PLoS ONE: Bakterielle Mikrobiota Profilierungs Gastritis ohne Helicobacter-pylori-Infektion oder Nicht-steroidale Antirheumatikum Use

Abstrakt

Neue 16S ribosomale RNA-Gen (rRNA) molekulare Profilierung der Magenschleimhaut zeigte eine überraschende Komplexität der Mikrobiota. Helicobacter pylori
Infektion und nicht-steroidale Antirheumatikum (NSAID) Verwendung sind zwei Hauptursachen für Gastritis und Magengeschwüren. Es ist jedoch wenig über den Zusammenhang zwischen anderen Mitgliedern des Magens Mikrobiota und Magenerkrankungen bekannt. In dieser Studie, Klonierung und Sequenzierung der 16S-rRNA verwendet wurde, um den Magen microbiota von normalen und Gastritis Patienten zum Profil. Hundert und dreiunddreißig Phylotypen von acht Bakterienstämme identifiziert wurden. Der Magen wurde gefunden microbiota eng an der Schleimhaut anhaftet. Elf Streptococcus
Phylotypen wurden aus den Biopsien erfolgreich kultiviert. Ein bis zwei Gattungen vertreten eine Mehrheit der Klone innerhalb jeder der identifizierten Stämme. Wir zwei weitere quantitative Echtzeit-PCR-Assays entwickelt, um die relative Häufigkeit der Firmicutes phylum und die Streptococcus
Gattung zu quantifizieren. Deutlich höhere Fülle der Firmicutes phylum und die Streptococcus
Gattung innerhalb der Firmicutes phylum bei Patienten mit Antrumgastritis beobachtet wurde, im Vergleich zu normalen Kontrollen. Diese Studie legt nahe, dass die Gattung Taxon Ebene weitgehend viel höhere Taxa wie die phylum darstellen kann. Die klinische Relevanz und der Mechanismus die veränderte Mikrobiota Zusammensetzung in Gastritis erfordern weitere funktionelle Studien zugrunde liegenden

Citation:. Li XX, Wong GL-H, KF, Wong VW-S, Lai LH, Chow DK-L, et al. (2009) Bacterial Mikrobiota Profilierungs Gastritis ohne Helicobacter pylori
Infektion oder Nicht-steroidale entzündungshemmende Drogenkonsum. PLoS ONE 4 (11): e7985. doi: 10.1371 /journal.pone.0007985

Editor: Niyaz Ahmed, University of Hyderabad, Indien

Empfangen: 4. Juni 2009; Akzeptiert: 27. Oktober 2009; Veröffentlicht: 24. November 2009

© 2009 Li et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wird von der Chinese University of Hong Kong unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Commensal microbiota ist ein integraler Bestandteil eines Menschen [1]. Die überwiegende Mehrheit von Mikroben bewohnen unserer Gastrointestinaltraktes, mit mehr als 800 Arten von neun Bakterien und Archaea einem phyla. Diese vielfältige Mikrobiota trägt Reifung zu gut [2], [3], [4], Wirt Ernährung und Pathogen-Resistenz [5]. Microbes interagieren auch direkt mit menschlichen Wirt durch Darmepithel-Proliferation, die Fettspeicherung und Entzündungsreaktionen [3] regeln, [6], [7]. Während einige Mikroben können im Alleingang zu schweren Krankheiten führen, sind viele chronische Erkrankungen auf Störungen des gesamten Mikrobiota wahrscheinlich. Zum Beispiel sind Allergien und Asthma in die Kindheit den Einsatz von Antibiotika verbunden, die Darmflora verändern können [8]. Andere Bedingungen im Zusammenhang mit Darmmikrobiota umfassen late-onset Autismus [9], entzündliche Darmerkrankung [10] und Krebs [11].

Traditionell Anbau basierte Verfahren verwendet mikrobiellen Isolaten zu erhalten für die weitere Charakterisierung. Solche Untersuchungen bildeten die Grundlage unseres Verständnisses der Mikrobiologie. Allerdings Anbau ist oft arbeitsintensiv und kann für viele Mikroben scheitern. Mikroskopische Beobachtung wird auch zu schätzen Fülle von Mikroben und in einem begrenzten Ausmaß, zuordnet Mikroben Taxa [12] verwendet. Vor kurzem 16S ribosomalen RNA-Gen (rRNA) -Sequenz Profile werden verwendet, mikrobielle Diversität zu erläutern, oft zum phylotype Ebene. Mit 16S rRNA-Sequenzierung, Mikroben aus dem Mund [13], [14], der Speiseröhre [15], Magen [16], Dünndarm [17], Kolon [18], [19] und der Vagina [20] untersucht. Diese Studien erforscht mikrobielle Diversität innerhalb des menschlichen Körpers und zeigte eine große Population von unkultivierten und uncharacterized Mikroben, die für den Anbau basierte Methoden schwer zu fassen war. Durch diese Hochdurchsatz-16S-rRNA-Sequenzierung und anderen metagenomic Sequenzierung Bemühungen wurden Mikrobiota Störungen gefunden mit Parodontitis assoziiert zu sein [21] und Adipositas [22], [23], [24].

Im Magen , tötet Magensäure viele eingenommenen Mikroben. Es wurde allgemein angenommen, dass der Magen durch eine Mikrobe bis zur Entdeckung von Helicobacter pylori
und seine Verbindung mit Gastritis und Ulcus pepticum nicht bewohnbare ist [25]. Anders als einige andere Helicobacter
species [26], [27], [28], war es nicht zu erwarten, dass der Magen viele andere lebende Mikroben enthalten würde. Reduzierte Säure durch progressive atrophische Gastritis kann mikrobielle Vielfalt zu erhöhen [29]. Eine Studie von Monstein et al.
Zeitlichen Temperaturgradienten-Gelelektrophorese (TTGE) und einen kleinen 16S-rRNA-Sequenzierung andere Mikroben vorgeschlagen wie Enterococcus
, Pseudo
Streptococcus
, Staphylococcus
und Stomatococcus
auch im Magen vorhanden waren [30]. Eine neuere großen 16S-rRNA-Sequenzierung Aufwand identifiziert 128 Phylotypen von 8 phyla in 23 nordamerikanischen Patienten [16]. Interessanterweise ist die Anwesenheit von H. pylori
im Magen nicht die gesamte Zusammensetzung der Mikrobiota in der phylum Ebene nicht beeinträchtigte.

In dieser Studie gingen wir weitere potentielle Verbindungen zwischen Magen Mikrobiota Veränderungen und Nicht- H zu untersuchen. pylori
und nicht-NSAID (NHNN) Gastritis. Wir vermuten, dass, wenn H. pylori
nicht vorhanden ist, andere Bakteriengruppen /Spezies beitragen kann oder mit Gastritis Entwicklung in Verbindung gebracht werden. Auf der Mikrobiota Ebene, wir würden auch gerne ein zentrales Thema in Angriff zu nehmen: zu welchem ​​Taxon Tiefe (n) hat die Mikrobiota relativ stabil erscheinen, so dass Störungen auf diesen Ebenen für die menschliche Gesundheit relevant sein können? Wir verwendeten 16S rRNA-Gen-Klonierung und Sequenzierung des Magens Mikrobiota von normalen zu profilieren und NHNN Gastritis-Patienten und taxonspezifische quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) Assays, die die relative Häufigkeit der Firmicutes phylum und der Streptococcus zu quantifizieren
Gattung.

Ergebnisse |

Taxon Baumanalyse

Wir analysierten beide Körper und Antrum Biopsien von 5 normalen Individuen und 5 NHNN Antrumgastritis Personen (alle Frauen, altersangepassten) . Alle Patienten waren H. pylori
sowohl durch negative Urease-Schnelltest und 16S rRNA-Sequenzierung. Keiner der Patienten hatte NSAID innerhalb von 6 Monaten vor einer Endoskopie entnommen. Mindestens 60 Klone aus jeder Biopsie (Körper oder Antrum, also mindestens 120 Klone aus jedem einzelnen) wurden auf breiter Bereich 16S-rRNA-PCR-Produkte sequenziert. Insgesamt 1223 nicht H. pylori
mikrobiellen Sequenzen wurden erhalten. Diese Mikroben gehören zu 8 phyla (133 Phylotypen), davon 5 phyla (Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteia, Fusobakterien und Proteo) vorhanden sind, in einer großen Mehrheit (1.211 von 1.223 oder 99,0%). Neun Phylotypen mit Sequenzähnlichkeit weniger als 97% auf Sequenzen, die in den öffentlichen Datenbanken identifiziert. Sechs dieser neun Phylotypen wurden durch einzelne Klone (Supplementary Tabelle S1) dargestellt.

die allgemeine Darstellung verschiedener Taxon Ebenen im Magen Biota Um zu untersuchen, konstruierten wir ein Taxon Baum (Abbildung 1 und ergänzende Abbildung S1). Interessanterweise wurde jeder Stamm von nur ein oder zwei niedrigeren Taxons Ebenen (Klasse, Ordnung, Familie oder Gattung) dominiert. Wie Tatsächlich wurde jeder Stamm von nur 1-2 Gattungen dominiert. So wurde beispielsweise die am häufigsten vorkommenden Stamm Firmicutes von 383 Klone vertreten, von denen, 333 Klone aus der Klasse Bacilli sind. Anschließend wurden 273 Klone aus der Ordnung Lactobacillales. Zweihundertfünfzig vier Klone wurden aus der Familie Streptococcaceae. Und alle 254 Klone wurden aus der Gattung Streptococcus
. Die fünf häufigsten Gattungen einschließlich Streptococcus
(254 Klone), Prevotella
(243), Neisseria
(175), Haemophilus
(122) Porphyromonas
(68), 70,5% aller mikrobiellen Klone gebildet.

der Artenreichtum und Vielfalt

Wenn der gesamte Daten-Set (1223 Klone) verwendet wurde, gute Berichterstattung war 96%, was anzeigt, dass vier zusätzliche Phylotypen erwarten wäre für alle 100 zusätzliche Klone sequenziert werden. Dieser Deckungsgrad angegeben, dass die Mehrheit der bakteriellen Sequenzen in den sequenzierten Klonen vorhanden waren. Diversity Schätzung von SCHÄTZUNGEN Version 8.0 angegeben, dass etwa 200 Phylotypen in den menschlichen Magen-Biopsie-Proben vorhanden sein können (Supplementary Abbildung S2). Wir schätzten, weiter den Artenreichtum in vier verschiedenen Biopsieproben (NMA (Normal Antrum) NMB (Normal Body), AGA (Antrumgastritis Antrum) AGB (Antrumgastritis Body); Ergänzende Tabelle S2). Der Artenreichtum war nicht anders zwischen den Antrumgastritis Biopsien und normalen Biopsien (p > 0,1, ungepaarten t-Test)

Bakterielle Mikrobiota Vergleich zwischen zwei verschiedenen anatomischen Stellen (Antrum und Körper) bei normalen Patienten
<. p> In den normalen Patienten, kein signifikanter Unterschied wurde zwischen zwei anatomischen Stellen (Antrum und Körper) für jede der Taxon Gruppen beobachtet, mit Ausnahme der Familie Prevotellaceae und der Gattung Prevotella
wo die p-Werte (Pearson Chi -square-Test) waren zwischen 0,01 bis 0,05 (Abbildung 1).

Firmicutes phylum und Streptococcus
Gattung wurden im Magen von Antrumgastritis Patienten angereichert

Basierend auf der 1223 16S-rRNA-Sequenzen war die Firmicutes phylum die am häufigsten vorkommende Stamm mit 383 Klonen. Die Proteo phylum war ein enger Sekunde mit 345 Klonen. Interessanterweise war die Firmicutes phylum reichlicher in antralen Biopsien Gastritis als in normalen Biopsien (41% vs. 22%, Tabelle 1), während die Proteobacteria phylum reichlicher in normalen Biopsien (37% vs. 20%) war. Da 16S rRNA-Sequenzierung Kosten untragbar für eine größere Stichprobengröße ist, entwickelten wir ein taxonspezifische quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) Ansatz, um die Fülle von Firmicutes zu quantifizieren und Streptococcus
(Abbildung 2). Die taxonspezifische qPCR Daten für Firmicutes wurden stark mit der 16S rRNA Sequenzierungsdaten für die genannten 20 Biopsieproben (2 Biopsien für jede der 5 normal und 5 Antrum-Gastritis Patienten) korrelierten (Supplementary Abbildung S3).

Siebzehn weitere Paare von Antrum und Körper Biopsieproben von normalen Patienten und 18 zusätzliche Paare von Antrum und Körper Biopsieproben von Antrumgastritis Patienten wurden von Firmicutes spezifische qPCR analysiert. Total 90 Biopsien (46 Proben von 23 Patienten und Antrum-Gastritis 44 Proben aus 22 normalen Patienten) untersucht (Tabelle 2). Das mittlere Alter der Antrumgastritis Patienten war 67,6 ± 11,4 (Median: 69, Lage: 46 bis 86), während das Durchschnittsalter der Kontrollen 58,3 ± 14,7 war (Median: 52, Bereich 40 bis 87). Das mittlere Alter der normalen Gruppe war jünger ist als die der Antrumgastritis Gruppe. Aber die statistische Analyse zeigte, dass es keinen Zusammenhang zwischen dem Alter und Firmicutes oder Streptococcus
Hülle und Fülle (p > 0,1) (Supplementary Abbildung S4). Diese Proben wurden in 4 Gruppen eingeteilt, Antrumgastritis Antrum (AGA), Antrumgastritis Körper (AGB), normale Antrum (NMA) und normalen Körper (NMB) mit. Die Fülle von Firmicutes war signifikant höher bei AGA als in NmA oder NmB (One-way ANOVA (Varianzanalyse) Test, p = 0,004 und p = 0,046, respectively) und in AGB als in NmA (Einweg-ANOVA, p = 0,039 ) (3A). Kein signifikanter Unterschied zwischen AGA und AGB (Einweg-ANOVA, p = 0,855) oder NmA und NmB (p = 0,832).

Für die gleiche Biopsieproben, die Gattung Streptococcus
beobachtet wurde auch von Streptococcus
-spezifische qPCR analysiert. Streptococcus
Fülle lag bei 72% bzw. 76% höher bei AGA vs. NmA oder NmB sind, und 66% bzw. 70% höher in AGB vs. NmA oder NmB, bzw. (3B). Die p-Werte für die ANOVA-Tests sind in 3B gezeigt. Ähnlich wie bei der Firmicutes Assay wurde kein signifikanter Unterschied zwischen AGA und AGB (Einweg-ANOVA, p = 0,999) beobachtet, oder NmA und NmB (p = 0,999).

Streptococcus
Anbau und Biopsie Waschen

die bloße Nachweis von 16S rRNA-Gen-Sequenzen bedeutet nicht, dass lebende Bakterien vorhanden sind oder die Bakterien sind in der Tat Bewohner anstelle von Passanten im Magen. Damit haben wir zwei zusätzliche Experimente durchgeführt.

Zuerst versuchten wir die Bakterienanzucht aus den Biopsien. Eine Kulturbedingungen geeignet für Streptococcus
verwendet wurde, da erschienen sie in Antrumgastritis Patienten überrepräsentiert zu sein. Sechzehn Paare (Antrum und Körper) von Biopsien wurden für die Kultur auf den Blutagarplatten verwendet. Kolonien wurden für die 16S-rRNA-Gens zur Identifizierung sequenziert. Elf Phylotypen von Streptococcus
(Supplementary Tabelle S3) isoliert wurden. Diese 11 Phylotypen gebildet 93,3% (oder 237 aus der 254 Klone) aller identifizierten Klone im breiten Bereich 16S-rRNA-Sequenzierung, was darauf hinweist, dass die Mehrheit der Streptococcus
Phylotypen am Leben sind in den Magen-Biopsien.

Zweitens 14 Biopsieproben sowohl aus Antrum-Gastritis und normalen Patienten wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit drei zunehmend harten Bedingungen gewaschen. Wenn harte Waschbedingungen nicht die Bakterien aus der Biopsie zu entfernen, ist es sinnvoll, dass diese Bakterien in engem Zusammenhang mit der Magenschleimhaut befestigen. Mehr als 90% der gesamten Bakterien blieb an den Biopsien angebracht nach drei aufeinanderfolgenden Waschungen mit zunehmend harten Bedingungen (Supplementary Abbildung S5A). Der letzte Waschschritt wurde auf hohe Leistung auf einem Desktop-vortex Maschine. In ähnlicher Weise Mehrheit der Streptococcus
Bakterien an die Biopsien nach den drei Waschschritte (Supplementary Abbildung S5B) befestigt blieb.

Diskussion

In dieser Studie haben wir die Profil bakteriellen Mikrobiota in den paarigen Magen-Biopsien (Antrum und Körper) von normalen und Antrumgastritis Patienten. Alle Patienten sind H. pylori
negativ und ohne die Anwendung von NSAR. Durch Weitbereichs 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung identifizierten wir 1223 nicht H-pylori-Bakterien
Klone, ähnlich wie bei einer früheren Studie (Bik-Studie 1056 nicht H-pylori-Bakterien
Klone) [16 ]. Obwohl die beiden Studien zwei geographisch (vs. Kalifornien Hong Kong) analysiert und ethnisch (Chinese gegen Kaukasier, Hispanics und Afroamerikaner) divergenten Populationen sind die Gesamt Mikrobiota Komplexität erstaunlich ähnlich (Tabelle 3). Beide Studien rund 130 (133 und 127 für diese und die Bik Studie, beziehungsweise) identifiziert Phylotypen 7 bis 8 phyla. Die Mehrheit der Klone (77,4% dieser Studie und 79,8% der Bik-Studie) wurden geteilt. Die beiden häufigsten Gattungen ( Streptococcus
und Prevotella
) waren ebenfalls identisch. Diese beiden Gattungen vertreten 40,6% und 41,5% aller Klone in dieser Studie und der Bik Studie. Beide Studien zeigten, dass etwa 200 verschiedene Phylotypen in der Magenschleimhaut vorhanden sein können. Eine solche dramatische Ähnlichkeit zwischen den beiden Studien unterstreicht den Selektionsdruck für die Mikrobiota unter der rauen Magenumgebung. Zusätzlich haben wir kaum einen Unterschied in der bakteriellen Mikrobiota zwischen den beiden anatomischen Stellen (Antrum und Körper) bei normalen Patienten gefunden, trotz der klinischen Relevanz für die Biopsie Probenahme an verschiedenen anatomischen Stellen [31].

Da die strengen Waschschritte nicht in der Lage waren, die Mikrobiota von den Biopsien zu trennen, theoretisieren wir, dass die Mehrheit der identifizierten Bakterien eng mit der Magenschleimhaut verbunden sind. Darüber hinaus konnten wir Mehrheit der zu kultivieren Streptococcus
Phylotypen identifiziert durch Weitbereichs 16S rRNA-Sequenzierung, was darauf hindeutet, dass diese Bakterien tatsächlich wahr Bewohner in der Magenschleimhaut sein kann.

Um weiter zu schätzen wissen die Gesamtkomplexität der Magen Mikrobiota, bauten wir ein Taxon Baum auf den identifizierten Klone basierend auf den einzelnen Taxa Ebene einschließlich Phylum, Klasse, Ordnung, Familie und Gattung zu suchen. Interessanterweise fanden wir, dass für jeden Stamm, ein oder zwei Gattungen waren überwiegend vorhanden. Die fünf häufigsten Gattungen einschließlich Streptococcus
(phylum Firmicutes), Prevotella
und Porphyromonas
(Bacteroidetes) sowie Neisseria
und Haemophilus
(Proteo) bildeten 70,5% aller mikrobiellen Klone.

Interessanterweise ergab die 16S-rRNA-Profilierung eine deutliche über~~POS=TRUNC der Firmicutes phylum (vor allem aufgrund der über~~POS=TRUNC von der Streptococcus
Gattung innerhalb der phylum) und eine Unterrepräsentation der Proteo phylum in den Biopsien von Antrumgastritis Patienten. Wir entwickelten ein taxonspezifische qPCR Ansatz, um die Fülle der Firmicutes zu analysieren und Streptokokken
Taxa für 90 Biopsien (46 Proben von 23 Antrumgastritis Patienten und 44 Proben von 22 normalen Patienten) und bestätigte die Überrepräsentation von diese beiden Taxa in Antrumgastritis Magen um 42% und 71% betragen. Die meisten der Streptococcus
identifiziert Phylotypen durch Sequenzierung waren alpha-hämolytische Bakterien, die potenzielle Krankheitserreger (zB Streptococcus pneumoniae
, Streptococcus mitis
und Streptococcus salivarius
). Bestimmte Streptococcus sind
Spezies zu niedrigen pH-Bedingungen beständig und kann in den Magen [32] überstehen. Unsere Anbaudaten und Waschversuch auch vorgeschlagen, dass diese in der Tat lebten, wohnhaft Biota im Magen.

Ob der Anstieg in Streptococcus
Fülle ist ursächlich für Antrumgastritis oder aufgrund lokaler Umweltveränderungen aufgrund Antrumgastritis beantwortet werden geblieben. Ein möglicher Ansatz ist mit keimfreien Mausmodell [33]. Eine weitere interessante Frage ist, ob bestimmte Mikrobiota Zusammensetzungen zu schützen, oder alternativ die Magenschleimhaut von eindringende Krankheitserreger zu sensibilisieren, wie H. pylori
. Schließlich sind neue Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologien wahrscheinlich umfassender Daten über Mikrobiota von verschiedenen anatomischen Stellen entlang des menschlichen Verdauungstrakt und zu verschiedenen Zeitpunkten zur Verfügung zu stellen [34].

Materialien und Methoden

Magen Biopsieproben

Diese Studie wurde von der Chinese University of Hong Kong klinischen Forschung Ethikkommission genehmigt. Alle Patienten gaben für den Erhalt der Studie Proben informierte Zustimmung geschrieben. Zwei Magenschleimhaut Biopsien (Antrum und Körper des Magens) wurden von jedem Patienten während der Routineendoskopie im Prince of Wales Hospital, Hong Kong gesammelt. Zur Vermeidung von Kontaminationen, eine neue sterilisierte Endoskopie Zangen verwendet wurde, als eine zweite Biopsie aus dem gleichen Patienten. Die Biopsien wurden schockgefroren auf Trockeneis und bei -80 ° C gelagert. Die Patienten Antibiotika oder NSAIDs (definiert als jede Verwendung von NSAR für mindestens eine Woche in den letzten 3 Monaten vor der Endoskopie) oder positiv getestet H nehmen. pylori und Videos schnelle Urease-Test (RUT) oder histologische Tests wurden ausgeschlossen. Patienten Demographie ist in Tabelle 2 gezeigt

Bau von 16S rRNA Klonbibliotheken und Sequenzierung

Die gesamte genomische DNA aus den Biopsien unter Verwendung des DNA-Mini-Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA isoliert wurde ) mit Glas schlagen Schläger Verfahren wie zuvor beschrieben [16]. Zwei negative Kontrollen mit nur steriles Wasser wurden ebenfalls mit dem gleichen Protokoll extrahiert. Die extrahierten DNA-Konzentrationen wurden durch Nanodrop 1000 Spektralphotometer (Thermo Scientific, Minneapolis, MN, USA) gemessen. Zwei universelle bakterielle 16S-rRNA-Primer, B8F20 [35] (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') und B806R20 [36] (5' GGACTACCAGGGTATCTAAT-3 ') wurden verwendet, um die Region zu amplifizieren, entsprechend 8-806 des zu positionieren Escherichia coli
16S rRNA-Gen. Die 25 &mgr; l PCR-Mischungen enthalten 1 × PCR-Puffer, einschließlich 1,5 mM MgCl _{2 (Qiagen), 20 mM Tetramethylammoniumchlorid, 0,1 mM jedes dNTP, 0,4 uM von jedem Primer, 1 Einheit HotStar Taq DNA Polymerase (Qiagen), und 2 ul DNA extrahiert. Ein dreißig Cycle-PCR wurde durchgeführt, das 799 bp-Fragment zu amplifizieren. Die PCR-Produkte wurden durch Agarose-Gelelektrophorese überprüft. Für jedes Produkt könnte eine einzelne Bande unter UV-Licht beobachtet werden, während keine Bande für die Negativkontrollen gesehen wurde. Die 16S-rRNA-Produkte wurden mit Sephadex G-50-Säule (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) gereinigt, ligiert mit T-Vektoren und verwandelte sich in E. coli
JM109-Zellen durch das pGEM-T-Vektor einfachen System (Promega, Madison, WI, USA). Wir haben für Sie 5 Patienten (10 Biopsie-Proben) mit Antrumgastritis und 5 normalen Kontrollen (10 Biopsie-Proben) zu konstruieren 20 16S rRNA-Gen-Bibliotheken. Für jede Magenbiopsie Bibliothek mindestens 60 Kolonien wurden für die Sequenzierung ausgewählt. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung von BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) sequenziert. Die Reaktionen Sequenzierung B8F20 als Sequenzierungsprimer verwendet wurden auf einem ABI 3730xl Sequenzer durchgeführt (Applied Biosystems)}

Die phylogenetische Analyse und mikrobielle Diversität Schätzung

Die chimären Test, um die Bellerophon-Server (http.: //foo.maths.uq.edu.au/~huber/bellerophon.pl) [37] wurde verwendet, um potentielle chimäre Sequenzen zu testen. Ein Klon wurde als chimäre gefunden und anschließend ausgeschlossen. Dann wurden die 1223 nicht schimärischen Sequenzen von RDP II (ribosomale Datenbank-Projekt II) Sichter (http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp) analysiert basierend auf einem naiven Bayes-Klassifikator rRNA [38]. Basic Local Alignment Suchwerkzeug (BLAST) von Green Genes zur Verfügung gestellt (http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-blast_interface.cgi) wurde durchgeführt, um die ähnlichsten Sequenzen in der Datenbank zu finden. Wir verwendeten 97% Sequenzidentität als Cutoff für die Definition Phylotypen [39]. Sequenzen mit Identität < 97% zu den bestehenden Sequenzen in der Datenbank wurden neu angesehen. Das Taxon Baum wurde unter Verwendung der Klassifikationsergebnis des RPD II Klassifizierer aufgebaut. CHAO1 Schätzer der Abschätzungen 8-Programm (http://viceroy.eeb.uconn.edu/estimates) wurde verwendet, um die mikrobielle Vielfalt zu schätzen. Gute Methode wurde verwendet Sequenzierung Abdeckung zu berechnen [40].

Real-time quantitative PCR (qPCR)

Q-PCR-Primer und Sonden wurden konstruiert, basierend auf den Sequenzen, die von den klonierten Bibliotheken erhalten. Wir zunächst alle geklonten Sequenzen von ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) mit den Standardparametern ausgerichtet sind. Die Primer waren qPCR B8F20 und B801R21 (5'- ACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3 '). Die MGB Sondensequenzen sind: generic-Sonde (VIC) 5 'CAGCAGCCGCGGTAA-3', Firmicutes Sonde (FAM) 5 'AAGATTCCCTACTGCTGCCT-3' und Streptococcus
Sonde (FAM) 5 'TACACATGGAATTCCAC-3' . Zur Messung der Fülle eines bestimmten Taxons, zwei Sonden (eine spezifisch für das Taxon von Interesse und der zweiten Gattungs für alle Bakterien) wurden in der gleichen PCR-Amplikon verwendet. (Figur 2). Die 25 &mgr; l PCR-Gemisch enthalten 1 × Puffer A, 3,5 mM MgCl _{2, 200 uM dNTP mit dUTP anstelle von dTTP, 400 nM jedes Primers, 100 nM von jeder Sonde, 0,01 U /&mgr; l Uracil-N-Glycosylase, und 0,05 U /&mgr; l TaqGold (Applied Biosystems). Für den Firmicutes-spezifischen Assay, der Radsport Zustand war: 1) 50 ° C für 2 Minuten; 2) 95 ° C für 10 min; 3) 40 Zyklen von 95 ° C für 20 sec, 58 ° C für 15 sec, 70 ° C für 80 sec. Für die Streptococcus
-spezifische Assay, der Radsport Zustand war: 1) 50 ° C für 2 Minuten; 2) 95 ° C für 10 min; 3) 40 Zyklen von 95 ° C für 20 sec, 57 ° C für 1 min, 70 ° C für 1 min. Die Streptococcus
16S-rRNA-Fragment (DQ346438) kloniert in den pGEM-T leicht Vektor wurde als Standard für die qPCR (sowohl für die Firmicutes und den Streptococcus
Assays) in dem ABI 7500 echt gelaufen -Zeit PCR-System (Applied Biosystems). Aufgrund einiger geringfügiger Unterschied zwischen den generischen und Taxon-spezifischen Sonden wurde delta delta Schwellenzyklus (DDCT) verwendet, um die Fülle des spezifischen Taxons in der gesamten Bakterienpopulation um anzuzeigen (Ct TSU. Ct des Taxons spezifische Sonde aus unbekannte Proben, Ct BUU: Ct von bakteriellen universal-Sonde aus unbekannten Proben, Ct TSS: Ct von taxonspezifische Sonde aus dem Plasmid-Standard, Ct BSS: Ct von bakteriellen universellen Sonde aus dem Plasmid-Standard)}

Theoretisch kann die Fülle eines Taxons ist 2 ^-ddCt.

Streptococcus
Anbau

Wir erhielten 32 weitere Biopsien von 16 Patienten für Bakterienkultur. Die Biopsien wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH = 7,2) und geschnitten, um kleinere Stücke durch ein Skalpell setzen. Die Proben wurden dann verteilt auf Blutagarplatten (CM331, Oxoid, Basingstoke, UK) mit 5% Pferdeblut. Die Platten wurden in einer 5% CO _{2 Inkubator bei 37 ° C für 24 Stunden platziert. Die Kolonien mit Hämolyse auf Blut-Agar wurden für 16S-rRNA-Sequenzierung ausgewählt.}

Biopsy Waschen

Für Biopsie Waschtest, 14 zusätzliche Proben aus beiden Antrumgastritis Patienten und gesunden Menschen wurden gesammelt. Jede Probe wurde in ein 2,0 ml Röhrchen gegeben und 3 mal gewaschen (200 &mgr; l PBS pro Waschung) unter immer härteren Bedingungen. Der erste Wasch wurde durch sanfte Hand Schütteln getan. Der Überstand wurde überführt werden. New PBS wurde zu den Biopsien zur weiteren Waschen zugegeben. Für den zweiten und dritten Waschen wurden die Rohre durch das Rohr Mischer Trio TM-2F (All-Labor wissenschaftliche, AU) bei Grad 3 und 6 Leistungspegel jeweils in etwa entsprechend sanften und kräftigen Verwirbelung verwirbelt. Dann Duplex real-time PCR wurde durchgeführt, um die gesamten Bakterien zu testen und die Streptococcus
Mengen in den PBS-Überstand aus den drei Waschschritten und den gewaschenen Biopsien.

Statistik Analyse

Chi-Quadrat-Test nach Pearson wurde verwendet, um die Klon Anzahl verschiedener Taxa zwischen verschiedenen Probengruppen (NMA: normal Antrum NMB: normal Körper, AGA: Antrumgastritis Antrum, AGB: Antrumgastritis Körper) zu vergleichen aus dem 16S-rRNA-Sequenzierung Ergebnis, wenn die Klon-Nummer für jede Probengruppe mindestens 10. ANOVA-Test wurde verwendet, um die Bakterien Fülle von Daten von qPCR-Assays zu vergleichen. Alle Analysen wurden mit SPSS für Windows ausgeführt wird, Version 11.5 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Für den Artenreichtum zwischen normalen und Antrumgastritis Patienten zu vergleichen, wurde die tatsächliche phylotype Zahl für jeden Patienten zuerst gezählt. Ungepaarten t-Test wurde dann die beiden Patientengruppen zu vergleichen, verwendet.

Grundinformationen
Abbildung S1.
Detaillierte Taxon Baum
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s001
(2,00 MB TIF)
Abbildung S2.
Artenreichtum Schätzung
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s002
(0,97 MB TIF)
Abbildung S3.
Korrelation zwischen qPCR und 16S-rRNA-Klonierung und Sequenzierung
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s003
(0,98 MB TIF)
Abbildung S4.
Mangel an Korrelation zwischen Alter des Patienten und Firmicutes oder Streptococcus Fülle
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s004
(2,01 MB TIF)
Abbildung S5.
Harsh Waschen nicht entfernt die Bakterien aus den Biopsien
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s005
(1,90 MB TIF)
Tabelle S1.
Novel phyltoypes
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s006
(0,03 MB XLS)
Tabelle S2.
Artenreichtum Schätzung in verschiedenen Biopsieproben
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s007
(0,02 MB XLS)
Tabelle S3.
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s008
(0,02 MB XLS)

• PLoS ONE: Verbesserte M1-Makrophagen-Polarisation im Bereich Human Helicobacter pylori-assoziierten atrophische Gastritis und bei geimpften Mäuse
• PLoS ONE: Isozitratdehydrogenase von Helicobacter pylori Potenziell induziert humoralen Immunantwort bei Patienten mit Ulkuskrankheit und Gastritis