [35] (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') og B806R20 [36] (5'- GGACTACCAGGGTATCTAAT-3') ble anvendt for å amplifisere den region svarende til stilling 8-806 av Escherichia coli
16S rRNA-genet. De 25 ul PCR-blandinger inkludert 1 x PCR-buffer, inkludert 1,5 mM MgCl _{2 (Qiagen), 20 mM tetrametylammoniumklorid, 0,1 mM av hver dNTP, 0,4 pM av hver primer, en enhet av HotStar Taq DNA-polymerase (Qiagen), og 2 mL hentet DNA. En tretti-syklus PCR ble utført for å amplifisere det 799 bp-fragmentet. PCR-produktene ble undersøkt ved agarosegel-elektroforese. For hvert produkt, kan et enkelt bånd observeres under UV-lys, mens ingen bånd ble sett for de negative kontrollene. 16S rRNA produkter ble renset med Sephadex G-50 kolonne (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ligert med T vektorer og forvandlet til E. coli
JM109-celler ved hjelp av pGEM-T enkel vektorsystem (Promega, Madison, WI, USA). Vi valgte 5 pasienter (10 biopsiprøver) med antrum gastritt og 5 normale kontroller (10 biopsiprøver) for å bygge 20 16S rRNA-genet biblioteker. For hver gastrisk biopsi bibliotek, ble minst 60 kolonier valgt ut for sekvensering. PCR-produktene ble sekvensert ved hjelp BigDye terminator v3.1 sykle sekvense kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). De sekvenseringsreaksjoner ved hjelp B8F20 som sekvense primer ble utført på en ABI 3730xl sequencer (Applied Biosystems)}

fylogenetisk analyse og mikrobiell diversitet estimering

Det kimære testen bruker Bellerophon serveren (http.: //foo.maths.uq.edu.au/~huber/bellerophon.pl) [37] ble anvendt for å teste potensielle kimære sekvenser. En klon ble funnet å være kimære og deretter utelukket. Deretter ble de ikke-kimære 1223 sekvensene analysert ved RDP II (Ribosomalt Database prosjekt II) klassifikator (http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp) basert på en naiv bayesisk rRNA sorter [38]. Grunnleggende lokal justering søkeverktøy (BLAST) levert av Grønne Genes (http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-blast_interface.cgi) ble utført for å finne de mest lignende sekvenser i databasen. Vi brukte 97% sekvensidentitet som cutoff for definer phylotypes [39]. Sekvenser med identitet < 97% av eksisterende sekvenser i databasen ble ansett romanen. Arten treet ble konstruert ved hjelp av klassifiseringen resultat av RPD II klassifikator. Chao1 estimator av estimater åtte program (http://viceroy.eeb.uconn.edu/estimates) ble brukt for å estimere den mikrobielle mangfold. God metode ble brukt til å beregne sekvense dekning [40].

Sanntids kvantitative PCR (qPCR)

Q-PCR primere og prober ble utformet basert på sekvensene oppnådd fra klonede bibliotekene. Vi først justert alle klonede sekvenser ved ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) med standardparameterne. QPCR primere var B8F20 og B801R21 (5'- ACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3 '). De MGB probe-sekvensene er: generisk sonde (VIC) 5'- CAGCAGCCGCGGTAA-3 ', firmicutes probe (FAM) 5'- AAGATTCCCTACTGCTGCCT-3' og Streptococcus
probe (FAM) 5'- TACACATGGAATTCCAC-3 ' . For å måle overflod av et bestemt taxon, to sonder (en spesifikk for taxon av interesse og andre generiske for alle bakterier) ble brukt i den samme PCR fragment. (Figur 2). Den 25 pl PCR-blanding inkludert 1 x buffer A, 3,5 mM MgCl _{2, 200 uM dNTP med dUTP i stedet for dTTP, 400 nM av hver primer, 100 nM av hver sonde, 0,01 U /ul Uracil-N-glykosylase, og 0,05 U /mL TaqGold (Applied Biosystems). For firmicutes-spesifikk analyse, på sykkel tilstand var: 1) 50 ° C i 2 minutter; 2) 95 ° C i 10 min; 3) 40 sykluser med 95 ° C i 20 sekunder, 58 ° C i 15 sek, 70 ° C i 80 sek. For Streptococcus
-spesifikke analysen, sykkel tilstanden var: 1) 50 ° C i 2 min; 2) 95 ° C i 10 min; 3) 40 sykluser med 95 ° C i 20 sekunder, 57 ° C i 1 minutt, 70 ° C i 1 min. Streptococcus
16S rRNA-fragment (DQ346438) klonet inn i pGEM-T enkel vektor ble anvendt som standard for qPCR (både for firmicutes og Streptococcus
assays) i ABI 7500 virke -time PCR system (Applied Biosystems). På grunn av noen små forskjeller mellom de generiske og takson-spesifikke prober, ble delta delta terskelsyklus (ddCt) brukt til å indikere den overflod av den spesifikke Arten i hele bakteriepopulasjonen (Ct TSU:. Ct av Arten spesifikk probe fra ukjente prøver, Ct BUU: Ct av bakteriell universell sonde fra ukjente prøver, Ct TSS: Ct av taxon spesifikk probe fra plasmidet standard, Ct BSS: Ct av bakteriell universell sonde fra plasmidet standard)}

Teoretisk overflod av en art er to ^-ddCt.

Streptococcus
Dyrking

Vi har fått 32 flere biopsier fra 16 pasienter for bakteriekultur. Biopsiene ble satt i fosfatbufret saltvann (PBS, pH = 7,2) og kuttes til mindre stykker med en skalpell. Prøvene ble deretter spredt på blodagarplater (CM331, Oxoid, Basingstoke, UK) med 5% hesteblod. Platene ble plassert i en 5% CO _{2 inkubator ved 37 ° C i 24 timer. Koloniene med hemolyse på blod agar ble plukket for 16S rRNA sekvensering.}

Biopsi vasking

For biopsi vasking testen ble 14 flere prøver fra begge antrum gastritt pasienter og normale mennesker samlet. Hver prøve ble plassert i et 2,0 ml rør og vasket 3 ganger (200 pl PBS for hver vask) under stadig kraftig vind. Den første vask ble utført ved forsiktig for hånd risting. Supernatanten ble overført ut. New PBS ble lagt til biopsier for ytterligere vask. For det andre og tredje vasking, ble rørene vortexet av rørristeapparat Trio TM-2F (All-lab vitenskapelig, AU) i klasse 3 og klasse 6 effektnivå henholdsvis omtrent tilsvarende mild og kraftig virvling. Deretter duplex real-time PCR ble utført for å teste de totale bakterier og Streptococcus
mengder i PBS supernatanter fra de tre vasketrinn og vasket biopsier.

Statistikk analyse

Pearsons kji-kvadrat test ble brukt for å sammenligne klone antall forskjellige taxa mellom ulike utvalgsgrupper (NMA: normal antrum, NMB: normal kropp, AGA: antrum gastritt antrum, AGB: antrum gastritt kroppen) fra 16S rRNA sekvense resultat, når klon nummer for hver prøve gruppe var minst 10. ANOVA-test ble anvendt for å sammenligne de bakterielle overflod av data fra qPCR analyser. Alle analyser ble utført ved hjelp av SPSS for Windows, versjon 11.5 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). P < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. For å sammenligne artsrikdom mellom normal og antrum gastritt pasienter, ble selve phylotype nummer for hver pasient telles først. Uparet t-test ble så brukt til å sammenligne de to pasientgruppene.

Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Detaljert taxon tre
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s001 plakater (2,00 MB TIF)
Figur S2.
artsrikdom estimat
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s002 plakater (0,97 MB TIF)
Figur S3.
Sammenheng mellom qPCR og 16S rRNA kloning og sekvense
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s003 plakater (0,98 MB TIF)
Figur S4.
Mangel på sammenheng mellom pasientens alder og firmicutes eller Streptococcus overflod
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s004 plakater (2,01 MB TIF)
Figur S5.
Harsh vask ikke fjerner bakterier fra biopsier
Doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s005 plakater (1,90 MB TIF)
Tabell S1.
Novel phyltoypes
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s006 plakater (0,03 MB XLS)
Tabell S2.
artsrikdom estimat på forskjellige biopsiprøver
Doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s007 plakater (0,02 MB XLS)
tabell S3.
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s008 plakater (0,02 MB XLS)

• PLoS ONE: Forbedret M1 Macrophage Polarisering i Human Helicobacter pylori-Associated atrofisk gastritt og hos vaksinerte Mice
• PLoS ONE: isocitrat dehydrogenase av Helicobacter pylori Potensielt induserer humoral immunrespons hos pasienter med mavesår og Gastritis