PLoS ONE: Bakteriel mikrobiota Profilering i Gastritis uden Helicobacter pylori infektion eller ikke-steroide anti-inflammatorisk lægemiddel Brug

Abstrakt

Seneste 16S ribosomale RNA gen (rRNA) molekylær profilering af maveslimhinden afslørede en overraskende kompleksitet mikrobiota. Helicobacter pylori
infektion og non-steroide anti-inflammatorisk lægemiddel (NSAID) brug er to primære bidragydere til gastritis og mavesår. Men kun lidt om sammenhængen mellem andre medlemmer af maven mikrobiota og mavesygdomme. I denne undersøgelse, kloning og sekventering af 16S rRNA blev anvendt til at profilere maven mikrobiota fra normale og gastritis patienter. Et hundrede og tredive tre phylotypes fra otte bakteriel phyla blev identificeret. Maven mikrobiota viste sig at være tæt klæbet til slimhinden. Eleven Streptococcus
phylotypes lykkedes dyrket fra biopsier. En til to slægter udgjorde et flertal af kloner inden for en af ​​de identificerede phyla. Vi videreudviklet to realtid kvantitativ PCR-analyser til at kvantificere den relative forekomst af Firmicutes phylum og Streptococcus
slægt. Markant højere overflod af Firmicutes phylum og Streptococcus
slægt i Firmicutes phylum blev observeret hos patienter med antral gastritis, sammenlignet med normale kontroller. Denne undersøgelse tyder på, at slægten taxon niveau i vid udstrækning kan repræsentere meget højere systematiske enheder såsom phylum. Den kliniske relevans og mekanismen bag den ændrede mikrobiota sammensætning i gastritis kræver yderligere funktionelle studier

Henvisning:. Li XX, Wong GL-H, Til KF, Wong VW-S, Lai LH, Chow DK-L, et al. (2009) Bakteriel mikrobiota Profilering i Gastritis uden Helicobacter pylori
Infektion eller ikke-steroide anti-inflammatorisk lægemiddel brug. PLoS ONE 4 (11): e7985. doi: 10,1371 /journal.pone.0007985

Redaktør: Niyaz Ahmed, University of Hyderabad, Indien

Modtaget: Juni 4, 2009; Accepteret: 27 Oktober 2009; Udgivet: November 24, 2009

Copyright: © 2009 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde understøttes af den kinesiske University of Hong Kong. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Commensal mikrobiota er en integreret del af et menneske [1]. Langt størstedelen af ​​mikrober bebor vores mave-tarmkanalen, med mere end 800 arter fra ni bakterielle og én archaeorganisme phyla. Denne forskelligartede mikrobiota bidrager til gut modning [2], [3], [4], host ernæring og patogen resistens [5]. Mikrober også direkte interagere med menneskelig vært ved at regulere tarm epitelproliferation, fedt oplagring og inflammatoriske reaktioner [3], [6], [7]. Mens nogle mikrober egenhændigt kan forårsage alvorlig sygdom, mange kroniske tilstande skyldes sandsynligvis forstyrrelser af den samlede mikrobiota. For eksempel er allergi og astma forbundet med barndommen brug af antibiotika, der kan ændre intestinale mikroflora [8]. Andre tilstande forbundet med intestinale mikrobioter indbefatter sent opstået [9] autisme, inflammatorisk tarmsygdom [10] og cancer [11].

Traditionelt dyrkningsmetoder-baserede metoder anvendes for at opnå mikroorganismeisolater til yderligere karakterisering. Sådanne undersøgelser forudsat grundlaget for vores forståelse af mikrobiologi. Men dyrkningen er ofte arbejdskrævende og kan mislykkes af mange mikrober. Mikroskopisk observation bruges også til at estimere overflod af mikrober, og i begrænset omfang, tildeler mikrober til systematiske enheder [12]. For nylig, er 16S ribosomale RNA-gen (rRNA) sekvens profiler bruges til at belyse mikrobiel diversitet, ofte til phylotype niveau. Brug 16S rRNA sekventering, mikrober fra munden [13], [14], spiserør [15], mave [16], tyndtarm [17], kolon [18], [19] og vagina [20] er blevet undersøgt. Disse undersøgelser udforskede mikrobiel diversitet i det menneskelige legeme og afslørede en enorme befolkning af udyrkede og karakteriserede mikrober, som havde været undvigende for dyrkning-baserede metoder. Gennem disse high-throughput 16S rRNA-sekventering og andre metagenomisk sekventering indsats, blev fundet mikrobiota perturbationer at være forbundet med periodontal sygdom [21] og fedme [22], [23], [24].

I maven , gastrisk surhedsgrad dræber mange indtagne mikrober. Det blev generelt, at maven ikke er beboeligt af nogen mikrobe indtil opdagelsen af ​​ Helicobacter pylori
og dens association med gastritis og mavesår [25]. Andre end et par andre Helicobacter
arter [26], [27], [28], blev det ikke forventes, at maven ville indeholde mange andre levende mikrober. Reduceret surhedsgrad på grund af progressiv atrofisk gastritis kan øge mikrobiel diversitet [29]. En undersøgelse foretaget af Monstein et al.
Bruge tidsmæssig temperaturgradient gelelektroforese (TTGE) og en mindre 16S rRNA sekventering foreslog andre mikrober såsom Enterococcus
, Pseudomonas
, Streptococcus
, Staphylococcus
Stomatococcus
var også til stede i maven [30]. En nyere storstilet 16S rRNA sekventering indsats identificeret 128 phylotypes fra 8 phyla i 23 nordamerikanske patienter [16]. Interessant tilstedeværelsen af ​​ H. pylori
i maven ikke påvirkede den overordnede sammensætning af mikrobiota på phylum niveau.

I denne undersøgelse, gik vi videre til at undersøge potentielle sammenhænge mellem mave mikrobiota ændringer og Non H. pylori
og ikke-NSAID (NHNN) gastritis. Vi antager, at når H. pylori
ikke er til stede, andre bakterielle grupper /arter kan bidrage til eller være forbundet med gastritis udvikling. På mikrobiota niveau, vi også gerne vil løse et centralt emne i feltet: på, hvad taxon dybde (s) gør de mikrobiota synes relativt stabil, således at forstyrrelser på disse niveauer kan være relevante for menneskers sundhed? Vi brugte 16S rRNA-genet kloning og sekventering at profilere maven mikrobiota fra normal og NHNN gastritis patienterne, og taxon-specifikke kvantitative PCR (qPCR) analyser i realtid at kvantificere den relative forekomst af Firmicutes phylum og Streptococcus
slægten.

Resultater

Taksonomien træ analyse

Vi analyserede både krop og antrum biopsier fra 5 normale individer og 5 NHNN antral gastritis individer (alle hunner, alder-matchede) . Alle patienter var H. pylori
negative ved både hurtige ureaseprøve og 16S rRNA-sekventering. Ingen af ​​patienterne havde taget NSAID inden for 6 måneder før undergår endoskopi. Mindst 60 kloner fra hver biopsi (krop eller antrum, således mindst 120 kloner fra hver enkelt) blev sekventeret ved hjælp bredspektrede 16S rRNA PCR-produkter. I alt 1223 ikke H. pylori
mikrobielle sekvenser blev opnået. Disse mikrober tilhører 8 phyla (133 phylotypes), hvoraf 5 phyla (Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteia, Fusobacteria og Proteobacteria) er til stede i et stort flertal (1211 ud af 1223, eller 99,0%). Ni phylotypes med sekvens lighed mindre end 97% til sekvenser til stede i de offentlige databaser blev identificeret. Seks af disse 9 phylotypes var repræsenteret af enkelte kloner (Supplerende tabel S1).

For at undersøge den samlede repræsentation af forskellige taxon niveauer i maven biota, vi konstrueret en taxon træ (figur 1 og supplerende figur S1). Interessant nok blev hver phylum domineret af kun en eller to lavere systematisk enhed niveauer (klasse, orden, familie eller slægt). Som en kendsgerning, blev hver phylum domineret af kun 1-2 slægter. For eksempel blev den mest udbredte phylum Firmicutes repræsenteret med 383 kloner, af disse 333 kloner er fra klassen Bacilli. Efterfølgende 273 kloner var fra ordren Lactobacillales. To hundrede og halvtreds fire kloner var fra familien Streptococcaceae. Og alle 254 kloner var fra slægten Streptococcus
. De fem mest almindelige slægter, herunder Streptococcus
(254 kloner), Prevotella Hotel (243), Neisseria Hotel (175), Haemophilus Hotel (122) , Porphyromonas Hotel (68), udgjorde 70,5% af alle mikrobielle kloner.

Arter rigdom og mangfoldighed

Hvornår blev anvendt hele datasættet (1223 kloner), Good dækning var 96%, hvilket indikerer, at yderligere fire phylotypes ville forventes for hver 100 yderligere kloner, der skal sekventeres. Dette niveau af dækningsmålet at størstedelen af ​​bakterielle sekvenser var til stede i de sekventerede kloner. Mangfoldighed estimering af skøn version 8.0 viste, at omkring 200 phylotypes kan være til stede i den menneskelige mave biopsi prøver (Supplerende Figur S2). Vi yderligere estimeret artsrigdommen i fire forskellige biopsi prøver (NMA (Normal antrum), NmB (Normal Krop), AGA (Antral Gastritis antrum), AGB (Antral Gastritis Krop) Supplerende tabel S2). Artsrigdom var ikke forskellig mellem de antrale gastritis biopsier og normale biopsier (p > 0,1, uparret t-test)

Bakteriel mikrobiota sammenligning mellem to forskellige anatomiske steder (antrum og krop) i normale patienter
<. p> i de normale patienter, sås ingen signifikant forskel mellem to anatomiske steder (antrum og krop) for nogen af ​​den systematiske enhed grupper undtagen for familien Prevotellaceae og slægten Prevotella
hvor p-værdier (Pearsons chi -square test) var mellem 0,01 og 0,05 (Figur 1).

Firmicutes phylum og Streptococcus
slægt blev beriget i maven af ​​antrale gastritis patienter Salg

Baseret på 1223- 16S rRNA-sekvenser, det Firmicutes phylum var den mest rigelige phylum med 383 kloner. Den Proteobacteria phylum var en tæt andenplads med 345 kloner. Interessant nok Firmicutes phylum var mere rigelige i antrale gastritis biopsier end i normale biopsier (41% vs. 22%, Tabel 1), mens Proteobacteria phylum var mere hyppigt forekommende i normale biopsier (37% vs. 20%). Da 16S rRNA sekventering er omkostningerne uoverkommelige for en større stikprøve, udviklede vi et taxon-realtids-kvantitativ PCR (qPCR) tilgang til at kvantificere den overflod af Firmicutes og Streptococcus
(figur 2). En taksonomisk-specifik qPCR data for Firmicutes var stærkt korreleret med 16S rRNA sekventering data for de førnævnte 20 biopsiprøver (2 biopsier for hver af de 5 normal og 5 antral gastritis patienter) (Supplerende figur S3).

Sytten ekstra par af antrum og krop biopsiprøver fra normale patienter og 18 yderligere par af antrum og krop biopsi prøver fra antrale gastritis patienter blev analyseret ved Firmicutes-specifikke qPCR. Helt, blev 90 biopsier (46 prøver fra 23 antral gastritis patienter og 44 prøver fra 22 normale patienter) analyseret (tabel 2). Gennemsnitsalderen for de antrale gastritis patienter var 67,6 ± 11,4 (median: 69, interval: 46 til 86), medens den gennemsnitlige alder af kontrollerne var 58,3 ± 14,7 (median: 52,: 40 til 87). Gennemsnitsalderen for den normale gruppe var yngre end den antrale gastritis gruppen. Men statistisk analyse viste, at der ikke var nogen sammenhæng mellem alder og Firmicutes eller Streptococcus
overflod (p > 0,1) (Supplerende figur S4). Disse prøver blev opdelt i 4 grupper, antral gastritis antrum (AGA), antral gastritis krop (AGB), normal antrum (NMa), og normal krop (NMB). Den overflod af Firmicutes var signifikant højere hos AGA end i NMA eller NmB (One-way ANOVA (variansanalyse) test, p = 0,004 og p = 0,046, henholdsvis) og i AGB end i NMA (envejs-ANOVA, p = 0,039 ) (figur 3A). blev ikke observeret nogen signifikant forskel mellem AGA og AGB (enkelt ANOVA, p = 0,855), eller NMA og NmB (p = 0,832).

Af samme biopsiprøver, slægten Streptococcus
blev også analyseret af Streptococcus
-specifik qPCR. Streptococcus
overflod var 72% og 76% højere i AGA vs. NMA eller NmB henholdsvis og 66% og 70% højere i AGB vs. NMA eller NmB henholdsvis (figur 3B). P-værdier for ANOVA-test er vist i figur 3B. Svarende til Firmicutes assay, sås ingen signifikant forskel mellem AGA og AGB (enkelt ANOVA, p = 0,999), eller NMA og NmB (p = 0,999).

Streptococcus
dyrkning og biopsi vask

den blotte opdagelse af 16S rRNA gensekvenser betyder ikke, at levende bakterier er til stede eller bakterierne er faktisk bosiddende i stedet for forbipasserende i maven. Vi således gennemført to yderligere eksperimenter.

For det første har vi forsøgt bakterier dyrkning fra biopsier. En kultur betingelse egnet til Streptococcus
blev brugt, da de viste sig at være overrepræsenteret i antrale gastritis patienter. Seksten par (antrum og krop) af biopsier blev brugt til dyrkning på blodagarplader. Kolonier blev sekventeret for 16S rRNA-genet for identifikation. Elleve phylotypes af Streptococcus
blev isolerede (supplerende tabel S3). Disse 11 phylotypes udgjorde 93,3% (eller 237 ud af de 254 kloner) af alle de kloner er identificeret i den brede vifte 16S rRNA sekventering, hvilket indikerer, at størstedelen af ​​ Streptococcus
phylotypes er i live i mavens biopsier.

andet blev 14 biopsiprøver fra både antral gastritis og normale patienter vasket i phosphatpufret saltvand (PBS) med tre stigende barske forhold. Hvis barske vask betingelser ikke fjerner bakterier fra biopsi, det er tankevækkende, at disse bakterier vedhæfte nøje til maveslimhinden. Over 90% af de samlede bakterier forblev fæstnet til biopsi efter tre på hinanden følgende vask med stigende barske betingelser (Supplerende Figur S5A). Det sidste vasketrin blev udført på høj effekt på en desktop vortex maskine. Tilsvarende størstedelen af ​​ Streptococcus
bakterier forblev knyttet til biopsier efter de 3 vasketrin (Supplerende figur S5B).

Diskussion

I denne undersøgelse har vi profileret den bakteriel mikrobiota i de parrede gastrisk biopsier (antrum og krop) fra normale og antrale gastritis patienter. Alle patienter er H. pylori
negativ og uden brug af NSAID. Gennem bredt sortiment 16S rRNA-genet sekventering, identificerede vi 1223 ikke H pylori
bakterier kloner, svarende til en tidligere undersøgelse (Bik undersøgelse, 1056 ikke- H pylori
bakterier kloner) [16 ]. Selv om de to undersøgelser analyseres to geografisk (Hong Kong vs. Californien) og etnisk (kinesisk vs. kaukasisk, hispanics og African American) divergerende befolkninger, de overordnede mikrobiota kompleksiteten er overraskende ens (tabel 3). Begge studier er identificeret ca. 130 (133 og 127 for denne og Bik undersøgelsen, henholdsvis) phylotypes 7-8 phyla. Flertal af kloner (77.4% af denne undersøgelse og 79,8% af Bik undersøgelse) blev delt. De to mest udbredte slægter ( Streptococcus
Prevotella
) var også identiske. Disse to slægter repræsenteret 40,6% og 41,5% af alle kloner i dette studie og Bik undersøgelsen. Begge undersøgelser indikerede, at omkring 200 forskellige phylotypes kan være til stede i maveslimhinden. Sådan dramatisk lighed mellem de to undersøgelser fremhæver det selektive pres for mikroflora under barske mave miljøet. Derudover fandt vi lidt forskel i bakteriel mikrobiota mellem de to anatomiske steder (antrum og krop) i normale patienter, på trods af den kliniske relevans for biopsi prøveudtagning på forskellige anatomiske steder [31].

Da strenge vasketrin ikke var i stand til at adskille mikrobiota fra biopsier, vi hypotesen, at størstedelen af ​​de identificerede bakterier er forbundet tæt med maveslimhinden. Derudover var vi i stand til at dyrke størstedelen af ​​ Streptococcus
phylotypes identificeret gennem bredt sortiment 16S rRNA sekventering, hvilket tyder på, at disse bakterier faktisk kan være sande beboere i maveslimhinden.

For yderligere at sætte pris den samlede kompleksitet af maven mikrobiota, vi konstrueret et taxon træ baseret på de identificerede kloner til at kigge ind i hver taxon niveau, herunder række og klasse, orden, familie og slægt. Interessant fandt vi, at for hver række og en eller to slægter var overvejende til stede. De fem mest almindelige slægter, herunder Streptococcus Hotel (phylum Firmicutes), Prevotella
Porphyromonas
(Bacteroidetes), samt Neisseria
Haemophilus
(Proteobacteria), udgjorde 70,5% af alle mikrobielle kloner.

Interessant, afslørede 16S rRNA profilering en betydelig overrepræsentation af Firmicutes phylum (primært som følge af over-repræsentation af Streptococcus
slægt i phylum) og en underrepræsentation af Proteobacteria phylum i biopsier fra antrale gastritis patienter. Vi udviklede et taxon-specifikke qPCR tilgang til at analysere den overflod af Firmicutes og streptococcus
systematiske enheder i 90 biopsier (46 prøver fra 23 antrale gastritis patienter og 44 prøver fra 22 normale patienter) og bekræftet overrepræsentation af disse to taxa i antral gastritis maven ved 42% og 71%, hhv. De fleste af de Streptococcus
phylotypes identificeret ved sekventering var alfa-hæmolytiske bakterier, der er potentielle patogener (f.eks Streptococcus pneumoniae
, Streptococcus mitis
Streptococcus salivarius
). Visse Streptococcus
arter er resistente over for lave pH-betingelser og kan overleve i maven [32]. Vores dyrkning data og vask eksperiment foreslog også, at disse var faktisk levende, bosiddende biota i maven.

Om stigningen i Streptococcus
overflod er sygdomsfremkaldende for antral gastritis eller et resultat af lokal miljøændringer på grund af antral gastritis manglede at blive besvaret. En mulig fremgangsmåde er at bruge kim-fri musemodel [33]. Et andet interessant spørgsmål er, at uanset om visse mikrobiota kompositioner beskytte, eller alternativt, bevidstgøre maveslimhinden fra invaderende patogener såsom H. pylori
. Endelig nye high throughput sekventering teknologier vil sandsynligvis give mere omfattende data om mikrobiota fra forskellige anatomiske steder langs menneskelige fordøjelseskanalen og på forskellige tidspunkter [34].

Materialer og Metoder

Gastric biopsiprøver

Denne undersøgelse blev godkendt af den kinesiske University of Hong Kong klinisk videnskabsetisk komité. Alle patienter gav skriftligt informeret samtykke til opnåelse undersøgelsen prøver. To maveslimhinden biopsier (antrum og krop af maven) blev indsamlet fra hver patient under rutinemæssig endoskopi på Prince of Wales Hospital, Hongkong. For at undgå forurening, blev en ny steriliserede endoskopi pincet bruges, når man tager en anden biopsi fra den samme patient. Biopsierne var lynfrosset på tøris og opbevaret ved -80 ° C. Patienter, der tager antibiotika eller NSAID (defineret som enhver brug af NSAID i mindst en uge i de sidste 3 måneder forud for endoskopi) eller testet positive for H. pylori
ved hurtig urease-test (RUT) eller histologiske test blev udelukket. Patient demografi er vist i tabel 2.

Konstruktion af 16S rRNA klon biblioteker og sekventering

Totalt genomisk DNA blev isoleret fra biopsierne ved anvendelse af DNA mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA ) med glas stolpen beater fremgangsmåde som tidligere beskrevet [16]. To negative kontroller med kun sterilt vand blev også ekstraheret under anvendelse af den samme protokol. De ekstraherede DNA-koncentrationer blev målt ved NanoDrop 1000 spektrofotometer (Thermo Scientific, Minneapolis, MN, USA). To universelle bakterielle 16S rRNA primere, B8F20 [35] (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') og B806R20 [36] (5'GGACTACCAGGGTATCTAAT-3') blev anvendt til at opformere regionen svarende til position 8 til 806 af Escherichia coli
16S rRNA-genet. De 25 pi PCR-blandinger indeholdt 1 × PCR-buffer, herunder 1,5 mM MgCl _{2 (Qiagen), 20 mM tetramethylammoniumchlorid, 0,1 mM af hver dNTP, 0,4 pM af hver primer, 1 enhed af Hotstar Taq DNA polymerase (Qiagen), og 2 pi ekstraherede DNA. En tredive-cyklus PCR blev udført til amplifikation af 799 bp fragmentet. PCR-produkterne blev kontrolleret ved agarosegelelektroforese. For hvert produkt, kan et enkelt bånd observeres under UV-lys, mens ingen bånd blev set for de negative kontroller. 16S rRNA-produkterne blev oprenset med Sephadex G-50-søjle (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ligeret med T vektorer og transformeret ind E. coli
JM109-celler ved anvendelse af pGEM-T-easy-vektor-system (Promega, Madison, WI, USA). Vi valgte 5 patienter (10 biopsi prøver) med antral gastritis og 5 normale kontroller (10 biopsi prøver) at konstruere 20 16S rRNA-genet biblioteker. For hver gastrisk biopsi bibliotek blev mindst 60 kolonier udvalgt til sekventering. PCR-produkterne blev sekventeret ved hjælp BigDye terminator v3.1 cycle-sekventeringskit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sekventeringsreaktionerne vha B8F20 som sekvenseringsprimeren blev udført på en ABI 3730xl sequencer (Applied Biosystems)}

fylogenetisk analyse og mikrobiel mangfoldighed estimering

Det kimære test ved Bellerophon server (http.: //foo.maths.uq.edu.au/~huber/bellerophon.pl) [37] blev anvendt til at teste potentielle kimære sekvenser. En klon viste sig at være kimære og efterfølgende udelukket. Derefter blev 1223 ikke-kimæriske sekvenser analyseret ved RDP II (Ribosomal Database Project II) klassifikator (http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp) baseret på en naiv Bayesian rRNA klassifikator [38]. Grundlæggende lokal tilpasning søgeværktøj (BLAST), som Green Gener (http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-blast_interface.cgi) blev udført for at finde de mest lignende sekvenser i databasen. Vi brugte 97% sekvens identitet som cutoff for definerer phylotypes [39]. Sekvenser med identitet < 97% af de eksisterende sekvenser i databasen blev anset roman. En taksonomisk Træet blev konstrueret ved anvendelse af klassifikationen resultat af RPD II klassificeringen. Chao1 estimator af estimaterne 8-programmet (http://viceroy.eeb.uconn.edu/estimates) blev anvendt til at estimere den mikrobielle diversitet. God metode blev anvendt til beregning sekventering dækning [40].

Real-time kvantitativ PCR (qPCR)

Q-PCR-primere og prober blev designet baseret på sekvenserne opnået fra de klonede biblioteker. Vi først justeret alle klonede sekvenser af ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) med standard parametre. De qPCR primere var B8F20 og B801R21 (5'ACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3 '). MGB probesekvenser er: generisk probe (VIC) 5'- CAGCAGCCGCGGTAA-3 ', Firmicutes probe (FAM) 5'- AAGATTCCCTACTGCTGCCT-3' og Streptococcus
probe (FAM) 5'- TACACATGGAATTCCAC-3 ' . For at måle den overflod af en specifik taxon, to prober (én specifikke for systematisk enhed af interesse, og den anden generiske for alle bakterier) blev anvendt i den samme PCR-amplikon. (Figur 2). Den 25 pi PCR-blandingen indeholdt 1 × Buffer A, 3,5 mM MgCl _{2, 200 uM dNTP med dUTP i stedet for dTTP, 400 nM af hver primer, 100 nM af hver probe, 0,01 U /pl uracil-N-glycosylase, og 0,05 U /pl TaqGold (Applied Biosystems). På Firmicutes-specifikt assay, cykling betingelse var: 1) 50 ° C i 2 min; 2) 95 ° C i 10 min; 3) 40 cykler af 95 ° C i 20 sek, 58 ° C i 15 sek, 70 ° C i 80 sek. For Streptococcus
-specifik assay, cykling betingelse var: 1) 50 ° C i 2 minutter; 2) 95 ° C i 10 min; 3) 40 cykler af 95 ° C i 20 sek, 57 ° C i 1 min, 70 ° C i 1 min. Streptococcus
16S rRNA-fragment (DQ346438) klonet ind i pGEM-T let vektor blev anvendt som standard for qPCR (både for Firmicutes og Streptococcus
analyser) i ABI 7500 real -tids PCR-system (Applied Biosystems). På grund af nogle mindre forskel mellem de generiske og taxon-specifikke prober blev delta delta tærskel cyklus (ddCt) bruges til at angive den overflod af den specifikke systematisk enhed i hele bakterie populationen (Ct TSU:. Ct af taxon specifik probe fra ukendte prøver, Ct BUU: Ct af bakteriel universal sonde fra ukendte prøver, Ct TSS: Ct af taxon specifik probe fra plasmidet standard, Ct BSS: Ct af bakteriel universel sonde fra plasmidet standard)}

Teoretisk overflod af en systematisk enhed er 2 ^-ddCt.

Streptococcus
Dyrkning

Vi opnåede 32 yderligere biopsier fra 16 patienter til bakteriekultur. Biopsierne blev sat i phosphatbufret saltvand (PBS, pH = 7,2) og skæres til mindre stykker med en skalpel. Prøverne blev derefter spredt ud på blodagarplader (CM331, Oxoid, Basingstoke, UK) med 5% hesteblod. Pladerne blev anbragt i en CO 5% _{2 inkubator ved 37 ° C i 24 timer. Kolonierne med hæmolyse på blod agar blev plukket til 16S rRNA sekventering.}

Biopsi vask

For biopsi vask test blev 14 yderligere prøver fra begge antrale gastritis patienter og normale mennesker samlet. Hver prøve blev anbragt i et 2,0 ml rør og vasket 3 gange (200 pi PBS i hver vask) under stadig mere barske forhold. Den første vask blev udført ved forsigtig hånd rystning. Supernatanten blev overført ud. Ny PBS blev tilsat til biopsier til yderligere vask. For det andet og tredje vask blev rørene hvirvelbehandlet af røret mixer Trio TM-2F (All-lab videnskabelige, AU) i lønklasse 3 og karakteren 6 effektniveau henholdsvis omtrent svarer til blid og kraftig vortexbehandling. Derefter duplex real-time PCR blev udført for at teste den samlede bakterier og Streptococcus
mængder i PBS supernatanter fra de tre vasketrin og de vaskede biopsier.

Statistik analyse

Pearsons chi-square test blev anvendt til at sammenligne klonnumre fra forskellige systematiske enheder mellem forskellige prøvegrupper (NMA: normal antrum, NmB: normal organ, AGA: antral gastritis antrum, AGB: antral gastritis organ) fra 16S rRNA sekventering resultat, når klonen tal for hver prøve gruppe var mindst 10. ANOVA-test blev anvendt til at sammenligne de bakterielle overflod data fra qPCR assays. Alle analyser blev udført ved hjælp af SPSS til Windows, version, 11.5 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. For at sammenligne artsrigdommen mellem normale og antrale gastritis patienter blev det faktiske phylotype tal for hver patient tælles først. Uparret t-test blev derefter brugt til at sammenligne de to patientgrupper.

Støtte Information
Figur S1.
Detaljeret taxon træ
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s001
(2,00 MB TIF)
Figur S2.
Artsrigdom skøn
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s002
(0,97 MB TIF)
Figur S3.
Sammenhæng mellem qPCR og 16S rRNA kloning og sekventering
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s003
(0,98 MB TIF)
Figur S4.
Manglende sammenhæng mellem patientens alder og Firmicutes eller Streptococcus overflod
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s004
(2,01 MB TIF)
Figur S5.
Barske vask fjerner ikke bakterier fra biopsier
Doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s005
(1,90 MB TIF)
tabel S1.
Novel phyltoypes
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s006
(0,03 MB XLS)
tabel S2.
Artsrigdom skøn i forskellige biopsiprøver
Doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s007
(0,02 MB XLS)
tabel S3.
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s008
(0,02 MB XLS)

• PLoS ONE: Enhanced M1 makrofag polarisering i Human Helicobacter pylori-associeret atrofisk gastritis og hos vaccinerede mus
• PLoS ONE: isocitratdehydrogenase af Helicobacter pylori Potentielt inducerer humorale immunrespons i Patienter med mavesår sygdom og Gastritis