Ploche ONE: Bakteriálna mikroflóry profilovanie v gastritídou bez infekcie Helicobacter pylori alebo nesteroidný protizápalový liek Use

abstraktné

Posledné 16S ribozomálnej RNA génu (rRNA) molekulárnej profilovacie na žalúdočnú sliznicu odhalili prekvapivú zložitosť mikroflóry. Helicobacter pylori
infekcie a nesteroidné protizápalový liek (NSAID) použitie sú dva hlavné prispievatelia do žalúdka a žalúdočného vredu. Avšak, len málo je známe o vzťahu medzi ostatnými členmi žalúdka mikrobiálnej flóry a žalúdočných ochorení. V tejto štúdii, klonovanie a sekvencovaní 16S rRNA bola použitá na profil žalúdočnej mikroflóry z normálnych a gastritídy pacientov. Boli identifikované sto tridsať tri phylotypes z ôsmich bakteriálnych kmeňov. Bolo zistené, že mikroflóra žalúdka, ktoré majú byť tesne priľnúť na sliznicu. Jedenásť Streptococcus
phylotypes boli úspešne pestujú z biopsie. Jeden až dva rody predstavoval väčšinu klonov v niektorej z identifikovaných kmeňov. Ďalej sme vyvinuli dva v reálnom čase testy kvantitatívnej PCR pre kvantifikáciu relatívnej hojnosti Firmicutes kmeňa a Streptococcus
rod. Výrazne vyššie množstvo v Firmicutes kmeňa a Streptococcus
rod v Firmicutes kmeňa bola pozorovaná u pacientov s antrálnej gastritídou, v porovnaní s normálnymi kontrolami. Táto štúdia naznačuje, že rod taxón úroveň môže do značnej miery predstavujú oveľa vyšších taxónov, ako je napríklad kmeňa. Klinický význam a mechanizmus je základom zmenené mikroflóry zloženie v žalúdku vyžadovať ďalšie funkčné štúdie

Citácia :. Li XX, Wong GL-H, K KF, Wong VW-S, Lai LH, Chow DK-L, et al. (2009) Bakteriálne mikroflóry Profilovanie v gastritídou bez Helicobacter pylori
infekcie alebo nesteroidný protizápalový liek použitie. PLoS ONE 4 (11): e7985. doi: 10,1371 /journal.pone.0007985

Editor: Niyaz Ahmed, University of Hyderabad, India

prijatá: 04.06.2009; Prijaté: 27. októbra 2009; Publikované: 24.novembra 2009

Copyright: © 2009 Li et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo podporuje čínske univerzite v Hongkongu. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

symbiotické mikroflóry, je neoddeliteľnou súčasťou človeka [1]. Drvivá väčšina mikróbov obývajú nášho zažívacieho traktu, s viac ako 800 druhov z deviatich bakteriálne a jeden archaeal kmeňov. Táto rôznorodá mikroflóry prispieva k dozrievaniu čreva [2], [3], [4], hostiteľ výživu a odolnosť proti patogén [5]. Mikróby tiež priamo komunikovať s ľudského hostiteľa tým, že reguluje črevné epiteliálne proliferácie, ukladanie tuku a zápalové reakcie [3], [6], [7]. Zatiaľ čo niektorí mikróby môžu bez pomoci spôsobiť vážne ochorenie, mnoho chronických ochorení sú pravdepodobne kvôli odchýlkam v celkovej mikroflóry. Napríklad, alergie a astmu sú spojené s používanie antibiotík v detstve, ktorý môže ovplyvniť črevnej mikroflóry [8]. Iné stavy spojené s črevnej mikroflóry patrí oneskoreným nástupom autizmus [9], zápalové ochorenie čriev [10], a rakoviny [11].

Tradične kultivačných metód na báze sa používajú na získanie mikrobiálne izoluje pre ďalšiu charakterizáciu. Takéto štúdie za predpokladu, že základ nášho chápania mikrobiológie. Avšak kultivácia je často prácne a môže zlyhať pre mnoho mikróbov. Mikroskopická pozorovanie je tiež použitý na odhad hojnosť mikróbov, a v obmedzenej miere, priradí mikróby na taxóny [12]. V poslednej dobe, 16S ribozomálnej RNA génu (rRNA) sekvencia profily sa používajú pre objasnenie mikrobiálne rozmanitosť, často na úroveň phylotype. Použitie 16S rRNA sekvenčné spracovanie, mikróby z úst [13], [14], pažerák [15], žalúdka [16], tenké črevo [17], hrubého čreva [18], [19] a vagína [20] boli študované. Tieto štúdie skúmali mikróbov v ľudskom tele a odhalila obrovské populáciu neobrábaných a necharakterizovaných mikroorganizmy, ktoré boli pre prchavý kultivačných metód založených na. Prostredníctvom týchto vysokou priepustnosťou 16S rRNA sekvenovanie a ďalších metagenomic úsilie sekvencovania bolo zistené, že mikroflóry odchýlky, ktoré majú byť spojené s paradentóze [21] a obezity [22], [23], [24].

V žalúdku , žalúdočná kyslosť zabije mnoho požitej mikróby. To bolo všeobecne za to, že žalúdok nie je obývateľné žiadnym mikróbov až do objavu Helicobacter pylori stroje a jej vzťah s gastritídou a peptickým vredom [25]. Iné ako niekoľko ďalších Helicobacter
druhov [26], [27], [28], to bolo neočakáva, že žalúdok bude obsahovať mnoho ďalších živých mikróbov. Znížená kyslosť v dôsledku progresívnej atrofickej gastritídy môže zvýšiť mikrobiálnu rozmanitosť [29]. Štúdia Monstein et al. For S časová teplotný gradient gélovej elektroforézy (TTGE) a drobného 16S rRNA sekvencovania navrhol ďalších mikróbov, napríklad Enterococcus
Pseudomonas
, Streptococcus
, Staphylococcus stroje a Stomatococcus
boli tiež prítomné v žalúdku [30]. Novšie vo veľkom meradle 16S rRNA sekvencovania úsilie poznalo 128 phylotypes od 8 kmeňov v 23 severoamerických pacientov [16]. Zaujímavé je, že prítomnosť H. pylori v žalúdku
nemá vplyv na celkové zloženie mikroflóry na úrovni kmeň.

V tejto štúdii sme išli ďalej, aby vyšetrila prípadné súvislosti medzi žalúdočných zmien mikroflóry a zákazu H. pylori stroje a non-NSAID (NHNN) zápal žalúdka. Predpokladali sme, že keď H. pylori
nie je prítomný, iné bakteriálne skupiny /druhy môžu prispieť k alebo byť spojená s rozvojom gastritída. Na úrovni mikroflóry, sme tiež chceli riešiť kľúčový problém v tejto oblasti: v akom taxón hĺbky (s) Bez mikroflóry javí ako pomerne stabilná tak, že odchýlky na týchto úrovniach môžu byť relevantné pre ľudské zdravie? Použili sme génové klonovanie a sekvencovania 16S rRNA na profil žalúdočnej mikroflóry z normálnej a NHNN gastritída pacientov, a taxón špecifickú real-time kvantitatívnej PCR (qPCR), testy pre kvantifikáciu relatívnej hojnosť kmeňa Firmicutes a Streptococcus
rod.

výsledky

strom taxónu analýza

analyzovali sme telo aj dutine biopsie od 5 normálnych jedincov a 5 NHNN antrálnej gastritídy jednotlivcov (všetky ženy, vek-uzavreté) , Všetci pacienti boli H. pylori
negatívne ako rýchlym testom ureázy a 16S rRNA sekvenovania. Žiadny z pacientov si vzal NSAID počas 6 mesiacov pred začatím prechádza endoskopia. Najmenej 60 klonov z každej biopsiu (subjektom alebo dutine, teda najmenej 120 klonov z každého jednotlivca) boli sekvenované za použitia Širokospektrálny 16S rRNA PCR produktov. Celkom 1223 non H. Získa sa pylori
mikrobiálne sekvencie. Tieto mikroorganizmy patria do 8 kmeňov (133 phylotypes), z ktorých sú prítomné v úplnej väčšine 5 phyla (Firmicutes, bacteroidetes, Actinobacteia, Fusobacteria a Proteobacteria) (1211 z 1223, alebo 99,0%). Boli identifikované deväť phylotypes s sekvenčné podobnosti menej ako 97% so sekvenciami prítomnými vo verejných databázach. Šesť z týchto 9 phylotypes boli zastúpené jednotlivé klony (Doplňujúce tabuľka S1).

Pre zistenie celkovej zastúpenie rôznych úrovniach taxónu v žalúdku bioty sme skonštruovali taxón strom (obrázok 1 a doplnkové Obrázok S1). Je zaujímavé, že každý kmeň bol dominovať len jeden alebo dvoma nižšími úrovňami taxónu (trieda poriadku, čeľade alebo rodu). Ako v skutočnosti, každý kmeň bol ovládaný iba 1-2 rody. Napríklad, najčastejšie kmeň Firmicutes reprezentoval 383 klonov, z týchto 333 klony sú z triedy bacilov. Následne sa 273 klonov z rádu Lactobacillales. Dvesto päťdesiat štyri klony boli z rodiny Streptococcaceae. A všetky 254 klonov boli z rodu Streptococcus
. Päť najbežnejšie rody vrátane Streptococcus
(254 klonov), Prevotella
(243), Neisseria
(175), Haemophilus
(122) Porphyromonas
(68), predstavuje 70,5% z celkového počtu mikrobiálnych klonov.

Druhová bohatosť a rozmanitosť

Keď bol použitý celý dátový súbor (1223 klonov), Goodův pokrytie bola 96%, čo naznačuje, že štyri ďalšie phylotypes by sa dalo očakávať na každých 100 ďalších klonov, ktoré majú byť sekvenované. Táto miera pokrytia je uvedené, že väčšina bakteriálnych sekvencie boli prítomné v sekvenčných klonov. Odhad rozmanitosť odhady verzia 8.0 je uvedené, že asi 200 phylotypes môžu byť prítomné vo vzorkách ľudských biopsiou žalúdka (Doplňujúce obr S2). Ďalej odhaduje druhovej bohatosti v štyroch rôznych biopsia vzoriek (NMA (Normal dutine), NMB (normálna telesná), AGA (antrálnej gastritída dutine), AGB (antrálnej gastritída subjekt), Doplňujúce tabuľka S2). Druhová bohatosť nelíšil medzi antrálnej gastritídy biopsiou a normálne biopsiou (p > 0,1, nepárový t-test)

bakteriálna mikroflóra porovnanie medzi dvoma rôznymi anatomických miestach (antra a tela) u normálnych pacientov
<. p> V normálnych pacientov, žiadny významný rozdiel bol pozorovaný medzi dvoma anatomických miestach (antra a tela) pre niektorú z taxón skupinami, s výnimkou rodinného Prevotellaceae a rodu Prevotella
, kde sa hodnoty p (Pearson chi -Čtyřhranná test) sa pohybovali v rozmedzí 0,01 až 0,05 (Obrázok 1).

Firmicutes kmeň a Streptococcus
rod boli obohatené v žalúdku antrálnej gastritída pacienti

na základe 1223 16S rRNA sekvencie sa Firmicutes kmeň bol najhojnejšia kmeň s 383 klonov. Proteobacteria kmeň bol v tesnom závese s 345 klonov. Je zaujímavé, že Firmicutes kmeň bol hojnejší v antrálnej gastritídy biopsiou ako v normálnej biopsiou (41% verzus 22%, Tabuľka 1), zatiaľ čo Proteobacteria kmeň bol hojnejší v normálnych biopsiou (37% vs. 20%). Vzhľadom k tomu, 16S rRNA sekvencovania je náklady príliš vysoké pre väčšiu veľkosť vzorky, sme vyvinuli v reálnom čase kvantitatívne prístup taxón špecifickou PCR (qPCR) pre kvantifikáciu hojnosť Firmicutes a Streptococcus
(obrázok 2). Taxónu špecifické údaje pre qPCR Firmicutes vysokej miere korelovali s sekvenčných dát 16S rRNA na vyššie uvedených 20 vzoriek biopsie (2 biopsia pre každú z 5 normálne a 5 pacientov antrálnej gastritídy) (Doplňujúce obr S3).

sedemnásť ďalších párov dutine a biopsia telo vzorkách od zdravých jedincov a 18 ďalších párov dutine a biopsia telo vzoriek od pacientov s gastritídou antrálnej boli analyzované pomocou Firmicutes špecifické qPCR. Úplne, 90 biopsia (46 vzoriek od pacientov s gastritídou 23 antrálnej a 44 vzoriek z 22 normálnych pacientov) boli analyzované (tabuľka 2). Priemerný vek pacientov antrálnej gastritídy bol 67,6 ± 11,4 (medián: 69, rozsah: 46-86), zatiaľ čo priemerný vek kontrol bolo 58,3 ± 14,7 (medián: 52, rozsah: 40-87). Priemerný vek normálnej skupine bola mladšia než antrálnej gastritída skupiny. Ale Štatistická analýza ukázala, že neexistuje žiadny vzťah medzi vekom a Firmicutes alebo Streptococcus
množstvo (p > 0,1) (Doplňujúce obr S4). Tieto vzorky boli rozdelené do 4 skupín, antrálnej gastritída Antrum (AGA), antrálnej gastritída tela (AGB), normálne dutine (NMA), a normálnu telesnú (NMB). Hojnosť Firmicutes bol v AGA výrazne vyššia ako v NMA alebo NMB (One-way ANOVA (analýza rozptylu) test, p = 0,004 a p = 0,046, v tomto poradí), a v AGB ako v NMA (jednosmerné ANOVA, p = 0,039 ) (obrázok 3A). Žiadny významný rozdiel bol pozorovaný medzi AGA a AGB (jedna ANOVA, p = 0,855), alebo NMA a NMB (p = 0,832).

Z rovnakých biopsie vzoriek, rod Streptococcus
bol tiež analyzovaný Streptococcus
-specifických qPCR. Streptococcus
množstvo bolo 72% a 76% vyššie u AGA versus NMA alebo NMB, v danom poradí, a 66% až 70% vyššia v AGB vs. NMA alebo NMB, v danom poradí (obrázok 3B). Tieto hodnoty p pre ANOVA testu sú uvedené na obrázku 3B. Podobne ako u testu Firmicutes, žiadny významný rozdiel bol pozorovaný medzi AGA a AGB (jedna ANOVA, p = 0,999), alebo NMA a NMB (p = 0,999).

Streptococcus
pestovania a biopsia umývanie

samotná detekcia sekvencie génu 16S rRNA, neznamená, že živé baktérie sú prítomné alebo baktérie sú skutočne bydlisko miesto okoloidúcich v žalúdku. tak sme vykonali dva ďalšie pokusy.

Po prvé, sme sa pokúsili kultivácii baktérií z biopsie. Kultúra stav vhodný pre Streptococcus
bol použitý, pretože sa zdá byť zastúpené v nadmernom počte pacientov antrálnej gastritídy. Šestnásť pary (antra a tela) biopsia boli použité pre kultiváciu na krvnom agare. Kolónie boli sekvenované pre 16S rRNA génu pre identifikáciu. Jedenásť phylotypes zo Streptococcus
boli izolované (doplňujúce tabuľke S3). Týchto 11 phylotypes predstavovali 93,3% (alebo 237 z celkových 254 klonov) všetkých klonov identifikovaných v Širokospektrálne 16S rRNA sekvenovania, čo naznačuje, že väčšina Streptococcus
phylotypes sú nažive v žalúdočných biopsiou.

Po druhé, 14 vzoriek biopsie z oboch antrálnej gastritídy a zdravých jedincov boli premyté fosfátovým pufrom (PBS) s tromi stále drsných podmienkach. Ak drsných podmienok premývania neodstraňujú baktérií z biopsie, je sugestívne, že tieto baktérie tesne priložiť k žalúdočnej sliznici. Viac ako 90% z celkového počtu baktérií zostala spájané s biopsií po tri po sebe nasledujúce premytí stále drsných podmienkach (Doplňujúce obr S5A). Posledným krokom premývania sa uskutočnilo pri vysokom výkone na desktop vír stroja. Rovnako tak väčšina Streptococcus
baktérie zostali pripojené k biopsiu po premývanie 3 (doplnkový obr S5B).

Diskusia

V tejto štúdii sme sa profiloval bakteriálnej mikroflóry v párových žalúdočných biopsiou (antra a tela) z normálnych a antrálnej pacientov s gastritídou. Všetci pacienti sú H. pylori
negatívne a bez použitia NSAID. Prostredníctvom široká škála génu 16S rRNA sekvenovania sme identifikovali 1.223 bez možnosti H pylori
baktérie klonov podobne ako predchádzajúci štúdii (štúdia Bik, 1056 non H pylori
baktérie klony) [16 ]. Hoci obe štúdie analyzovali dva geograficky (Hong Kong vs. Kalifornii) a etnicky (čínske vs. belochmi, Hispánci a afro-americká) odlišných populácií, celkovej mikroflóry komplikácie sú prekvapivo podobné (tabuľka 3). Obe štúdie zistili, približne 130 (133 a 127 pre túto a štúdie Bik, v uvedenom poradí) phylotypes od siedmich do ôsmich kmeňov. Väčšina klonov (77,4% z tejto štúdie a 79,8% štúdia Bik) boli zdieľané. Dva najhojnejšia rody ( Streptococcus stroje a Prevotella
) boli tiež identické. Tieto dva rody zastúpené 40,6% a 41,5% z celkového počtu klonov v tejto štúdii a štúdii Bik. Obe štúdie ukázali, že približne 200 rôznych phylotypes môže byť prítomná v žalúdočnej sliznici. Takéto dramatické podobnosť medzi dvoma štúdií poukazuje na selektívny tlak pre mikrobiálnej flóry v rámci drsnom prostredí žalúdka. Ďalej sme zistili, malý rozdiel v bakteriálnej mikroflóry medzi oboma anatomických miestach (antra a telo) u normálnych pacientov, aj napriek klinickým významom pre odber vzoriek pre biopsiu na rôznych anatomických miestach [31].

Vzhľadom na to, že prísne kroky premytie neboli schopné oddeliť mikroflóry z biopsie, sme hypotézu, že väčšina z týchto baktérií, sú spojené pevne s žalúdočnú sliznicu. Ďalej sme boli schopní pestovať väčšinu Streptococcus
phylotypes identifikovaná široká dosahu 16S rRNA sekvenovania, čo naznačuje, že tieto baktérie môžu byť skutočne pravda, obyvatelia v žalúdočnej sliznici.

Ak chcete ďalej ocenia, celková zložitosť žalúdka mikroflóry, sme skonštruovali taxón strom na základe identifikovaných klonov sa pozrieť do každej taxónu úrovni, vrátane kmeň, trieda, poriadok, rodinu a rod. Zaujímavé je, že sme zistili, že pre každý kmeň, jeden alebo dva rody boli prevažne prítomné. Päť Najbežnejšia je Streptococcus
(kmeň Firmicutes), Prevotella stroje a Porphyromonas
(bacteroidetes), rovnako ako Neisseria stroje a Haemophilus
(Proteobacteria), predstavuje 70,5% z celkového počtu mikrobiálnych klonov.

je zaujímavé, že 16S rRNA profilovanie odhalil významné nadmerné zastúpenie v Firmicutes kmeňa (predovšetkým v dôsledku nadmernej zastúpenie z Streptococcus
rod vnútri kmeňa) a nízke zastúpenie kmeňa Proteobacteria v biopsiou od pacientov s gastritídou antrálnej. Vyvinuli sme qPCR prístup taxón špecifické pre analýzu hojnosti Firmicutes a streptokoka
taxa 90 biopsiou (46 vzoriek od 23 pacientov antrálnej gastritídou a 44 vzoriek z 22 normálnych pacientov) a potvrdil nadmerné zastúpenie tieto dve taxónov v antrálnej gastritída žalúdku o 42% a 71%, v danom poradí. Väčšina z Streptococcus
phylotypes identifikované sekvencovanie boli alfa-hemolytickej baktérie, ktoré sú potenciálnymi patogény (napríklad Streptococcus pneumoniae
Streptococcus mitis stroje a Streptococcus salivarius
). Určité Streptococcus
druhy sú odolné voči podmienok nízkeho pH a môže prežiť v žalúdku [32]. Naše údaje o pestovaní a umývanie Experiment takisto naznačil, že išlo o skutočne žijú, rezidentné bioty v žalúdku.

Či nárast Streptococcus
hojnosti je príčinou pre antrálnej žalúdočnej sliznice alebo v dôsledku zmien životného prostredia miestneho vzhľadom k antrálnej gastritída zostávalo byť zodpovedané. Jeden možný prístup je použitie bezmikrobiální myši modelu [33]. Ďalšou zaujímavou otázkou je, že to, či určité mikroflóry zloženie chrániť, alebo alternatívne, citlivosť na žalúdočnú sliznicu od invázie patogénov, ako je napríklad H. pylori
. A konečne, nové sekvenčné technológie s vysokou priepustnosťou budú pravdepodobne poskytnúť komplexné údaje o mikroflóry z rôznych anatomických miestach pozdĺž ľudskom zažívacom trakte a v rôznych časových bodoch [34].

Materiály a metódy

Žalúdočné biopsia vzorky

Táto štúdia bola schválená čínskej univerzite v Hongkongu klinického výskumu etickej komisie. Všetci pacienti dal písomný informovaný súhlas na získanie študijných vzorky. Dva žalúdočnej sliznice biopsia (antra a tela žalúdka) odobrali od každého pacienta počas rutinnej endoskopia u Prince of Wales Hospital, Hong Kong. Aby nedošlo ku kontaminácii, nový sterilizované endoskopických klieští bol použitý pri robení druhej biopsii z rovnakého pacienta. Biopsie boli snap-mrazený na suchom ľade a skladované pri -80 ° C. Pacienti užívajúci antibiotiká alebo nesteroidné antireumatiká (definované ako akékoľvek použitie NSAID najmenej počas jedného týždňa v posledných 3 mesiacov pred endoskopia), alebo pozitívne testovaný na H. pylori
rýchlym testom ureázy (RUT) alebo histologického testu boli vylúčené. demografia pacienta je uvedené v tabuľke 2.

Konštrukcia 16S rRNA klonových knižníc a sekvenčné

Celková genomická DNA bola izolovaná z biopsiou s použitím DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA ) so sklom poraziť metódu šľahač ako bolo opísané skôr [16]. Dve negatívne kontroly len sterilnej vody boli extrahované s použitím rovnakého protokolu. Extrahované Koncentrácia DNA bola meraná pomocou spektrofotometra (NanoDrop 1000 Thermo Scientific, Minneapolis, MN, USA). Dva univerzálne bakteriálne 16S rRNA primery, B8F20 [35] (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '), a B806R20 [36] (5'-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3') boli použité k amplifikácii oblasti zodpovedajúcej polohe 8 na 806 Escherichia coli
génu 16S rRNA. So 25 ul PCR zmesi v cene 1 x PCR pufer obsahujúci 1,5 mM MgCl _{2 (Qiagen), 20 mM tetramethylamonium chloridu, 0,1 mM každého dNTP, 0,4 uM každého priméru, 1 jednotka HotStar Taq DNA polymerázy (Qiagen), a 2 ul extrahovaná DNA. Tridsať-cyklus PCR bol vykonaný pre amplifikáciu fragmentu 799 bp. PCR produkty boli kontrolované elektroforézou na agarosovém gélu. Pre každý výrobok, jediný pás možno pozorovať pod UV svetlom, zatiaľ čo žiadna skupina bola vidieť u negatívnych kontrol. Produkty 16S rRNA boli čistené pomocou Sephadex G-50 kolóne (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ligován s T vektorov a transformované do E. coli JM109
buniek s použitím pGEM-T ľahký vektorového systému (Promega, Madison, WI, USA). Vybrali sme 5 pacientov (10 vzoriek) biopsia s antrálnej gastritídou a 5 normálnych ovládacích prvkov (10 vzorkách biopsia), aby zostavilo 20 16S rRNA génových knižníc. Pre každú knižnicu žalúdočné biopsia, najmenej 60 kolónie boli vybrané pre sekvencovania. PCR produkty boli sekvenované pomocou BigDye Terminátor v3.1 sekvenčné cyklus kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sekvenačnej reakcie používajúce B8F20 ako sekvenačního primeru boli vykonané na ABI 3730xl sekvenátoru (Applied Biosystems)}

fylogeneticky analýza a mikróbov odhad

chimérická Test pomocou servera Bellerophon (http .: //foo.maths.uq.edu.au/~huber/bellerophon.pl) [37], bol použitý pre testovanie potenciálnych chimérická sekvencie. Bolo zistené, jeden klon, že chimérická a následne vylúčená. Potom sa 1223 nonchimeric sekvencie boli analyzované pomocou PRV II (ribozomálnu Database Project II) klasifikátora (http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp) na základe naivný Bayesovský rRNA triedičky [38]. Základné local alignment vyhľadávací nástroj (BLAST) poskytované Green Genes (http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-blast_interface.cgi) bola vykonaná nájsť najviac podobné sekvencie v databáze. Použili sme 97% sekvenčnú identitu ako cut-off pre definovanie phylotypes [39]. Sekvencie s identitou < 97% na súčasných sekvencie v databáze boli považované za nové. Taxónu Strom bol konštruovaný s použitím klasifikácie výsledok triediči RPD II. Chao1 odhadom na 8 programu odhady (http://viceroy.eeb.uconn.edu/estimates~~HEAD=pobj) bola použitá na odhad mikrobiálnej rozmanitosť. Goodův metóda bola použitá na výpočet sekvenčné pokrytie [40].

Real-time kvantitatívne PCR (qPCR)

Q-PCR primery a sondy boli navrhnuté na základe sekvencií získaných z klonovaných knižníc. Najprv sme splatené všetky klonovaných sekvencií ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) s východiskové parametre. Tieto qPCR primery boli B8F20 a B801R21 (5'-ACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3 '). Sekvencie MGB sondy sú: všeobecný sonda (VIC) 5'-CAGCAGCCGCGGTAA-3 ', Firmicutes sondy (FAM) 5'-AAGATTCCCTACTGCTGCCT-3' a Streptococcus
sondy (FAM) 5'-TACACATGGAATTCCAC-3 ' , Pre meranie hojnosť konkrétneho taxónu, dve sondy (jeden špecifický pre taxónu záujmu a druhým generickým všetkých baktérií) boli použité v rovnakej PCR amplikónu. (Obrázok 2). 25 ul PCR zmes uvedie 1 x pufra A, 3,5 mM MgCI _{2, 200 uM dNTP s dUTP namiesto dTTP, 400 nM každého priméru, 100 nM každého sondy, 0,01 U /ul Uracil-N-glykosylázy, a 0,05 U /ul TaqGold (Applied Biosystems). Pre Firmicutes špecifickým testom, stav jazda na bicykli bola: 1) 50 ° C po dobu 2 minút; 2) 95 ° C počas 10 minút; 3) 40 cyklov pri 95 ° C počas 20 sekúnd, 58 ° C počas 15 sekúnd, 70 ° C počas 80 sekúnd. Za Streptococcus
-specifické test, stav jazda na bicykli bola: 1) 50 ° C po dobu 2 minút; 2) 95 ° C počas 10 minút; 3) 40 cyklov pri 95 ° C počas 20 sekúnd, 57 ° C po dobu 1 minúty, 70 ° C po dobu 1 min. Streptococcus
16S rRNA fragmentov (DQ346438) klonom do jednoduchého vektora pGEM-T bol použitý ako štandard pre qPCR (obe hodnoty za Firmicutes a Streptococcus
testy) v ABI 7500 real -time PCR systém (Applied Biosystems). Vzhľadom k nejakému miernemu rozdielu medzi generických a taxónu špecifické sondy, delta prahová hodnota delta cyklus (ddCt) sa používa pre označenie hojnosť konkrétneho taxónu v celej populácii baktérií (Ct TSU :. Ct taxónu špecifickú sondu od neznáme vzorky, Ct Buu: Ct bakteriálnej univerzálne sondy z neznámych vzoriek, Ct TSS: Ct taxónu špecifickú sondu od normy plazmidu, Ct BSS: Ct bakteriálne univerzálne sondy od normy plazmidu)}

Teoreticky, množstvo taxónu je 2 ^-ddCt.

Streptococcus
Pestovanie

Získali sme 32 ďalších biopsie z 16 pacientov, u bakteriálne kultúra. Biopsie boli uvedené vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS, pH = 7,2) a rezanie na menšie kúsky skalpelom. Vzorky sa nanesú na doštičky z krvného agaru (CM331, Oxoid, Basingstoke, UK) s 5% konské krvi. Doštičky boli umiestnené do 5% CO _{2 inkubátora pri teplote 37 ° C počas 24 hodín. Kolónie s hemolýzy na krvnom agare boli vybrané pre 16S rRNA sekvenovania.}

biopsia umývanie

Na umývanie biopsie testu boli zhromaždené 14 ďalšími vzorkami z oboch antrálnej pacientov s gastritídou a normálnymi ľuďmi. Každá vzorka bol umiestnený do 2,0 ml skúmavky a premyté 3-krát 200 ul PBS (pre každé premytie) za viac drsných podmienkach. Prvé premytie bolo vykonané opatrným ručným trepaním. Supernatant bol prenesený von. Nový PBS bol pridaný do biopsia pre ďalšie pranie. Pre druhý a tretí premytí boli skúmavky víri do trubice zmiešavača tria TM-2F (All-lab vedeckej, AU) na stupne 3 a 6 výkonu v danom poradí, čo zhruba zodpovedá jemné a intenzívne vírenie. Potom duplex real-time PCR bola vykonaná za účelom testovania celkovej baktérie a Streptococcus
množstvo v supernatante PBS z troch premývacích krokov a premytých biopsiou.

Štatistiky analýza

Test chi-square Pearsonovho bol použitý k porovnaniu počty klonov rôznych taxónov medzi rôznymi vzorových skupín (NMA: normálna Antrum, NMB: normálne telo, AGA: antrálnej gastritída Antrum, AGB: antrálnej gastritída tela) z výsledku 16S rRNA sekvenovania, keď je počet klonov pre každú vzorku skupine bol aspoň 10 ANOVA test bol použitý pre porovnanie bakteriálnych údaje o frekvencii od qPCR testy. Všetky analýzy boli vykonané pomocou SPSS pre Windows verzie 11.5 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). P menšia ako 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú. Pre porovnanie druhové bohatstvo medzi normálnymi a antrálnej pacientov s gastritídou, skutočný počet phylotype pre každého pacienta bol počítaný ako prvý. Nepárový t-test bol potom slúži na porovnanie dvoch skupín pacientov.

Podporné informácie
Obrázok S1.
Podrobný taxón strom
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s001
(2,00MB TIF)
Obrázok S2.
Druhová bohatosť odhad
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s002
(0,97megabajt TIF)
Obrázok S3.
Korelácia medzi qPCR a 16S rRNA klonovanie a sekvenovanie
DOI: 10,1371 /journal.pone.0007985.s003
(0,98 mb TIF)
obr S4.
Nedostatok korelácia medzi vekom pacienta a Firmicutes alebo Streptococcus hojnosti
DOI: 10,1371 /journal.pone.0007985.s004
(2,01 MB TIF)
obr S5.
Harsh pranie neodstraňuje baktérie z biopsiou
DOI: 10,1371 /journal.pone.0007985.s005
(1,90 MB. TIF)
tabuľke S1.
Novel phyltoypes
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s006
(0,03 MB XLS)
tabuľka S2.
Druhová bohatosť odhad v rôznych vzorkách biopsia
DOI: 10,1371 /journal.pone.0007985.s007
(XLS 0,02 MB)
Tabuľka S3.
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s008
(0,02 MB. XLS)

• Ploche ONE: Enhanced M1 makrofágov polarizácie Human Helicobacter pylori spojených s atrofickú gastritídou a u očkovaných myší
• Ploche ONE: isocitrátdehydrogenáza Helicobacter pylori Potenciálne indukuje humorálna imunitná odpoveď u pacientov s žalúdočný vred choroby a gastritídy