PLoS ONE: Бактериальный Микробиота профилирование в Гастрит без инфекции Helicobacter пилори или нестероидные противовоспалительный лекарственный препарат Use

Абстрактный
<р> Последние 16S рибосомальной РНК гена (рРНК) молекулярного профилирования слизистой оболочки желудка показали удивительную сложность микрофлора. хеликобактерной
инфекцией и нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) являются двумя основными факторами к гастриту и язвенной болезни. Тем не менее, мало известно о связи между другими членами микрофлорой желудка и желудочных заболеваний. В этом исследовании, клонирования и секвенирования 16S рРНК использовали для профилирования микрофлору желудка от нормальных и гастрит пациентов. Были определены Сто тридцать три из восьми филотипов бактериальной фил. Микробиота желудок был найден, чтобы быть близко приклеивают к слизистой оболочке. Одиннадцать Streptococcus
филотипов были успешно культивируется из биопсий. От одного до двух родов составляли большинство клонов в рамках любого из выявленных фил. Кроме того, мы разработали два в режиме реального времени количественный ПЦР-анализ для количественного определения относительного содержания филюмом Firmicutes и Streptococcus
род. Значительно выше обилие филюмом Firmicutes и наблюдалась Streptococcus
род в филюма Firmicutes у больных с антральный гастрит, по сравнению с нормальным контролем. Это исследование показывает, что уровень рода таксон может в значительной степени представляют собой гораздо более высокие таксоны, такие как фила. Клиническая значимость и механизм, лежащий в основе измененного состава микробиоты в гастрита требуют дальнейших исследований функциональных
<р> Образец цитирования:. Ли XX, Вонг GL-Н, К. Ф., Вонг VW-S, Lai LH, Chow DK-L, и другие. (2009) Бактериальные Микробиота профилирование в Гастрит без хеликобактерной
инфекции или Non-нестероидными противовоспалительными наркопотребления. PLoS ONE 4 (11): e7985. DOI: 10.1371 /journal.pone.0007985
<р> Редактор: Нияз Ахмед, Университет Хайдарабад, Индия
<р> Поступило: 4 июня 2009 года; Принято 27 октября 2009 года; Опубликовано: 24 ноября, 2009
<р> Copyright: © 2009 Li и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа поддерживается китайским университетом Гонконга. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> комменсальных микрофлора является неотъемлемой частью человеческого существа [1]. Подавляющее большинство микробов обитает наш желудочно-кишечного тракта, с более чем 800 видов из девяти бактерий и архей одного фил. Эта разнообразная микрофлора способствует созреванию кишки [2], [3], [4], хозяин питания и устойчивость к патоген [5]. Микробы также непосредственно взаимодействовать с человеческим хозяином путем регуляции кишечной пролиферации эпителиальной, накопление жира и воспалительных реакций [3], [6], [7]. В то время как некоторые микробы могут в одиночку вызвать серьезное заболевание, многие хронические заболевания, вероятно, из-за возмущений общего микробиоты. Например, аллергии и астмы связаны с использованием детской антибиотиком, которые нарушают кишечную микрофлору [8]. Другие условия, связанные с кишечной микрофлорой включают поздним началом аутизм [9], воспалительное заболевание кишечника [10] и рак [11].
<Р> Традиционно, методы выращивания на основе используются для получения микробных изолятов для дальнейшей характеристики. Такие исследования послужили основой нашего понимания микробиологии. Тем не менее, культивирование часто трудоемкий и может потерпеть неудачу в течение многих микробов. Микроскопическое наблюдение также используется для оценки численности микробов, и в ограниченной степени, присваивает микробам таксонов [12]. Недавно 16S рибосомальной РНК гена (рРНК) профили последовательности используются для выяснения микробное разнообразие, часто до уровня phylotype. были изучены с помощью 16S рРНК последовательности, микробы изо рта [13], [14], пищевод [15], желудка [16], тонкой кишки [17], толстой кишки [18], [19] и влагалища [20]. Эти исследования исследовали микробное разнообразие в человеческом теле и показал огромное население неразвитых и охарактеризованных микробов, которые были неуловимы для методов выращивания на основе. Благодаря этим с высокой пропускной способностью 16S рРНК последовательности и другие метагеномных усилия секвенирования, были найдены микробиота возмущения, которые будут связаны с периодонтальной болезнью [21] и ожирения [22], [23], [24].
<Р> В желудке , кислотность желудка убивает многих микробов заглатывании. Было принято считать, что желудок не является обитаемой любым микробом до открытия хеликобактерной
и его связь с гастритом и язвенной болезни [25]. Кроме нескольких других HELICOBACTER
видов [26], [27], [28], он не ожидал, что желудок будет содержать много других живых микробов. Снижение кислотности из-за прогрессивной атрофический гастрит может увеличить микробное разнообразие [29]. Исследование, проведенное Monstein и др.
С помощью электрофореза временного градиента температуры геля (TTGE) и мелкомасштабные 16S рРНК секвенирование предложили другие микробы, такие как Enterococcus
, Pseudomonas
, Streptococcus
, Staphylococcus
и Stomatococcus
также присутствовали в желудке [30]. Более недавний крупномасштабные 16S рРНК последовательности усилий идентифицировали 128 филотипов с 8 фил в 23 североамериканских пациентов [16]. Интересно отметить, что наличие H. пилори
в желудке не влияет на общий состав микробиоты на уровне филы.
<р> В этом исследовании мы пошли дальше, чтобы исследовать потенциальные связи между изменениями микрофлора желудка и Непро- H. пилори
и не НПВС (NHNN) гастрит. Мы предположили, что при H. пилори
нет, другие бактериальные группы /виды могут способствовать или быть связаны с развитием гастрита. На уровне микробиоты, мы также хотели бы обратиться ключевой вопрос в поле: на какой глубине Таксон (ов) делает микробиоты появляются относительно стабильными таким образом, что возмущения на этих уровнях может иметь отношение к здоровью человека? Мы использовали ген клонирования и секвенирования 16S рРНК для профилирования микрофлору желудка от нормального и NHNN гастрит пациентов, а также таксон-специфичные в реальном масштабе времени количественной ПЦР (КПЦР) анализы для количественного определения относительного содержания филюмом Firmicutes и Streptococcus <бр> род.

Результаты

Таксон дерево анализ
<р> Мы проанализировали оба тела и антрального биопсии из 5 здоровых людей и 5 NHNN антральный гастрит лиц (всех женщин, соответствующего возраста) , Все пациенты были H. пилори
отрицательным по быстрым тестом на мочевину и 16S рРНК последовательности. Ни один из пациентов не принимали НПВС в течение 6 месяцев до прохождения эндоскопии. По крайней мере 60 клонов из каждой биопсии (тела или антрального, таким образом, не менее 120 клонов от каждого индивидуума) секвенировали с использованием широкого диапазона продуктов 16S рРНК ПЦР. В общей сложности 1223 не- H. были получены Pylori
микробные последовательности. Эти микробы принадлежат к 8 фил (133 филотипов), из которых 5 фил (Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteia, Fusobacteria и Proteobacteria) присутствуют в подавляющем большинстве (1211 из 1223, или 99,0%). Были определены девять филотипов с сходства последовательностей меньше, чем 97% до последовательностей, присутствующих в общедоступных базах данных. Шесть из этих 9 филотипов были представлены единичными клонов (Дополнительный Таблица S1).
<Р> Чтобы исследовать общее представление различных уровней таксонов в биоте желудка, мы построили таксон дерево (рисунок 1 и дополнительный рис S1). Интересно, что каждая фила преобладал только один или два нижних уровней таксонов (класс, порядок, семьи или рода). По сути, каждый филюм преобладали только 1-2 родов. Например, самый распространенный Филюм Firmicutes представляли 383 клонов, из тех 333 клонов из класса Bacilli. Впоследствии 273 клоны от порядка Lactobacillales. Двести пятьдесят четыре клонов из семейства Streptococcaceae. И все 254 клонов были из рода Streptococcus
. Пять наиболее распространенных родов, включая Streptococcus
(254 клонов), Prevotella
(243), Neisseria
(175), Haemophilus
(122) , Porphyromonas
(68), составила 70,5% от всех микробных клонов.

Видовое богатство и разнообразие
<р> Когда был использован весь набор данных (1223 клонов), охват Гуда был 96%, что указывает, что четыре дополнительных филотипов можно было бы ожидать на каждые 100 дополнительных клонов для секвенирования. Этот уровень покрытия показал, что большинство бактериальных последовательностей присутствовали в секвенированных клонов. оценка разнообразия сметами версии 8.0 показал, что около 200 филотипов может присутствовать в образцах человеческой биопсии желудка (Дополнительный рисунок S2). Кроме того, мы оценили видового богатства в четырех различных образцах биопсии (NMA (Normal Антрум), NmB (Normal Body), AGA (антральный гастрит антрального), AGB (антральный гастрит тела); Дополнительный Таблица S2). Видовое богатство не отличалась между антральный гастрит биопсий и нормальных биопсий (р > 0,1, непарный т-тест)

Бактериальный сравнения микрофлора между двумя различными анатомических локализаций (антрума и тела) у нормальных пациентов
<. р> В нормальных пациентов не наблюдалось никаких существенных различий между двумя анатомических локализаций (антрума и тела) для любого из таксонов групп, для семейства Prevotellaceae и рода Prevotella
где значения р (хи-Пирсона, за исключением -Square тест) были в пределах от 0,01 до 0,05 (рисунок 1).

Firmicutes фила и Streptococcus
род обогащались в желудке антральных больных гастрит
<р> на основании 1223 16S рРНК последовательности, филюмом Firmicutes был самым распространенным фила с 383 клонов. Филюм Proteobacteria был близким вторым с 345 клонов. Интересно отметить, что филюм Firmicutes был более обильным в антрального гастрита биопсий, чем в обычных биопсий (41% против 22%, таблица 1), в то время как филюм Proteobacteria был более обильным в нормальных биопсий (37% против 20%). Так как 16S рРНК секвенирование стоимость слишком высока для большего размера выборки, мы разработали ПЦР (КПЦР) подход количественного в реальном масштабе времени таксон-специфичные для количественного определения численности Firmicutes и Streptococcus
(Рисунок 2). Таксон-специфические данные КПЦР для Firmicutes сильно коррелировали с данными секвенирования 16S рРНК для вышеупомянутых 20 образцов биопсии (2 биопсию для каждого из 5 нормальных и 5 больных антральный гастрит) (Дополнительный рисунок S3).
<Р> Семнадцать дополнительные пары антральном и биопсии тела образцы от нормальных пациентов и 18 дополнительных пар антральном и биопсии тела образцов из антральных больных гастритом анализировали с помощью Firmicutes-специфической кПЦР. В целом, 90 биопсий (46 образцов от пациентов гастрита 23 антральных и 44 образцов из 22 нормальных пациентов) были проанализированы (таблица 2). Средний возраст больных антрального гастрита 67,6 ± 11,4 (медиана: 69, диапазон: от 46 до 86), в то время как средний возраст контрольной 58,3 ± 14,7 (медиана: 52, диапазон: от 40 до 87). Средний возраст нормальной группе был моложе, чем у антральном гастрите группы. Но статистический анализ показал, что не было никакой корреляции между возрастом и Firmicutes или Streptococcus
обилие (р > 0,1) (Дополнительный рисунок S4). Эти образцы были разделены на 4 группы, антральный гастрит антрума (AGA), антральный гастрит тела (AGB), нормальный Антрум (НМА), и нормальный тела (NmB). Обилие Firmicutes был в AGA значительно выше, чем в НМА или NmB (односторонний ANOVA (дисперсионный анализ) тест, р = 0,004 и р = 0,046, соответственно) и в AGB, чем в НМА (в одну сторону ANOVA, p = 0,039 ) (фиг.3А). Никаких существенных различий не наблюдалось между AGA и AGB (в одну сторону ANOVA, р = 0,855), или НМА и NmB (р = 0,832).
<Р> Для тех же образцов биопсии, род Streptococcus
также анализировали с помощью Streptococcus
Определённые кПЦР. Streptococcus
изобилие было 72% и 76% выше в сравнении AGA NMA или NmB, соответственно, и 66% и 70% выше в сравнении с АГБ NMA или NmB, соответственно (рис 3б). Р- значения для теста ANOVA показаны на фигуре 3В. По аналогии с анализом Firmicutes, не наблюдалось существенной разницы между AGA и AGB (в одну сторону ANOVA, р = 0,999), или НМА и NmB (р = 0,999).

Streptococcus
выращивание и биопсия стиральная
<р> само по себе обнаружение последовательностей генов 16S рРНК не означает, что живые бактерии присутствуют или бактерии действительно являются резидентами вместо прохожим в желудке. Таким образом, мы провели два дополнительных экспериментов.
<р> Во-первых, мы попытались культивирование бактерий из биопсий. Условием культуры подходит для Streptococcus
была использована, так как они оказались чрезмерно представлены в антральных больных гастритом. Шестнадцать пар (антрума и тела) биопсий были использованы для культивирования на чашках с кровяным агаром. Колонии были секвенированы для гена 16S рРНК для идентификации. Одиннадцать филотипов из Streptococcus
были изолированы (Дополнительная таблица S3). Эти 11 филотипов составляли 93,3% (или 237 из 254 клонов) всех клонов, идентифицированных в широкой диапазон 16S рРНК последовательности, указывая, что большинство Streptococcus
филотипов живы, в желудочном биопсий.
<р> во-вторых, 14 образцов биопсии из обоих антрального гастрита и нормальных пациентов были промыты в фосфатном буферном растворе (PBS) с тремя все более и более жестких условиях. Если жесткие условия стирки не удаляют бактерии из биопсии, это наводит на мысль, что эти бактерии придают близко к слизистой оболочке желудка. Более 90% от общего количества бактерий оставались прикреплены к биопсий после трех последовательных промывок все более суровых условиях (Дополнительный рисунок S5A). Последний этап промывки был сделан на высокой мощности на рабочем столе вихревой машины. Аналогичным образом, большинство из Streptococcus
бактерии остались прикреплены к биопсий после стадий 3 стирки (Дополнительный рисунок S5B).

Обсуждение
<р> В этом исследовании мы профилированного бактериальная микрофлора в спаренных желудочных биопсий (антрума и тела) от нормальных и антральных больных гастритом. Все пациенты H. пилори
отрицательный и без использования НПВС. Благодаря широким диапазоном 16S рРНК секвенирование гена мы идентифицировали 1,223 не- H пилорусов
бактерии клоны, похожее на предыдущее исследование (исследование БИК, 1056 не- H пилори
бактерии клоны) [16 ]. Хотя эти два исследования проанализировали два географически (Гонконг против Калифорнии) и этнически (китайский против Кавказа, выходцев из Латинской Америки и афро-американцев) расходящихся населения, общие микробиота сложности удивительно похожи (таблица 3). Оба исследования идентифицировали около 130 (133 и 127 для этого и исследование Бик, соответственно) филотипов от семи до восьми фил. были поделены Большинство клонов (77,4% этого исследования и 79,8% обучения БИК). Два наиболее распространенных родов ( Streptococcus
и Prevotella
) также были идентичны. Эти два рода представлены 40,6% и 41,5% всех клонов в этом исследовании и изучении Бик. Оба исследования показали, что около 200 различных филотипов может присутствовать в слизистой оболочке желудка. Такое драматическое сходство между двумя исследованиями подчеркивает селективное давление для микробиоты в суровых условиях желудка. Кроме того, мы нашли небольшое различие в бактериальной микрофлорой между двумя анатомических участков (Антрум и тела) у нормальных пациентов, несмотря на клиническую значимость для взятия проб биопсии при различных анатомических участков [31].
<Р> Учитывая, что строгие стадии промывки не смогли отделить микробиоты от биопсий, мы предполагаем, что большинство из выявленных бактерий связаны плотно со слизистой оболочкой желудка. Кроме того, мы смогли вырастить большинство из Streptococcus
филотипов идентифицированы с помощью широкого диапазона 16S рРНК последовательности, предполагая, что эти бактерии действительно могут быть истинными жителями в слизистой оболочке желудка.
<Р> Чтобы дополнительно принимать во внимание общая сложность желудка микрофлорой, мы построили дерево таксонов на основе выявленных клонов смотреть на каждый уровень таксонов, включая филюм, класс, порядок, семьи и рода. Интересно, что мы обнаружили, что для каждой филы, один или два рода были преимущественно присутствуют. Пять наиболее распространенных родов, включая Streptococcus
(фила Firmicutes), Prevotella
и Porphyromonas
(Bacteroidetes), а также Neisseria
и Haemophilus
(Proteobacteria), составила 70,5% от всех микробных клонов.
<р> Интересно, что профилирование 16S рРНК показал значительное перепредставленности филюмом Firmicutes (в первую очередь из-за чрезмерной представлением Streptococcus
род в филюма) и недостаточное представительство филюмом протеобактерий в биопсий из антрального больных гастритом. Мы разработали таксон-специфический КПЦР подход к анализу изобилие Firmicutes и стрептококком
таксоны 90 биопсий (46 образцов из 23 антральных больных гастритом и 44 образцов из 22 нормальных пациентов) и подтвердили перепредставленности эти два таксона в антральном гастрите желудка на 42% и 71%, соответственно. Большая часть Streptococcus
филотипов идентифицированы с помощью секвенирования были альфа-гемолитические бактерии, которые являются потенциальными патогены (например, пневмококк
, Streptococcus тШз
и Streptococcus salivarius <бр>). Некоторые Streptococcus
видов устойчивы к воздействию низких значениях рН и может выжить в желудке [32]. Наши данные выращивания и промывки эксперимент также предположил, что они были на самом деле живой, житель биоту в желудке.
<Р> ли увеличение Streptococcus
изобилие причинным для антрального гастрита или в результате локального изменения окружающей среды в связи с антральный гастрит остались без ответа. Один из возможных подходов является использование свободной от бактерий моделью мыши [33]. Еще один интересный вопрос в том, что ли защитить определенные микробиоты композиции, или в качестве альтернативы, сенсибилизировать слизистую оболочку желудка от вторжения патогенных микроорганизмов, таких, как H. пилори
. И, наконец, новые технологии секвенирования высокой пропускной способности могут обеспечить более полные данные о микробиоты из разных анатомических местах вдоль пищеварительного тракта человека и в различные моменты времени [34].

Материалы и методы

Желудочные образцы биопсии
<р> Это исследование было одобрено китайским университетом Гонконга клинического исследования комитета по этике. Все пациенты дали письменное информированное согласие на получение образцов исследования. Два слизистой оболочки желудка биопсии (Антрум и тела желудка) были собраны у каждого пациента во время обычной эндоскопии в госпиталь Принца Уэльского, Гонконг. Для того, чтобы избежать загрязнения, новый стерилизованные эндоскопии щипцов использовали при приеме второй биопсии из того же пациента. Биопсии были быстро замораживали на сухом льду и хранили при -80 ° С. Пациенты, принимающие антибиотики или НПВС (определяется как любое использование НПВС в течение по крайней мере одну неделю в течение последних 3-х месяцев до эндоскопии) или дали положительный результат на H. пилори
быстрым тестом на мочевину (БУТ) или гистологического испытания были исключены. демография пациентов показано в таблице 2.

Строительство библиотек клонов 16S рРНК и секвенирование

Общую геномную ДНК выделяли из биопсий с помощью ДНК Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA ) со стеклом избили методом колотушки, как описано ранее [16]. Два отрицательных контролей только с стерильной водой были также извлечены с использованием того же самого протокола. Извлеченные концентрации ДНК измеряли NanoDrop 1000 Спектрофотометр (Thermo Scientific, Миннеаполис, штат Миннесота, США). Два универсальных бактериальных 16S рРНК праймеры, B8F20 [35] (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') и B806R20 [36] (5'- GGACTACCAGGGTATCTAAT-3') были использованы для амплификации области, соответствующей позиции 8 до 806 кишечной палочки
гена 16S рРНК. В 25 мкл ПЦР-смеси включали 1 × ПЦР-буфер, в том числе 1,5 мМ MgCl <суб> 2 (Qiagen), 20 мМ хлорида тетраметиламмония, 0,1 мМ каждого дНТФ, 0,4 мкМ каждого праймера, 1 единица HotStar Taq ДНК-полимеразы (Qiagen), и 2 мкл экстрагируют ДНК. Тридцать цикл ПЦР проводили для амплификации фрагмента длиной 799 пар оснований. Продукты ПЦР проверяли с помощью электрофореза в агарозном геле. Для каждого продукта, одна полоса может наблюдаться в УФ-свете, в то время как ни одна группа не была замечена для отрицательных контролей. Продукты 16S рРНК были очищены с Сефадексом G-50 колонку (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США), сшили с Т векторами и преобразованной в E. палочки
клетки JM109 с помощью простой системы вектор pGEM-T (Promega, Madison, WI, USA). Мы выбрали 5 пациентов (10 образцов биопсии) с антрального гастрита и 5 нормальных управления (10 образцов биопсии) построить 20 16S библиотек генов рРНК. Для каждой библиотеки биопсии желудка, по крайней мере 60 колоний были выбраны для секвенирования. ПЦР-продукты секвенировали с использованием BigDye терминатор v3.1 цикла секвенирования набора (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Реакции секвенирования использованием B8F20 в качестве праймера секвенирования проводили на 3730xl секвенсор ABI (Applied Biosystems)

филогенетический анализ и микробное разнообразие оценка
<р> Химерная тест с использованием сервера Беллерофонт (HTTP.: //foo.maths.uq.edu.au/~huber/bellerophon.pl) [37] был использован для тестирования потенциальных химерных последовательностей. Один клон, было обнаружено, что химерный и впоследствии исключены. Затем 1223 nonchimeric последовательности были проанализированы с помощью RDP II (Рибосомальная База данных Проект II) классификатор (http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp) на основе наивного байесовского классификатора рРНК [38]. Базовый локальный поисковый инструмент выравнивания (BLAST) при условии, зелеными Гены (http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-blast_interface.cgi) проводили, чтобы найти наиболее сходные последовательности в базе данных. Мы использовали 97% идентичности последовательности в качестве среза для определения филотипов [39]. Последовательности с идентичностью и ЛТ; 97% к существующим последовательностей в базе данных были рассмотрены роман. Дерево таксон был построен с использованием результата классификации классификатора РПД II. Chao1 оценка сметное 8 программы (http://viceroy.eeb.uconn.edu/estimates~~HEAD=pobj) была использована для оценки микробного разнообразия. Метод Гуда был использован для расчета охвата секвенирования [40].

в режиме реального времени количественной ПЦР (КПЦР)
<р> Q-PCR праймеры и зонды были сконструированы на основе последовательностей, полученных из клонированных библиотек. Сначала мы выровнены все клонированные последовательности от ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) с параметрами по умолчанию. Праймеры были КПЦР B8F20 и B801R21 (5'- ACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3 '). Последовательности MGB зонда являются: общий зонд (ВИК) 5'- CAGCAGCCGCGGTAA-3 ', Firmicutes зонд (FAM) 5'- AAGATTCCCTACTGCTGCCT-3' и Streptococcus
зонд (FAM) 5'- TACACATGGAATTCCAC-3 ' , Для измерения обилия конкретного таксона, два датчика (один для конкретных таксонов интерес и второй общие для всех бактерий), были использованы в том же ПЦР ампликона. (Фигура 2). Смесь 25 мкл ПЦР включен 1 × буфер А, 3,5 мМ MgCl <суб> 2, 200 мкМ дНТФ с дУТФ вместо дТТФ, 400 нМ каждого праймера, 100 нМ каждого зонда, 0,01 ед /мкл урацил-N-гликозилаз, и 0,05 ед /мкл TaqGold (Applied Biosystems). Для Firmicutes-специфического анализа, условие циклинг: 1) 50 ° С в течение 2 мин; 2) 95 ° С в течение 10 мин; 3) 40 циклов при 95 ° С в течение 20 сек, 58 ° C в течение 15 сек, 70 ° C в течение 80 сек. Для <ЕМ> Streptococcus
-специфический анализ, состояние езда на велосипеде была: 1) 50 ° С в течение 2 мин; 2) 95 ° С в течение 10 мин; 3) 40 циклов при 95 ° С в течение 20 сек, 57 ° С в течение 1 мин, 70 ° С в течение 1 мин. Streptococcus
16S рРНК фрагмент (DQ346438) клонировали в векторе pGEM легкий-T был использован в качестве стандарта для кПЦР (как для Firmicutes и Streptococcus
анализов) в ABI 7500 реального -time система ПЦР (Applied Biosystems). Из-за какой-то небольшой разницей между родовым и таксон-специфичные зонды, порог дельта дельта цикла (DDCT) был использован для обозначения обилия конкретного таксона во всей популяции бактерий (Ct <суб> ТСУ:. Ct таксона специфического зонда от неизвестные образцы, Ct <суб> BUU: Ct бактериального универсального зонда от неизвестных образцов, Ct <суб> TSS: Ct таксона специфического зонда от стандартной плазмиды, Ct <суб> BSS: Ct бактериального универсального зонда от стандартной плазмиды)
<р> Теоретически, обилие таксона 2 ^-ddCt.

Streptococcus
Культивирование
<р> Мы получили 32 дополнительных биопсий из 16 пациентов, бактериальная культура. Биопсии были помещены в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS, рН = 7,2) и разрезают на более мелкие куски скальпелем. Затем образцы были распространены на чашках с кровяным агаром (CM331, Oxoid, Basingstoke, Великобритания) с 5% лошадиной крови. Планшеты помещали в 5% CO <суб> 2 инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 24 часов. Колонии с гемолиз на кровяном агаре были выбраны для 16S рРНК последовательности.

Биопсия стиральная
<р> Для стирки биопсии теста, были собраны 14 дополнительных образцов из обоих антральных больных гастритом и нормальных людей. Каждый образец помещали в пробирку 2,0 мл и промывали 3 раза (200 мкл PBS для каждой промывки) при все более и более жестких условиях. Первая промывка была сделана путем осторожного встр хивают вручную. Супернатант переносили из. Новый PBS, добавляли в биоптатах для дополнительной промывки. Для второй и третьей промывки, пробирки встряхивали в смесительную трубу Trio ТМ-2F (All-лаборатория научной, АС) в 3 классе и 6 класс уровня мощности соответственно, что примерно соответствует нежным и энергичного встряхивания. Тогда дуплекса ПЦР в реальном времени проводили, чтобы проверить общее количество бактерий и Streptococcus
количествах в супернатантах PBS из трех стадий промывки и промывочный биопсий.

Анализ статистики
<р> критерий хи-квадрат Пирсона был использован для сравнения числа клонов разных таксонов между различными группами проб (NMA: нормальный Антрум, NmB: нормальный корпус, AGA: антральный гастрит антрума, AGB: антральный гастрит тела) из результата секвенирования 16S рРНК, когда число клонов для каждой группы образцов, по крайней мере 10. тест ANOVA использовали для сравнения бактериальные данные о содержании из КПЦР анализов. Все анализы проводились с использованием программы SPSS для окон, версии 11.5 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Р &л; 0,05 рассматривалось как статистически значимое. Для сравнения видового богатства между нормальными и антральных больных гастритом, подсчитывали сначала фактическое количество phylotype для каждого пациента. Непарное Т-тест затем использовали для сравнения двух групп пациентов.

Поддержка информации Рисунок S1 изображения.
Подробное дерево таксон
DOI: 10.1371 /journal.pone.0007985.s001
(2.00 MB TIF) Рисунок S2
.
Видовое богатство оценка
DOI: 10.1371 /journal.pone.0007985.s002
(0.97 MB TIF) Рисунок S3
.
Корреляция между КПЦР и 16S рРНК клонирования и секвенирования
DOI: 10.1371 /journal.pone.0007985.s003
(0.98 MB TIF) Рисунок S4
.
Отсутствие корреляции между возрастом пациента и Firmicutes или Streptococcus обилие
DOI: 10.1371 /journal.pone.0007985.s004
(2.01 MB TIF) Рисунок S5
.
Суровые мойка не удаляет бактерии из биопсий
DOI: 10.1371 /journal.pone.0007985.s005
(1.90 MB TIF)
таблице S1.
Роман phyltoypes
DOI: 10.1371 /journal.pone.0007985.s006
(0.03 MB) XLS
Таблица S2.
Богатство видов оценки в различных образцах биопсии
DOI: 10.1371 /journal.pone.0007985.s007
(0.02 MB) XLS
Таблица S3.
DOI: 10.1371 /journal.pone.0007985.s008
(0,02 MB XLS)

• PLoS ONE: Enhanced M1 макрофагальной Поляризация в Human хеликобактерной-Associated атрофический гастрит и в вакцинированных…
• PLoS ONE: изоцитратдегидрогеназа хеликобактерной инфекции Потенциально Индуцирует гуморального иммунного отве…