PLoS ONE: Bacteriële Microbiota Profiling in gastritis zonder Helicobacter pylori infectie of niet-steroïdale anti-inflammatoire drugsgebruik

Abstract

Recent 16S ribosomaal RNA gen (rRNA) moleculaire profilering van het maagslijmvlies onthulde een verrassende complexiteit van de microbiota. Helicobacter pylori
infectie en niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID) gebruik zijn twee belangrijke bijdragen aan gastritis en maagzweren. Er is echter weinig bekend over het verband tussen de overige leden van de maag microbiota en maag ziekten. In deze studie, klonering en sequentiëring van het 16S rRNA werd gebruikt om de maag microbiota van normale patiënten en gastritis profileren. Honderd drie en dertig phylotypes uit acht bacteriële phyla werden geïdentificeerd. De maag microbiota werd gevonden op de voet worden gevolgd aan het slijmvlies. Elf Streptococcus
phylotypes werden met succes gekweekt uit de biopsies. Een tot twee genera vertegenwoordigen de meerderheid van klonen in elk van de geïdentificeerde phyla. Verder hebben we twee real-time kwantitatieve PCR assays ontwikkeld om de relatieve abundantie van de phylum Firmicutes en Streptococcus
genus kwantificeren. Significant hogere overvloed aan de Firmicutes stam en de Streptococcus
genus binnen de Firmicutes stam werd waargenomen bij patiënten met antral gastritis, in vergelijking met normale controles. Deze studie suggereert dat het geslacht taxon niveau grotendeels veel hogere taxa kan vertegenwoordigen, zoals de stam. De klinische relevantie en het onderliggende mechanisme van de veranderde samenstelling microbiota in gastritis vereisen verdere functionele studies

Visum:. Li XX, Wong GL-H, To KF, Wong VW-S, Lai LH, Chow DK-L, et al. (2009) Bacteriële Microbiota Profiling in gastritis zonder Helicobacter pylori
infectie of niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddelen gebruiken. PLoS ONE 4 (11): e7985. doi: 10.1371 /journal.pone.0007985

Editor: Niyaz Ahmed, Universiteit van Hyderabad, India

Ontvangen: 4 juni 2009; Aanvaard: 27 oktober 2009; Gepubliceerd: 24 november 2009

Copyright: © 2009 Li et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk wordt ondersteund door de Chinese universiteit van Hong Kong. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Commensal microbiota is een integraal onderdeel van een menselijk wezen [1]. De meeste microben bevolken onze maagdarmkanaal, meer dan 800 soorten van negen bacteriële en één Archaea phyla. Deze diverse microbiota bijdraagt ​​tot maturatie gut [2], [3], [4], gastheer voeding en pathogeenresistentie [5]. Microben ook direct met menselijke gastheer door het reguleren intestinale epitheliale proliferatie vetopslag en ontstekingsreacties [3], [6], [7]. Terwijl sommige microben zijn eentje ernstige ziekte kan veroorzaken, veel chronische aandoeningen zijn waarschijnlijk te wijten aan verstoringen van de totale microbiota. Bijvoorbeeld, allergieën en astma gekoppeld aan kinderen antibiotica die darmflora kunnen beïnvloeden [8]. Andere condities geassocieerd met intestinale microbiota omvatten late-onset autisme [9], inflammatoire darmziekte [10], en kanker [11].

Traditioneel kweken gebaseerde methoden worden gebruikt om microbiële isolaten te verkrijgen voor verdere karakterisering. Dergelijke studies op voorwaarde dat het fundament van ons begrip van de microbiologie. Echter, de teelt is vaak arbeidsintensief en kan falen voor veel microben. Microscopische observatie wordt ook gebruikt om overvloed van microben te schatten, en in beperkte mate, wijst microben taxa [12]. Onlangs, zijn 16S ribosomaal RNA gen (rRNA) sequentie profielen gebruikt om microbiële diversiteit te helderen, vaak naar de phylotype niveau. Gebruik 16S rRNA sequentie, microben mond [13], [14], slokdarm [15], maag [16], dunne darm [17], colon [18], [19] en de vagina [20] zijn onderzocht. Deze studies onderzocht microbiële diversiteit in het menselijk lichaam en openbaarde een grote populatie van wilde en gekarakteriseerde microben die ongrijpbaar geweest voor kweken gebaseerde methoden. Door deze high-throughput 16S rRNA sequentie en andere metagenomic sequencing inspanningen werden microbiota verstoringen in verband gebracht met parodontitis [21] en obesitas [22], [23], [24].

In de maag , maagzuur doodt vele INGESLIKT microben. Algemeen werd aangenomen dat de maag is niet onbewoonbaar door een microbe tot de ontdekking van de Helicobacter pylori Kopen en de associatie met gastritis en maagzweren [25]. Anders dan een paar andere Helicobacter
soorten [26], [27], [28], werd niet verwacht dat de maag vele andere levende microben zou bevatten. Verminderde zuurgraad als gevolg van progressieve atrofische gastritis kan microbiële diversiteit [29] te verhogen. Een studie van Monstein et al.
Behulp temperatuurgradiënt tijdelijke gelelektroforese (TTGE) en een kleinschalige 16S rRNA sequencing gesuggereerd andere microben zoals Enterococcus
, Pseudomonas
Streptococcus
, Staphylococcus Kopen en Stomatococcus
ook aanwezig in de maag [30] waren. Een meer recente grootschalige 16S rRNA sequentie inspanning die 128 phylotypes van 8 phyla in 23 Noord-Amerikaanse patiënten [16]. Interessant is dat de aanwezigheid van H. pylori
in de maag had geen invloed op de totale samenstelling van de microbiota in de phylum niveau.

In deze studie, gingen we verder om mogelijke associaties tussen maag microbiota veranderingen en niet- H onderzoeken. pylori Kopen en non-NSAID (NHNN) gastritis. Onze hypothese was dat wanneer H. pylori
niet aanwezig, andere bacteriële groepen /soorten kan bijdragen aan of geassocieerd met gastritis ontwikkeling. Op de microbiota niveau, wij ook graag een belangrijke kwestie aan te pakken in het veld: op welke taxon diepte (s) doet de microbiota blijken relatief stabiel, zodanig dat verstoringen op deze niveaus voor de menselijke gezondheid van belang kunnen zijn? We gebruikten 16S rRNA gen klonering en sequencing de maag microbiota profiel van normale en NHNN gastritis patiënten en taxon-specifieke real-time kwantitatieve PCR (qPCR) bepalingen om de relatieve abundantie van de Firmicutes phylum en Streptococcus genus.

Resultaten

Taxon boom analyse

We analyseerden zowel lichaam als antrum biopten van 5 normale individuen en 5 NHNN antrale gastritis individuen (alle vrouwen, leeftijd gematchte) . Alle patiënten waren H. pylori
negatief door zowel snelle urease test-en 16S rRNA sequencing. Geen van de patiënten had NSAID genomen binnen 6 maanden voor endoscopie ondergaat. Ten minste 60 klonen uit elke biopsie (body of antrum, dus minstens 120 klonen uit elk afzonderlijk) werd de sequentie bepaald met een breed scala 16S rRNA PCR producten. Een totaal van 1.223 niet- H. pylori
microbiële sequenties werden verkregen. Deze microben behoren tot 8 phyla (133 phylotypes), waarvan 5 phyla (Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteia, Fusobacteriën en Proteobacteria) aanwezig zijn in een overgrote meerderheid (1.211 uit 1223, of 99,0%). Negen phylotypes met sequentie-overeenkomst minder dan 97% tot sequenties die aanwezig zijn in de publieke databases werden geïdentificeerd. Zes van deze 9 phylotypes werden vertegenwoordigd door enkele klonen (aanvullende tabel S1).

Om de algemene vertegenwoordiging van de verschillende taxon niveaus in de maag biota te onderzoeken, we bouwden een taxon boom (figuur 1 en aanvullende figuur S1). Interessant, werd elke stam gedomineerd door slechts een of twee lagere taxon niveaus (klasse, orde, familie of genus). Als feite werd elke stam gedomineerd door slechts 1-2 geslachten. Zo is de meest voorkomende stam Firmicutes vertegenwoordigd door 383 klonen van de 333 klonen uit de klasse Bacilli. Vervolgens werden 273 klonen uit de orde Lactobacillales. Tweehonderd en vierenvijftig klonen waren afkomstig uit de familie Streptococcaceae. En alle 254 klonen waren afkomstig uit het geslacht Streptococcus
. De vijf meest voorkomende genera inclusief Streptococcus
(254 klonen), Prevotella
(243), Neisseria
(175), Haemophilus
(122) Porphyromonas
(68), vormden 70,5% van de bacteriële klonen.

Soorten rijkdom en diversiteit

Als de gehele dataset (1223 klonen) werd gebruikt, Good's dekking was 96%, wat aangeeft dat vier extra phylotypes zou verwachten voor elke 100 aanvullende klonen waarvan de sequentie. Dit dekkingsgraad aangegeven dat de meerderheid van bacteriële sequenties aanwezig in de sequentie klonen. Diversiteit raming op grond van ramingen van versie 8.0 is aangegeven dat ongeveer 200 phylotypes aanwezig in de menselijke maag biopsie monsters (aanvullende figuur S2) kan zijn. We verder schatting gemaakt van de soortenrijkdom in vier verschillende biopsie monsters (NMa (Normal Antrum) NMB (normale lichaamstemperatuur), AGA (Antral Gastritis Antrum), AGB (Antral gastritis Body); Aanvullende tabel S2). Soortenrijkdom was niet verschillend tussen de antrale gastritis biopsies en normale biopten (p > 0,1, ongepaarde t-test)

Bacterial microbiota vergelijking tussen twee verschillende anatomische locaties (antrum en lichaam) in de normale patiënten
<. p> In de normale patiënten werd geen significant verschil waargenomen tussen twee anatomische locaties (antrum en lichaam) voor een van de taxon groepen, behalve voor de familie Prevotellaceae en het geslacht Prevotella
waar de p-waarden (Pearson chi -square test) lagen tussen 0,01-0,05 (figuur 1).

Firmicutes phylum en Streptococcus
genus werden verrijkt in de maag van antrale gastritis patiënten

op basis van het 1223 16S rRNA sequenties, de Firmicutes stam was de meest voorkomende stam met 383 klonen. De Proteobacteria stam was een goede tweede met 345 klonen. Interessant is dat de Firmicutes phylum was overvloediger in antrale gastritis biopsieën dan bij normale biopsieën (41% vs. 22%, Tabel 1), terwijl de Proteobacteria phylum was overvloediger normale biopten (37% vs. 20%). Sinds 16S rRNA sequencing is onbetaalbaar voor een grotere steekproef, ontwikkelden we een taxon-specifieke real-time kwantitatieve PCR (qPCR) aanpak van de overvloed aan Firmicutes kwantificeren en Streptococcus
(figuur 2). Het taxon-specifieke qPCR gegevens Firmicutes waren sterk gecorreleerd met de 16S rRNA sequentie-data voor de voornoemde 20 biopsiemonsters (2 biopsies voor elk van de 5 normale en 5 antrale gastritis patiënten) (aanvullend Figuur S3).

zeventien extra paren van antrum en het lichaam biopsie monsters van normale patiënten en 18 extra paren van antrum en het lichaam biopsie monsters van antrale gastritis patiënten werden geanalyseerd door Firmicutes-specifieke qPCR. Totaal, 90 biopsies (46 monsters van 23 patiënten antrale gastritis en 44 monsters van 22 normale patiënten) werden geanalyseerd (tabel 2). De gemiddelde leeftijd van de antrale gastritis patiënten was 67,6 ± 11,4 (mediaan: 69, bereik: 46-86), terwijl de gemiddelde leeftijd van de controles was 58,3 ± 14,7 (mediaan: 52, bereik: 40-87). De gemiddelde leeftijd van de normale groep jonger dan die van de antrale gastritis groep. Maar statistische analyse toonde aan dat er geen correlatie tussen leeftijd en Firmicutes of Streptococcus
overvloed (p > 0,1) (aanvullende figuur S4). Deze monsters werden verdeeld in 4 groepen, antrale gastritis antrum (AGA), antrale gastritis lichaam (AGB), normale antrum (NMa) en normale lichaamstemperatuur (NMB). De overvloed aan Firmicutes was AGA significant hoger dan in NMA of NmB (One-way ANOVA (Analysis of Variance) test, p = 0,004 en p = 0,046, respectievelijk) en AGB dan in NMA (enkele reis ANOVA, p = 0,039 ) (Figuur 3A). Geen significant verschil waargenomen tussen AGA en AGB (enkele reis ANOVA, p = 0,855), of de NMa en NMB (p = 0,832).

Om dezelfde biopsie monsters, het geslacht Streptococcus
werd ook geanalyseerd door Streptococcus
-specifieke qPCR. Streptococcus
overvloed was 72% en 76% hoger in AGA vs. NMA of NmB, respectievelijk, en 66% en 70% hoger bij AGB vs. NMA of NmB respectievelijk (Figuur 3B). De p waarden van ANOVA proef zijn weergegeven in Figuur 3B. Vergelijkbaar met de Firmicutes assay, werd geen significant verschil waargenomen tussen AGA en AGB (één way ANOVA, p = 0,999), of NMA en NmB (p = 0,999).

Streptococcus
teelt en biopsie wassen

de enkele detectie van 16S rRNA gensequenties betekent niet dat levende bacteriën aanwezig zijn of de bacteriën inderdaad resident plaats van voorbijgangers in de maag. We aldus uitgevoerd twee extra experimenten.

In de eerste plaats hebben we geprobeerd bacteriën teelt van de biopsies. Een cultuur voorwaarde geschikt voor Streptococcus
werd gebruikt omdat ze leek te zijn oververtegenwoordigd in antrale gastritis patiënten. Zestien paren (antrum en lichaam) van biopten werden gebruikt voor de cultuur op het bloed agar platen. Kolonies werd de sequentie van het 16S rRNA gen voor identificatie. Elf phylotypes van Streptococcus
werden geïsoleerd (aanvullende tabel S3). Deze 11 phylotypes vormden 93,3% (of 237 van de 254 klonen) van alle klonen die in de brede range 16S rRNA sequencing, wat aangeeft dat de meerderheid van de Streptococcus
phylotypes zijn leven in de maag biopten.

Ten tweede, 14 biopsie monsters van zowel antrale gastritis en normale patiënten werden gewassen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met drie steeds zware omstandigheden. Als zware wasomstandigheden niet de bacteriën uit de biopsie te verwijderen, is suggestief dat deze bacteriën nauw hechten aan het maagslijmvlies. Meer dan 90% van de totale bacteriën bleef na drie opeenvolgende wasbeurten met steeds zware omstandigheden (aanvullend figuur S5A) gekoppeld aan de biopsieën. De laatste wasstap werd gedaan op een hoog vermogen op een desktop vortex machine. Ook de meerderheid van de Streptococcus
bacteriën bleef bevestigd aan de biopten na de wasstappen 3 (aanvullende figuur S5B).

Discussie

In deze studie hebben we de geprofileerd bacteriële microbiota in de gepaarde maag biopten (antrum en lichaam) van normale en antrale gastritis patiënten. Alle patiënten zijn H. pylori
negatief en zonder gebruik van NSAID's. Door middel van een breed scala 16S rRNA gen sequencing, identificeerden we 1223 niet- H pylori
bacteriën klonen, vergelijkbaar met een eerdere studie (Bik studie, 1056 niet- H pylori
bacteriën klonen) [16 ]. Hoewel beide studies geografisch geanalyseerd twee (Hong Kong vs. California) en etnisch (Chinese vs. Kaukasische, Hispanics en African American) uiteenlopende populaties, de algehele complexiteit microbiota zijn verrassend gelijk (tabel 3). Beide studies geïdentificeerd ongeveer 130 (133 en 127 voor dit en de Bik studie, respectievelijk) phylotypes 7-8 phyla. De meerderheid van de klonen (77,4% van deze studie en 79,8% van Bik studie) werden gedeeld. De twee meest voorkomende genera ( Streptococcus Kopen en Prevotella
) waren ook identiek. Deze twee genera vertegenwoordigen 40,6% en 41,5% van alle klonen in deze studie en Bik studie. Beide studies is gebleken dat ongeveer 200 verschillende phylotypes aanwezig in het maagslijmvlies zijn. Zulke dramatische gelijkenis tussen de twee studies benadrukt de selectiedruk op de microbiota onder barre maagomgeving. Bovendien, weinig verschil in bacteriële microbiota tussen twee anatomische plaatsen (antrum en lichaam) bij normale patiënten vonden we, ondanks het klinische belang voor biopsie bemonstering op verschillende anatomische plaatsen [31].

Aangezien rigoureuze wasstappen niet in staat om de microbiota scheiden van de biopsies, veronderstellen we dat de meerderheid van de geïdentificeerde bacteriën strak geassocieerd met het maagslijmvlies. Bovendien, waren we in staat om de meerderheid van cultiveren de Streptococcus
phylotypes geïdentificeerd door middel van een breed scala 16S rRNA sequencing, wat suggereert dat deze bacteriën kan inderdaad waar zijn bewoners in het maagslijmvlies.

Om verder te waarderen de algehele complexiteit van de maag microbiota, gebouwd we een taxon boom op basis van de geïdentificeerde klonen te kijken naar elk taxon niveau met inbegrip van phylum, klasse, orde, familie en geslacht. Interessant, vonden we dat voor elke stam een ​​of twee genera voornamelijk aanwezig waren. De vijf meest voorkomende genera inclusief Streptococcus
(stam Firmicutes), Prevotella Kopen en Porphyromonas
(Bacteroidetes), evenals Neisseria Kopen en Haemophilus
(Proteobacteria), vormden 70,5% van de bacteriële klonen.

Interessant is dat de 16S rRNA profilering bleek een significante oververtegenwoordiging van de Firmicutes phylum (voornamelijk als gevolg van de oververtegenwoordiging van de Streptococcus
genus binnen de stam) en een ondervertegenwoordiging van de Proteobacteriën stam in de biopten van antrale gastritis patiënten. We ontwikkelden een taxon-specifieke qPCR aanpak van de overvloed van de Firmicutes te analyseren en streptococcus
taxa 90 biopten (46 monsters van 23 antrale gastritis patiënten en 44 monsters van 22 normale patiënten) en bevestigde de oververtegenwoordiging van deze twee taxa antrale gastritis maag met 42% en 71% respectievelijk. Het merendeel van de Streptococcus
phylotypes geïdentificeerd door sequencing waren alpha-hemolytische bacteriën die potentiële ziekteverwekkers (zijn bijvoorbeeld Streptococcus pneumoniae
, Streptococcus mitis Kopen en Streptococcus salivarius
). Bepaalde Streptococcus
soorten zijn bestand tegen lage pH-omstandigheden en kunnen overleven in de maag [32]. Onze teelt van gegevens en het wassen van experiment ook gesuggereerd dat dit inderdaad het leven, woonachtig biota in de maag.

Of de stijging van de Streptococcus
overvloed is oorzakelijke voor antrale gastritis of een gevolg van lokale veranderingen in het milieu als gevolg van antrale gastritis nog worden beantwoord. Een mogelijke benadering is het gebruik van kiemvrij muismodel [33]. Een andere intrigerende vraag is dat of bepaalde microbiota composities te beschermen, of als alternatief, sensibiliseren het maagslijmvlies van het binnenvallen van ziekteverwekkers zoals H. pylori
. Ten slotte, nieuwe high throughput sequencing technologieën zullen waarschijnlijk om meer uitgebreide gegevens te verstrekken over microbiota van verschillende anatomische locaties langs het menselijke spijsverteringskanaal en op verschillende tijdstippen [34].

Materialen en methoden

Gastric biopsie monsters

Deze studie werd goedgekeurd door de Chinese Universiteit van Hong Kong klinisch onderzoek ethische commissie. Alle patiënten gaven schriftelijk toestemming voor het verkrijgen van de studie exemplaren. Twee maagslijmvlies biopten (antrum en het lichaam van de maag) werden verzameld van elke patiënt tijdens een routine endoscopie in het Prince of Wales Hospital, Hong Kong. Om besmetting te voorkomen, werd een nieuw gesteriliseerd endoscopie tang gebruikt bij het nemen van een tweede biopsie van dezelfde patiënt. De biopten werden snel bevroren op droog ijs en bewaard bij -80 ° C. Patiënten die antibiotica of NSAIDs (gedefinieerd als het gebruik van NSAID gedurende ten minste één week in de laatste 3 maanden voor endoscopie) of positief voor H. pylori
door snelle urease-test (RUT) of histologisch onderzoek werden uitgesloten. Patiënt demografie wordt in Tabel 2 getoond

Constructie van 16S rRNA kloonbibliotheken en sequencing

Totaal genomisch DNA werd geïsoleerd uit de biopten met behulp van de DNA mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA ) met glas klopper methode zoals eerder beschreven [16]. Twee negatieve controles met slechts steriel water werden geëxtraheerd met hetzelfde protocol. Het geëxtraheerde DNA concentraties werden gemeten met NanoDrop 1000 Spectrofotometer (Thermo Scientific, Minneapolis, MN, USA). Twee universele bacteriële 16S rRNA primers, B8F20 [35] (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') en B806R20 [36] (5'GGACTACCAGGGTATCTAAT-3') werden gebruikt om het gebied dat overeenkomt met positie amplificeren 8-806 van de Escherichia coli 16S rRNA gen
. De 25 pi PCR mengsels inbegrepen 1 x PCR-buffer zoals 1,5 mM MgCl _{2 (Qiagen), 20 mM tetramethylammonium chloride, 0,1 mM van elk dNTP, 0,4 uM van elke primer, 1 eenheid HotStar Taq DNA polymerase (Qiagen), en 2 pi DNA geëxtraheerd. Een dertig cycli PCR werd uitgevoerd om het 799 bp fragment te amplificeren. De PCR producten werden gecontroleerd door agarose gelelektroforese. Voor elk product kan een enkele band worden waargenomen onder UV-licht, terwijl er geen band werd gezien voor de negatieve controles. De 16S rRNA producten werden gezuiverd met een Sephadex G-50-kolom (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), geligeerd met T vectoren en getransformeerd in E.
coli JM109-cellen met de pGEM-T Easy-vector-systeem (Promega, Madison, WI, USA). We kozen 5 patiënten (10 biopsie monsters) met antrale gastritis en 5 normale controles (10 biopsiemonsters) het construeren 20 16S rRNA-gen bibliotheken. Voor elke gastrische biopsie bibliotheek werden ten minste 60 kolonies geselecteerd voor sequentiebepaling. De PCR-producten werden gesequenced met behulp van BigDye terminator cycle sequencing kit v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). De sequencing reacties met behulp van B8F20 als sequencing primer werden uitgevoerd op een ABI 3730xl sequencer (Applied Biosystems) uitgevoerd}

Fylogenetische analyse en microbiële diversiteit schatting

Het chimere test met de Bellerophon server (http.: //foo.maths.uq.edu.au/~huber/bellerophon.pl) [37] werd gebruikt om potentiële chimère sequenties te testen. Eén kloon werd gevonden chimère vervolgens uitgesloten. Vervolgens werden de 1223 chimere sequenties geanalyseerd met RDP II (Ribosomal Database Project II) classifier (http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp) gebaseerd op een naïeve Bayes classifier rRNA [38]. Primaire lokale uitlijning onderzoekshulpmiddel (BLAST) die door Green Genes (http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-blast_interface.cgi) werd uitgevoerd om de meest gelijkende sequenties in de database. We gebruikten 97% sequentie-identiteit als de cutoff voor het definiëren van phylotypes [39]. Sequenties met identity < 97% van de bestaande sequenties in de database werden beschouwd roman. De taxon boom werd geconstrueerd door het gebruik van de kwalificatie resultaat van de RPD II classifier. Chao1 schatter van de ramingen 8-programma (http://viceroy.eeb.uconn.edu/estimates) werd gebruikt om de microbiële diversiteit te schatten. Good's werd gebruikt voor sequentiebepaling dekking [40] te berekenen.

Real-time kwantitatieve PCR (qPCR)

Q-PCR primers en probes werden ontworpen op basis van de sequenties verkregen uit de gekloneerde bibliotheken. We hebben eerst uitgelijnd alle gekloonde sequenties door ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) met de standaard parameters. De qPCR primers waren B8F20 en B801R21 (5'ACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3 '). De MGB probe sequenties zijn: generische sonde (VIC) 5'CAGCAGCCGCGGTAA-3 ', Firmicutes sonde (FAM) 5'AAGATTCCCTACTGCTGCCT-3' en Streptococcus
sonde (FAM) 5'TACACATGGAATTCCAC-3 ' . De overvloed aan een bepaald taxon, twee probes (één specifiek voor taxon plaats en de tweede generiek voor alle bacteriën) werden in dezelfde PCR amplicon te meten. (Figuur 2). De 25 pi PCR mengsel dat 1 x buffer A, 3,5 mM MgCl _{2, 200 uM dNTP met dUTP in plaats van dTTP, 400 nM van elke primer, 100 nM van elke probe, 0,01 U /ul uracil-N-Glycosylase, en 0,05 U /ul TaqGold (Applied Biosystems). Voor de Firmicutes-specifieke assay, het cirkelen toestand was: 1) 50 ° C gedurende 2 min; 2) 95 ° C gedurende 10 min; 3) 40 cycli van 95 ° C gedurende 20 seconden, 58 ° C gedurende 15 sec, 70 ° C gedurende 80 sec. Voor de Streptococcus
-specifieke test, de wielerwereld voorwaarde was: 1) 50 ° C gedurende 2 minuten; 2) 95 ° C gedurende 10 min; 3) 40 cycli van 95 ° C gedurende 20 seconden, 57 ° C gedurende 1 minuut, 70 ° C gedurende 1 min. Streptococcus
16S rRNA fragment (DQ346438) gekloneerd in de pGEM-T Easy-vector werd gebruikt als standaard voor qPCR (zowel de Firmicutes en Streptococcus
assays) in de ABI 7500 real -tijd PCR-systeem (Applied Biosystems). Door enkele klein verschil tussen de generieke en taxon-specifieke probes, delta delta drempelcyclus (DDCT) werd gebruikt om de overvloed van de specifieke taxon in het gehele bacteriepopulatie geven (Ct TSU. Ct van taxon-specifieke probe van onbekende monsters, Ct BUU: Ct van bacteriële universele sonde van onbekende monsters, Ct TSS: Ct van doeltaxonspecifieke probe uit het plasmide standaard, Ct BSS: Ct van bacteriële universele sonde uit het plasmide standaard)}

In theorie, de overvloed van een taxon is 2 ^-ddCt.

Streptococcus
Teelt

We verkregen 32 extra biopten van 16 patiënten voor bacteriecultuur. De biopsies werden in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH = 7,2) gebracht en gesneden tot kleine stukken van een scalpel. De monsters werden daarna uitgespreid op agarplaten (CM331, Oxoid, Basingstoke, UK) met 5% paardenbloed. De platen werden in een 5% CO _{2 incubator gedurende 24 uur bij 37 ° C. De kolonies met hemolyse op het bloed agar werden opgehaald voor 16S rRNA sequencing.}

Biopsie wasmachine

Voor biopsie wassen test werden 14 extra monsters van zowel antrale gastritis patiënten en normale mensen verzameld. Elk monster werd in een 2,0 ml buis geplaatst en 3 keer (200 pl PBS voor elke wasbeurt) gewassen onder meer zware omstandigheden. De eerste wasbeurt werd gedaan door zachte hand schudden. De bovenstaande vloeistof werd overgebracht uit. Nieuwe PBS werd aan de biopten verdere wassen toegevoegd. Voor de tweede en derde wassen werden de buizen gewerveld door de buis mixer Trio TM-2F (All-lab wetenschappelijke, AU) in rang 3 en rang 6 vermogen respectievelijk ruwweg overeenkomt met zacht en krachtig vortexen. Vervolgens werd duplex real-time PCR uitgevoerd om de totale bacteriëntest en Streptococcus
hoeveelheden in de supernatanten van PBS drie wasstappen gewassen en biopsies.

Statistieken analyse

chikwadraattoets Pearson werd gebruikt om de kloon aantallen verschillende taxa verschillende monstergroepen vergelijk (NMA: normale antrum, NmB: normale lichaamstemperatuur, AGA: antrale gastritis antrum, AGB: antrale gastritis body) van de 16S rRNA sequentie resultaat, wanneer de kloon nummer voor elk monster groep tenminste 10 was ANOVA test werd gebruikt om de bacteriële overvloed data van qPCR assays vergelijken. Alle analyses werden uitgevoerd met SPSS voor Windows, versie 11.5 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). P < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant. Voor het vergelijken van de soortenrijkdom tussen normale en antrale gastritis patiënten, werd het eigenlijke phylotype nummer voor elke patiënt eerst meegeteld. Ongepaarde t-test werd gebruikt om de twee patiëntengroepen vergelijken.

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
Gedetailleerde taxon boom
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s001
(2,00 MB TIF)
Figuur S2.
soortenrijkdom schatting
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s002
(0.97 MB TIF)
Figuur S3.
Correlatie tussen qPCR en 16S rRNA klonen en sequencing
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s003
(0.98 MB TIF)
figuur S4.
Gebrek aan samenhang tussen leeftijd van de patiënt en Firmicutes of Streptococcus overvloed
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s004
(2.01 MB TIF)
Figuur S5.
Harsh wassen niet de bacteriën te verwijderen uit de biopten
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s005
(1,90 MB TIF)
Tabel S1.
Novel phyltoypes
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s006
(0,03 MB XLS)
tabel S2.
soortenrijkdom schatting in verschillende biopsie monsters
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s007
(0,02 MB XLS)
tabel S3.
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s008
(0,02 MB XLS)

• PLoS ONE: Enhanced M1 Macrophage Polarisatie in Human Helicobacter pylori-geassocieerde atrofische gastritis en bij gevaccineerde Mice
• PLoS ONE: isocitraatdehydrogenase van Helicobacter pylori Potentieel induceert humorale immuunrespons bij patiënten met een maagzweer en Gastritis