PLoS ONE: Bakteeri Microbiota Profilointi gastriitti ilman helikobakteeri-infektion tai steroideihin tulehduskipulääke Use

tiivistelmä

Viime 16S ribosomi-RNA-geeniä (rRNA) molekyyli- profilointi mahalaukun limakalvon paljasti yllättävän monimutkaisuus mikrobiston. helikobakteeri
infektio ja steroideihin kuulumattomien tulehduskipulääkkeiden (NSAID) käyttö ovat kaksi päärahoittajia gastriitti ja mahahaava. Kuitenkin vähän tiedetään yhdistyksen välillä muiden jäsenten mahan mikrobiston ja mahalaukun sairauksia. Tässä tutkimuksessa, kloonaus ja sekvensointi 16S rRNA käytettiin profiloida mahassa mikrobiston normaalista ja gastriitti potilaille. Sata ja kolmekymmentäkolme phylotypes kahdeksasta bakteerien phyla tunnistettiin. Vatsa mikrobiston todettiin olevan tiiviisti kiinni limakalvolle. Yksitoista Streptococcus
phylotypes onnistuneesti kasvatettu koepaloja. Yksi tai kaksi sukuihin edustivat enemmistöä kloonien sisällä mitään tunnistetuista phyla. Olemme edelleen kehittäneet kaksi reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR-määrityksissä määrällisesti suhteellisen runsauden firmicutes phylum ja Streptococcus
sukuun. Huomattavasti suurempi runsaus firmicutes phylum ja Streptococcus
suvun sisällä firmicutes phylum havaittiin potilailla, joilla antral gastriitti, tavanomaiseen verrattuna kontrolleihin. Tämä tutkimus viittaa siihen, että sukuun taksonitasolle voidaan pitkälti edustaa paljon suurempi taksonien kuten phylum. Kliinistä merkitystä ja taustalla oleva mekanismi muuttuneen mikrobiston koostumus gastriitti vaativat vielä toiminnallisia tutkimuksia.

Citation: Li XX, Wong GL-H, To KF, Wong VW-S, Lai LH, Chow DK-L, et ai. (2009) Bakteeri Microbiota Profilointi gastriitti ilman helikobakteeri
Infektio tai steroideihin tulehduskipulääke käyttö. PLoS ONE 4 (11): e7985. doi: 10,1371 /journal.pone.0007985

Editor: Niyaz Ahmed, University of Hyderabad, Intia

vastaanotettu: 4. kesäkuuta, 2009; Hyväksytty: 27 lokakuu 2009; Julkaistu 24. marraskuuta 2009

Copyright: © 2009 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee Kiinan University of Hong Kong. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

pieneliöstöön on olennainen osa ihmisen [1]. Valtaosa mikrobit elävät meidän ruoansulatuskanavassa, jossa on yli 800 lajia yhdeksästä bakteeri- ja yksi arkkien phyla. Tämä monipuolinen mikrobisto vaikuttaa suoliston kypsymisen [2], [3], [4], isäntä ravinto ja taudinaiheuttajan vastus [5]. Mikrobit myös suoraan vuorovaikutuksessa ihmisen isäntä säätelemällä suoliston epiteeliproliferaation, rasvan varastointi ja tulehdusreaktioita [3], [6], [7]. Vaikka jotkut mikrobit voivat yksin aiheuttaa vakavia sairauksia, monet krooniset sairaudet johtuvat todennäköisesti häiriöitä yleistä mikrobiston. Esimerkiksi allergiat ja astma liittyvät lapsuuden antibioottien käyttö, jotka saattavat muuttaa suoliston mikrobiston [8]. Muita tiloja, jotka liittyvät suoliston mikrobiston kuuluvat viiveellä ilmaantuvia autismi [9], tulehduksellinen suolistosairaus [10], ja syöpä [11].

Perinteisesti viljely-pohjainen menetelmiä käytetään saada mikrobi-isolaattien lisäkarakterisointia. Tällaiset tutkimukset, jos perusta käsityksemme mikrobiologian. Kuitenkin viljely on usein työvoimavaltaista ja voi epäonnistua monille mikrobeille. Mikroskooppinen havainnointi käytetään myös arvioida runsaasti mikrobeja, ja rajoitetussa määrin, osoittaa mikrobien taksoneihin [12]. Äskettäin, 16S ribosomaalisen RNA: n geenin (rRNA) sekvenssin profiileja käytetään selvittämään mikrobien monimuotoisuuteen, usein phylotype tasolle. Käyttämällä 16S rRNA-sekvensointi, mikrobit suusta [13], [14], ruokatorvi [15], vatsa [16], ohutsuoli [17], paksusuolen [18], [19] ja emättimessä [20] on tutkittu. Nämä tutkimukset tutkitaan mikrobien monimuotoisuutta ihmiskehon ja paljasti laajan populaation viljelemätöntä ja karakterisoimattomat mikrobeja, jotka olivat olleet vaikeasti viljelyyn perustuvia menetelmiä. Näiden korkean suoritustehon 16S rRNA-sekvensointi ja muut metagenomic sekvensointi ponnisteluja, mikrobisto häiriöt havaittiin liittyvän parodontiitin [21] ja lihavuus [22], [23], [24].

vatsaan , mahan happamuutta tappaa monia nautittu mikrobeja. Yleisesti todettiin, että vatsa ei ole asuttavaksi mikään mikrobi kunnes löytö helikobakteeri
ja sen yhdessä gastriitti ja mahahaava [25]. Muut kuin muutamia muita Helicobacter
lajit [26], [27], [28], ei ollut odotettavissa, että mahassa sisältäisi monia muita eläviä mikrobeja. Vähentynyt happamuus johtuen progressiivista atrofista gastriittia voi lisätä mikrobien monimuotoisuutta [29]. Tekemässä tutkimuksessa Monstein et al.
Käyttämällä ajallista lämpötilagradientti geelielektroforeesi (TTGE) ja pienimuotoinen 16S rRNA-sekvensointi ehdottaneet mikrobit, kuten Enterococcus
, Pseudomonas
Streptococcus
, Staphylococcus
ja Stomatococcus
olivat myös läsnä mahassa [30]. Uudempi laajamittainen 16S rRNA-sekvensointi vaivaa tunnistettu 128 phylotypes 8 phyla 23 Pohjois-Amerikan potilaille [16]. Mielenkiintoista on, että läsnä on H. pylori
vatsassa ei vaikuta yleiseen koostumukseen mikrobiston klo phylum tasolla.

Tässä tutkimuksessa menimme edelleen tutkimaan mahdollisia assosiaatioita mahan mikrobiston muutokset ja ei- H. pylori
ja ei-NSAID (NHNN) gastriitti. Oletimme, että jos H. pylori
ei ole läsnä, muut bakteerien ryhmät /lajit voivat edistää tai liittyä gastriitti kehitykseen. On mikrobiston tasolla, me haluaisi myös käsitellä avainkysymys alalla: mitä luokitusjärjestelmän mukaan syvyys (s) ei mikrobiston näyttävät suhteellisen vakaa niin, että häiriöt näillä tasoilla voi olla merkitystä ihmisten terveydelle? Käytimme 16S rRNA kloonaus ja sekvensointi profiloida mahan mikrobiston normaalista ja NHNN gastriitti potilaiden ja biologisen lajin reaaliaikaiset kvantitatiiviset PCR (qPCR) määritykset määrällisesti suhteellisen runsauden firmicutes phylum ja Streptococcus
sukuun.

tulokset

Taxon puu analyysi

Analysoimme sekä kehon ja antrum koepalat 5 normaaleista yksilöistä ja 5 NHNN antraaligastriitin yksilöitä (kaikki naaraat, samanikäisiin) . Kaikki potilaat olivat H. pylori
negatiivinen sekä nopea ureaasia testi ja 16S rRNA sekvensointi. Kukaan potilaista olivat ottaneet NSAID 6 kuukautta ennen kuin ne voidaan ottaa tähystykseen. Ainakin 60 kloonia kustakin koepalan (elimen tai antrum, näin ollen ainakin 120 kloonia kukin yksittäinen) sekvensoitiin käyttämällä laajan valikoiman 16S rRNA PCR-tuotteita. Kaikkiaan 1223 ei- H. pylori
mikrobien sekvenssit saatiin. Nämä mikrobit kuuluvat 8 phyla (133 phylotypes), joista 5 phyla (firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteia, Fusobacteria ja proteobacteria) on läsnä valtaosa (1211 pois 1223, eli 99,0%). Yhdeksän phylotypes kanssa sekvenssin samankaltaisuuden vähintään 97%: sta sekvenssejä läsnä julkiset tietokannat tunnistettiin. Kuusi näistä 9 phylotypes edusti yksi kloonien (Täydentävä taulukko S1).

tutkimiseksi yleinen edustus eri luokitusjärjestelmän mukaan tasoilla vatsassa eliöstön rakensimme luokitusjärjestelmän mukaan puu (kuva 1 ja täydentävän Kuva S1). Kiinnostavaa kyllä, jokainen phylum hallitsi vain yksi tai kaksi alempaa luokitusjärjestelmän mukaan tasolle (luokka, järjestys, perheen tai suvun). Koska itse asiassa, kukin phylum hallitsi vain 1-2 sukuihin. Esimerkiksi runsain phylum firmicutes edusti 383 klooneja, näistä 333 kloonit ovat luokasta Basillit. Myöhemmin 273 kloonit olivat järjestyksessä Lactobacillales. Kaksisataa ja viisikymmentäneljä klooneja perheen Streptococcaceae. Ja kaikki 254 kloonit olivat suvun Streptococcus
. Viisi Yleisimmät lukien Streptococcus
(254 kloonia), Prevotella
(243), Neisseria
(175), Haemophilus
(122) Porphyromonas
(68), muodosti 70,5% kaikista mikrobien klooneja.

lajimäärä ja monimuotoisuus

Kun koko aineisto (1223 kloonia) käytettiin, Hyvä kattavuus oli 96%, mikä osoittaa, että neljä muutakin phylotypes odottaisi jokaista 100 ylimääräistä kloonit sekvensoidaan. Tämä taso kattaa osoitti, että suurin osa bakteerisekvenssejä olivat läsnä sekvensoitiin kloonit. Diversity arvioon arvioiden versio 8.0 osoitti, että noin 200 phylotypes voi olla läsnä ihmisen mahalaukussa biopsianäyttei- (Täydennyskuvio S2). Olemme edelleen arvioitu lajimäärä neljässä eri biopsianäytteissä (NMa (normaali antrum), NMB (normaali), AGA (Antraaligastriitti antrum), AGB (Antraaligastriitti Body); Täydentävä taulukko S2). Lajimäärä ei ollut merkitsevää eroa antraaligastriitin koepaloja ja normaali koepaloja (p > 0,1, pariton t-testi).

Bakteeri mikrobiston vertailua kahden eri anatomisia sijainteja (antrumiin ja runko) normaaleilla potilailla

normaalissa potilaille, ei havaittu merkittävää eroa kahden anatomisia sijainteja (antrumiin ja runko) minkä tahansa taksoniin ryhmien paitsi perheen Prevotellaceae ja suvun Prevotella
jossa p-arvot (Pearson'in -square testi) olivat välillä 0,01-0,05 (kuva 1).

firmicutes phylum ja Streptococcus
suvun rikastuneet vatsassa antraalivaurioiden gastriitti potilaiden

Perustuu 1223 16S rRNA sekvenssien firmicutes phylum oli runsain phylum kanssa 383 klooneja. Proteobacteria phylum oli kakkosena 345 klooneja. Mielenkiintoista on, että firmicutes Mollusca oli runsaampaa antraaligastriitin biopsiat kuin normaalissa koepaloja (41% vs. 22%, taulukko 1), kun taas proteobacteria Mollusca oli runsaasti normaalissa koepaloja (37% vs. 20%). Koska 16S rRNA-sekvensointi on kalliiksi suuremman otoskoko kehitimme taksonin-reaaliaikaiset kvantitatiivinen PCR (qPCR) lähestymistapa määrällisesti runsaasti firmicutes ja Streptococcus
(kuva 2). Taksoniin erityisiä qPCR tiedot firmicutes korreloivat voimakkaasti kanssa 16S rRNA sekvensointi tietoja edellä mainitun 20 biopsianäyttei- (2 koepaloja kunkin 5 normaali ja 5 antraaligastriitin potilasta) (Täydennyskuvio S3).

seitsemäntoista ylimääräistä paria antrum ja kehon biopsianäytteissä normaalista potilaista ja 18 uutta paria antrum ja kehon otetuissa antraaligastriitin potilaista analysoitiin firmicutes-erityisiä qPCR. Täysin, 90 koepaloja (46 näytettä 23 antraaligastriitin potilaista ja 44 näytettä 22 normaaleilla potilailla) analysoitiin (taulukko 2). Keskimääräinen ikä antraaligastriitin potilailla oli 67,6 ± 11,4 (mediaani: 69, vaihteluväli: 46-86), kun taas keski-ikä valvonnan oli 58,3 ± 14,7 (mediaani: 52, vaihteluväli: 40-87). Keski-ikä normaalin ryhmässä oli nuorempi kuin antraaligastriitin ryhmä. Mutta tilastollinen analyysi osoitti, että ei ollut korrelaatiota iän ja firmicutes tai Streptococcus
runsaus (p > 0,1) (Täydennyskuvio S4). Nämä näytteet jaettiin 4 ryhmään, antraaligastriitin antrum (AGA), antraaligastriitin runko (AGB), normaali antrum (NMa), ja normaali (NMB). Runsaus firmicutes oli merkitsevästi korkeampi AGA kuin NMa tai NMB (Yksisuuntainen ANOVA (varianssianalyysi) testi, p = 0,004 ja p = 0,046, vastaavasti) ja AGB kuin NMa (yksisuuntainen ANOVA, p = 0,039 ) (kuvio 3A). Mitään merkittävää eroa ei havaittu AGA ja AGB (yksisuuntainen ANOVA, p = 0,855), tai NMA ja NMB (p = 0,832).

Samasta biopsianäytteissä, suvun Streptococcus
analysoitiin myös Streptococcus
erityisiä qPCR. Streptococcus
runsaus oli 72% ja 76% suurempi AGA vs. NMA tai NMB, vastaavasti, ja 66% ja 70% suurempi AGB vs. NMA tai NMB, vastaavasti (kuvio 3B). P-arvot ANOVA testi on esitetty kuviossa 3B. Samanlainen firmicutes määrityksen, mitään merkittävää eroa ei havaittu AGA ja AGB (yksisuuntainen ANOVA, p = 0,999), tai NMA ja NMB (p = 0,999).

Streptococcus
viljely ja koepala pesu

Pelkästään havaitseminen 16S rRNA geenisekvenssien ei tarkoita, että eläviä bakteereja tai bakteerit ovat todellakin asukas sijasta passersby vatsassa. Meillä on siis toteutettu kaksi kokeiluja.

Ensinnäkin, yritimme bakteerit viljelyn päässä koepaloja. Viljelmä sopivassa Streptococcus
käytettiin, koska ne näyttivät olevan yliedustettuina antraaligastriitin potilailla. Kuusitoista parit (antrumiin ja runko) koepaloja käytettiin kulttuurin veriagarmaljoilla. Pesäkettä sekvensoitiin varten 16S rRNA tunnistamiseen. Yksitoista phylotypes on Streptococcus
eristettiin (Täydentävä taulukko S3). Nämä 11 phylotypes muodostivat 93,3% (tai 237 ulos 254 klooneista) kaikkien kloonien tunnistettu laaja-alue 16S rRNA-sekvensointi, mikä osoittaa, että suurin osa Streptococcus
phylotypes ovat elossa mahalaukun koepaloja.

Toiseksi, 14 biopsianäytteissä sekä antraaligastriitin ja normaaleilla potilailla pestiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), jossa on kolme yhä ankarissa olosuhteissa. Jos ankarissa pesuolosuhteet eivät poista bakteerit koepala, se on suggestiivinen että nämä bakteerit pitävät tiiviisti mahalaukun limakalvon. Yli 90% kaikista bakteereista pysyi kiinni koepaloja kolmen peräkkäisen pesua yhä ankarissa olosuhteissa (Täydennyskuvio S5a). Viimeinen pesuvaihe tehtiin suuri teho työpöydälle pyörre kone. Samoin suurin osa Streptococcus
bakteerit pysyi kiinni koepaloja jälkeen 3 pesuvaiheet (Täydennyskuvio S5B).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme profiloitu bakteerien mikrobiston pariksi mahalaukun koepaloja (antrum ja runko) normaalista ja antraaligastriitin potilaille. Kaikki potilaat ovat H. pylori
negatiivinen ja ilman NSAID käyttöä. Kautta laaja-alue 16S rRNA sekvensointi tunnistimme 1223 ei- H pylori
bakteerit klooneja, samanlainen kuin edellisessä tutkimuksessa (Bik tutkimus, 1056 ei- H pylori
bakteerit kloonia) [16 ]. Vaikka kahdessa tutkimuksessa analysoitiin kaksi maantieteellisesti (Hong Kong vs. Kalifornia) ja etnisesti (Chinese vs. valkoihoinen, latinot ja Afrikkalainen amerikkalainen) eriävät väestön yleistä mikrobisto monimutkaisuus ovat yllättävän samanlaisia ​​(taulukko 3). Molemmat tutkimukset tunnistettiin noin 130 (133 ja 127 tälle ja Bik tutkimus, vastaavasti) phylotypes kahdeksan aikaisemman seitsemän phyla. Suurin osa klooneista (77,4% Tutkimuksen ja 79,8% of Bik tutkimus) jaettiin. Kaksi yleisin sukuihin ( Streptococcus
ja Prevotella
) olivat myös samanlaiset. Nämä kaksi sukua edusti 40,6% ja 41,5% kaikista klooneista tässä tutkimuksessa ja Bik tutkimus. Molemmat tutkimukset osoittivat, että noin 200 erilaista phylotypes voi olla läsnä mahalaukun limakalvon. Tällainen dramaattinen samankaltaisia ​​kahdessa tutkimuksessa korostetaan selektiivisen paineen mikrobiston ankarissa mahan ympäristössä. Lisäksi löysimme pieni ero bakteeri mikrobiston kahden anatominen sivustoja (antrumiin ja runko) normaaleilla potilailla, huolimatta kliinistä merkitystä biopsia näytteitä eri anatomisia sivustoja [31].

Koska tiukka pesuvaiheet eivät pystyneet erottamaan mikrobiston päässä koepaloja oletamme, että suurin osa tunnistetuista bakteerit liittyvät tiiviisti mahan limakalvon. Lisäksi pystyimme viljellä suurin osa Streptococcus
phylotypes tunnistettu laaja-alue 16S rRNA-sekvensointi, mikä viittaa siihen, että nämä bakteerit voivat todellakin olla totta asukkaiden mahalaukun limakalvon.

edelleen arvostaa yleinen monimutkaisuus mahan mikrobiston rakensimme luokitusjärjestelmän mukaan puu perustuu tunnistettujen kloonien tutkia jokaisen taksonitasolle kuten pääjakso, luokka, järjestys, perhe ja suku. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että kunkin Mollusca, yksi tai kaksi sukua olivat pääasiassa läsnä. Viisi Yleisimmät lukien Streptococcus
(Mollusca firmicutes), Prevotella
ja Porphyromonas
(Bacteroidetes) sekä Neisseria
ja Haemophilus
(proteobacteria), muodosti 70,5% kaikista mikrobien klooneja.

Mielenkiintoista, 16S rRNA profilointi paljasti huomattavan yliedustus on firmicutes phylum (mikä johtui pääasiassa yli-esitys Streptococcus
suvun sisällä phylum) ja alle-esitys proteobacteria phylum että koepalat antraaligastriitin potilaista. Olemme kehittäneet biologisen lajin qPCR lähestymistapa analysoida runsauden firmicutes ja streptokokki
taxa 90 koepaloja (46 näytettä 23 antral gastriitti potilaiden ja 44 näytettä 22 normaaleilla potilailla) ja vahvisti yliedustus näiden kahden taxa in antral gastriitti mahan 42% ja 71%, vastaavasti. Useimmat Streptococcus
phylotypes tunnistaa sekvensoimalla olivat alfa-hemolyyttinen bakteerit, jotka ovat mahdollisia taudinaiheuttajia (esim Streptococcus pneumoniae
, Streptococcus mitis
ja Streptococcus salivarius
). Tietyt Streptococcus
lajit ovat resistenttejä alhainen pH-olosuhteissa ja voi säilyä mahassa [32]. Meidän viljely tiedot ja pesun koe ehdotti myös, että nämä olivat todellakin elävät, asuvat eliöstön vatsassa.

Onko kasvu Streptococcus
runsaus on kausaalinen varten antral gastriitti tai seurauksena paikallisen ympäristön muutoksiin johtuen antraaligastriitin pysyi vastataan. Yksi mahdollinen lähestymistapa on käyttää mikrobivapaaksi hiirimallissa [33]. Toinen mielenkiintoinen kysymys on, että onko tietty mikrobiston koostumusten suojaamiseksi, tai vaihtoehtoisesti, herkistää mahalaukun limakalvon tunkeutuvat taudinaiheuttajia kuten H. pylori
. Lopuksi uusi suurikapasiteettisten sekvensointiteknologioihin tarjoavat todennäköisesti kattavampaa tietoa mikrobiston eri anatomisia kohtiin ihmisen ruoansulatuskanavassa ja eri ajankohtina [34].

Materiaalit ja menetelmät

Mahalaukun biopsianäytteissä

tutkimus hyväksyi Kiinan University of Hong Kong kliinisen tutkimuksen eettinen komitea. Kaikki potilaat antoivat tietoon suostumus saamiseksi tutkimuksen yksilöitä. Kaksi mahalaukun limakalvon koepaloja (antrum ja ruumiin mahan) kerättiin kunkin potilaan aikana rutiini tähystys Prince of Wales sairaalan, Hong Kong. Kontaminaation välttämiseksi uuden steriloitu tähystys pihtejä käytettiin otettaessa toinen biopsia samasta potilaasta. Koepaloja olivat Snap-jäädytetty kuivan jään päällä ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Potilaat, jotka käyttävät antibiootteja tai NSAID (määritelty mitään käyttöä NSAID vähintään yhden viikon viimeisten 3 kuukautta ennen endoskopia) tai positiivisen H. pylori
nopealla ureaasi testi (RUT) tai histologisia testi suljettiin pois. Potilaan väestörakenne on esitetty taulukossa 2.

rakentaminen 16S rRNA kloonin kirjastoja ja sekvensointi

Yhteensä genomista DNA eristettiin koepaloja käyttämällä DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA ) lasin voittaa vatkain menetelmällä kuten aikaisemmin on kuvattu [16]. Kaksi negatiiviset kontrollit vain steriiliä vettä myös eristettiin käyttäen samaa protokollaa. Uutettu DNA pitoisuudet mitattiin NanoDrop 1000 Spektrofotometri (Thermo Scientific, Minneapolis, MN, USA). Kahden yleisesti bakteeri-16S rRNA-alukkeita, B8F20 [35] (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') ja B806R20 [36] (5'GGACTACCAGGGTATCTAAT-3') käytettiin monistamaan alue, joka vastaa asemaa 8-806 ja Escherichia coli
16S rRNA-geeniin. 25 ui PCR-seokset sisältyvät 1 x PCR-puskuria, kuten 1,5 mM MgCl _{2 (Qiagen), 20 mM tetrametyyliammoniumkloridi, 0,1 mM kutakin dNTP: tä, 0,4 uM kutakin aluketta, 1 yksikön Hotstar Taq DNA-polymeraasia (Qiagen), ja 2 ui uutettua DNA: ta. Kolmenkymmenen syklin PCR suoritettiin monistamaan 799 emäsparin fragmentti. PCR-tuotteet tarkistetaan agaroosigeelielektroforeesilla. Kunkin tuotteen, yhden kaistan voitiin havaita UV-valossa, kun taas mitään bändi nähtiin negatiivisessa kontrollissa. 16S rRNA-tuotteet puhdistettiin Sephadex G-50-pylvääseen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), liitettiin T vektoreita ja transformoitiin E. coli
JM109-soluihin käyttämällä pGEM-T-easy-vektoriin (Promega, Madison, WI, USA). Valitsimme 5 potilasta (10 biopsianäytteissä) kanssa antral gastriitti ja 5 normaalit kontrollit (10 biopsianäytteissä) rakentaa 20 16S rRNA kirjastoissa. Kunkin mahalaukun koepala kirjasto, vähintään 60 pesäkettä valittiin sekvensointiin. PCR-tuotteet sekvensoitiin käyttämällä BigDye Terminator v3.1 syklisekvensointireagenssipakkausta (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sekvensointireaktiot käyttäen B8F20 kuin Sekvenointialuke suoritettiin ABI 3730xl sekvensseri (Applied Biosystems).}

Fylogeneettinen analyysi ja mikrobien monimuotoisuuden arviointi

kimeeriset testissä käytetään Bellerophon palvelin (http: //foo.maths.uq.edu.au/~huber/bellerophon.pl) [37], käytettiin testaamaan mahdollisten kimeerisiä sekvenssejä. Yksi klooni, havaittiin olevan kimeerisen ja sen jälkeen pois. Sitten 1223-kimeeriseen sekvenssit analysoitiin RDP II (Ribosomaalisen Database Project II) luokittelija (http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp), joka perustuu naiivi Bayes rRNA luokittelija [38]. Basic paikallinen linjaus hakuvälineenä (BLAST) tarjoamat Green Genes (http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-blast_interface.cgi) suoritettiin löytää kaikkein samanlaisten sekvenssien tietokantaan. Käytimme 97% sekvenssi-identiteetti cutoff määrittelyyn phylotypes [39]. Sekvenssit identiteetti < 97% nykyiseen sekvenssit tietokantaan pidettiin romaani. Taksoniin puu rakennettiin käyttämällä luokittelun tulokseen RPD II luokittelija. Chao1 estimaattori arvioiden 8 ohjelmaa (http://viceroy.eeb.uconn.edu/estimates) käytettiin arvioida mikrobien monimuotoisuutta. Hyvä: n menetelmää käytettiin laskettaessa sekvensointi kattavuus [40].

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR (qPCR) B

Q-PCR-alukkeet ja koettimet suunniteltiin perustuen sekvensseihin saatu kloonattu kirjastoista. Ensin linjassa kaikki kloonattu sekvenssit ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) kanssa oletusparametrit. QPCR alukkeet olivat B8F20 ja B801R21 (5'ACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3 '). Takauskeskuksen koetin sekvenssit ovat: yleinen koetin (VIC) 5'- CAGCAGCCGCGGTAA-3 ', firmicutes koetin (FAM) 5'- AAGATTCCCTACTGCTGCCT-3' ja Streptococcus
koetin (FAM) 5'- TACACATGGAATTCCAC-3 ' . Mitata runsaasti tietyn taksonominen kaksi koetinta (yksi spesifinen taksoniin kiinnostava ja toinen geneerinen kaikissa bakteerit) käytettiin samoja PCR-amplikonin. (Kuvio 2). 25 ui PCR-seos sisältyy 1 x puskuria A, 3,5 mM MgCl _{2, 200 uM dNTP: tä, jossa dUTP dTTP: n sijasta, 400 nM kutakin aluketta, 100 nM kutakin koetinta, 0,01 U /ul urasiili-N-glykosylaasia, ja 0,05 U /ul TaqGold -tuotetta (Applied Biosystems). Jotta firmicutes erityisiä määrityksessä pyöräily kunto oli: 1) 50 ° C 2 min; 2) 95 ° C: ssa 10 min; 3) 40 sykliä 95 ° C 20 sekuntia, 58 ° C 15 sekuntia, 70 ° C: ssa 80 sekunnin ajan. Sillä Streptococcus
erityisiä määrityksessä pyöräily kunto oli: 1) 50 ° C 2 min; 2) 95 ° C: ssa 10 min; 3) 40 sykliä 95 ° C 20 sekuntia, 57 ° C 1 min, 70 ° C 1 min. Streptococcus
16S rRNA fragmentti (DQ346438) kloonattiin pGEM-T easy-vektoriin käytettiin standardina qPCR (molemmat varten firmicutes ja Streptococcus
määritykset) ABI 7500 todellinen -Aika PCR -järjestelmää (Applied Biosystems). Johtuen joitakin pieniä eroa yleisiä ja luokitusjärjestelmän mukaan koettimilla, delta delta kynnyksen sykli (ddCt) käytettiin osoittamaan runsaasti erityisiä luokitusjärjestelmän mukaan koko bakteerikanta. (Ct TSU: Ct of taksonin spesifisestä koettimen tuntematon näytteitä, Ct BUU: Ct bakteeri yleinen koetin tuntemattomista näytteistä, Ct TSS: Ct of taksonin spesifisestä koetin plasmidista vakio, Ct BSS: Ct bakteeri yleinen koetin plasmidista standardi)}

Teoriassa runsaasti taksonin on 2 ^-ddCt.

Streptococcus
Viljely

Saimme 32 ylimääräistä koepaloja 16 potilasta bakteeriviljely. Koepaloja otettiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS, pH = 7,2) ja leikataan pienempiin osiin, joita veitsellä. Sitten näytteet levitetään veriagarlevyille (CM331, Oxoid, Basingstoke, UK), jossa oli 5% hevosen verta. Levyt pantiin 5% CO _{2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Pesäkkeet hemolyysi veressä agar poimittiin 16S rRNA sekvensointia.}

Biopsia pesu

koepala pesukokeeseen, 14 lisänäytteitä molemmilta antral gastriitti potilaiden ja normaalien ihmisten kerättiin. Kukin näyte pantiin 2,0 ml: n putkeen ja pestiin 3 kertaa (200 ui PBS: ää kutakin pesua) kasvavasti ankarissa olosuhteissa. Ensimmäinen pesu tehtiin varovasti käsin ravistellen. Supernatantti siirrettiin pois. Uutta PBS lisättiin koepaloja edelleen pesua. Toisen ja kolmannen pesun jälkeen putkia pyöritettiin että putki sekoitin Trio TM-2F (All-lab tieteellinen, AU) on asteen 3 ja 6 teho vastaavasti karkeasti vastaten lempeä ja vorteksoitiin voimakkaasti. Sitten duplex reaaliaikaisia ​​PCR suoritettiin testata koko bakteerit ja Streptococcus
määrät PBS supernatanteista kolmesta pesuvaiheet ja pesty koepaloja.

Tilastot analyysi

Pearsonin khiin neliö testiä käytettiin vertaamaan kloonausnumerot eri taksonien eri näytteen ryhmien (NMa: normaali antrum, NMB: normaali, AGA: antraaligastriitin antrum, AGB: antraaligastriitin elin) 16S rRNA sekvensointi tuloksen, kun klooni määrä kunkin näytteen ryhmässä oli vähintään 10. ANOVA-testiä käytettiin vertaamaan bakteerien runsaasti tietoja qPCR määrityksissä. Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen SPSS for Windows, versio 11.5 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). P < 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Vertaamiseksi lajimäärä normaalin ja antral gastriitti potilaiden todellinen phylotype määrä kunkin potilaan laskettiin ensin. Paritonta t-testiä käytettiin sitten verrata näitä kahta potilasryhmissä.

tukeminen Information
Kuva S1.
Yksityiskohtainen luokitusjärjestelmän mukaan puu
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s001
(2,00 MB TIF) B Kuva S2.
lajimäärä arvio
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s002
(0,97 MB TIF) B Kuva S3.
korrelaatio qPCR ja 16S rRNA kloonaus ja sekvensointi
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s003
(0,98 MB TIF) B Kuva S4.
puute korrelaatio potilaan iän ja firmicutes tai Streptococcus runsauden
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s004
(2,01 MB TIF) B Kuva S5.
Harsh pesu ei poista bakteerien koepaloja
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s005
(1,90 MB TIF) B Taulukko S1.
Novel phyltoypes
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s006
(0,03 MB XLS) B Taulukko S2.
lajimäärä arvion eri biopsianäytteissä
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s007
(0,02 MB XLS) B Taulukko S3.
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s008
(0,02 MB XLS) B

• PLoS ONE: Enhanced M1 makrofaagianalyysi polarisaatio Human Helikobakteeri-Associated atrofisen gastriitin ja rokotetun Hiiret
• PLoS ONE: isositraattidehydrogenaasin Helicobacter pylori mahdollisesti indusoi humoraalisen immuunivasteen henkilöillä, joilla on mahahaavan ja gastriitti