PLOS ONE: Microbiota bacteriana de perfiles en la gastritis y sin infección por Helicobacter pylori o no esteroides anti-inflamatorios Uso de Drogas

Extracto

16S recientes gen ARN ribosomal (ARNr) de perfiles moleculares de la mucosa estomacal reveló una sorprendente complejidad de la microbiota. Helicobacter pylori
la infección y el uso no esteroide antiinflamatorio (AINE) son los dos principales contribuyentes a la gastritis y úlcera péptica. Sin embargo, poco se sabe acerca de la asociación entre los demás miembros de la microbiota del estómago y enfermedades gástricas. En este estudio, la clonación y secuenciación del 16S rRNA se utilizó para el perfil de la microbiota estómago de pacientes normales y gastritis. Se identificaron Ciento treinta y tres filotipos de ocho filos de bacterias. Se encontró que la microbiota estómago para ser estrechamente adherido a la mucosa. Once Streptococcus
filotipos se cultivaron con éxito de las biopsias. Una o dos géneros representados la mayoría de los clones dentro de cualquiera de los filos identificado. Desarrollamos además dos ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real para cuantificar la abundancia relativa del filo Firmicutes y el Streptococcus
género. Significativamente mayor abundancia del filo Firmicutes y el se observó Streptococcus
género dentro del phylum Firmicutes en pacientes con gastritis antral, en comparación con los controles normales. Este estudio sugiere que el nivel de género taxón puede representar en gran medida taxones muy superiores tales como el phylum. La relevancia clínica y el mecanismo subyacente a la composición de la microbiota alterada en la gastritis requieren más estudios funcionales

Visto:. Li XX, Wong GL-H, Para KF, Wong VW-S, Lai LH, Chow DK-L, et al. (2009) bacteriana Microbiota de perfiles en la gastritis y sin Helicobacter pylori
Infección o no esteroides anti-inflamatorios uso de drogas. PLoS ONE 4 (11): e7985. doi: 10.1371 /journal.pone.0007985

Editor: Niyaz Ahmed, Universidad de Hyderabad, India

Recibido: 4 de Junio, 2009; Aceptado: 27 Octubre 2009; Publicado: 24 Noviembre 2009

Derechos de Autor © 2009 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo con el apoyo de la Universidad china de Hong Kong. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

comensal microbiota es una parte integral de un ser humano [1]. La gran mayoría de los microbios habitan en nuestro tracto gastrointestinal, con más de 800 especies de bacterias y nueve filos uno de arqueas. Esta microbiota diversa contribuye a la maduración gut [2], [3], [4], la nutrición anfitrión y resistencia a patógenos [5]. Los microbios también interactúan directamente con huésped humano mediante la regulación de la proliferación epitelial intestinal, almacenamiento de grasa y las respuestas inflamatorias [3], [6], [7]. Mientras que algunos microbios pueden causar por sí solo enfermedad grave, muchas enfermedades crónicas son probablemente debido a las perturbaciones de la microbiota en general. Por ejemplo, las alergias y el asma están relacionados con el uso de antibióticos infancia que puede alterar la microbiota intestinal [8]. Otras condiciones asociadas con microbiota intestinal incluyen el autismo de aparición tardía [9], la enfermedad inflamatoria intestinal [10], y el cáncer [11].

Tradicionalmente, los métodos basados ​​en cultivo se utilizan para obtener cepas microbianas para una caracterización adicional. Tales estudios proporcionan la base de nuestra comprensión de la microbiología. Sin embargo, el cultivo es a menudo laborioso y puede fallar por muchos microbios. La observación microscópica también se utiliza para estimar la abundancia de microbios, y en un grado limitado, asigna los microbios a taxones [12]. Recientemente, el gen 16S ARN ribosomal (ARNr) secuencia de los perfiles se utilizan para elucidar la diversidad microbiana, a menudo al nivel filotipo. se han estudiado utilizando la secuenciación del 16S rRNA, los microbios de la boca [13], [14], el esófago [15], el estómago [16], el intestino delgado [17], de colon [18], [19] y la vagina [20]. Estos estudios exploraron la diversidad microbiana en el cuerpo humano y revelaron una gran población de microbios cultivados y no caracterizadas, que había sido difícil de alcanzar para los métodos basados ​​en cultivo. A través de ellas de alto rendimiento de secuenciación de ARNr 16S y otros esfuerzos de secuenciación metagenómica, se encontró que las perturbaciones de la microbiota asociada con la enfermedad periodontal [21] y la obesidad [22], [23], [24].

En el estómago , acidez gástrica mata a muchos microbios ingeridos. En general se consideró que el estómago no es habitable por cualquier microbio hasta el descubrimiento de Helicobacter pylori
y su asociación con la gastritis y úlcera péptica [25]. Aparte de algunos otros Helicobacter
especies [26], [27], [28], no se esperaba que el estómago contendría muchos otros microbios vivos. acidez reducido debido a la gastritis atrófica progresiva puede aumentar la diversidad microbiana [29]. Un estudio realizado por Monstein et al.
Mediante electroforesis en gel de gradiente de temperatura temporal (TTGE) y una pequeña escala secuenciación del ARNr 16S sugirió otros microbios, tales como Enterococcus
, Pseudomonas
, Streptococcus
, Staphylococcus
y Stomatococcus
también estuvieron presentes en el estómago [30]. Un reciente a gran escala 16S rRNA esfuerzo más secuenciación identificó 128 filotipos de 8 filos en 23 pacientes de América del Norte [16]. Curiosamente, la presencia de H. pylori en el estómago
no afectó a la composición general de la microbiota en el nivel phylum.

En este estudio, nos fuimos más para investigar la asociación entre los cambios en la microbiota del estómago y no H. pylori Opiniones y AINE no gastritis (NHNN). La hipótesis de que cuando H. pylori
no está presente, otros grupos de bacterias /especies pueden contribuir a, o estar asociados con el desarrollo de la gastritis. En el nivel de la microbiota, también nos gustaría abordar una cuestión clave en el campo: ¿a qué profundidad taxón (s) hace la microbiota parecen relativamente estable tal que las perturbaciones en estos niveles pueden ser relevantes para la salud humana? Se utilizó 16S rRNA clonación de genes y secuenciación para perfilar la microbiota estómago normal y NHNN gastritis pacientes, y (qPCR) ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real taxón para cuantificar la abundancia relativa del filo Firmicutes y el Streptococcus
género.

resultados

árbol Taxón análisis

Se analizaron tanto el cuerpo y el antro biopsias de 5 individuos normales y 5 NHNN individuos gastritis antral (todas las hembras, emparejados por edad) . Todos los pacientes eran H. pylori
negativa tanto por la prueba rápida de ureasa y la secuenciación del ARNr 16S. Ninguno de los pacientes había tomado AINE dentro de los 6 meses antes de someterse a una endoscopia. Al menos 60 clones de cada biopsia (cuerpo o el antro, por lo tanto, al menos 120 clones de cada individuo) se secuenciaron utilizando una amplia gama de 16S rRNA productos de PCR. Un total de 1223 no H. Se obtuvieron pylori
secuencias microbianas. Estos microbios pertenecen a 8 phyla (133 filotipos), de los cuales 5 phyla (Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteia, Fusobacteria y Proteobacteria) están presentes en una gran mayoría (1,211 de 1,223, o 99,0%). Se identificaron nueve filotipos con la similitud de secuencia de menos de 97% a las secuencias presentes en las bases de datos públicas. Seis de estos 9 filotipos estuvieron representados por los clones individuales (Tabla S1).

Para investigar la representación general de los diferentes niveles de taxones en la biota del estómago, se construyó un árbol taxón (Figura 1 y Figura complementario S1). Curiosamente, cada filo estaba dominado por sólo uno o dos niveles de taxones inferiores (clase, orden, familia o género). Como cuestión de hecho, cada filo estaba dominado por solamente 1 a 2 géneros. Por ejemplo, los Firmicutes filo más abundante fue representados por 383 clones, de los 333 clones son de la clase de los Bacilli. Posteriormente, 273 clones fueron del orden Lactobacillales. Doscientos cincuenta y cuatro clones eran de la familia Streptococcaceae. Y los 254 clones eran del género Streptococcus
. Los géneros más comunes incluyendo cinco Streptococcus
(254 clones), Prevotella gratis (243), Neisseria gratis (175), Haemophilus gratis (122) , Porphyromonas gratis (68), constituyó el 70,5% de todos los clones microbianos.

la riqueza de especies y la diversidad

Cuando se utiliza el conjunto de datos (1223 clones), cobertura de buena era 96%, lo que indica que cuatro filotipos adicionales se espera que por cada 100 clones adicionales para ser secuenciados. Este nivel de cobertura indica que la mayoría de las secuencias bacterianas estaban presentes en los clones secuenciados. la estimación de la diversidad por las estimaciones versión 8.0 indica que alrededor de 200 filotipos pueden estar presentes en las muestras de biopsia de estómago humano (Figura suplementaria S2). Luego calculamos la riqueza de especies en cuatro diferentes muestras de biopsia (NMA (Normal antro), NmB (normal del cuerpo), AGA (gastritis antral del antro), AGB (gastritis antral del cuerpo); el cuadro complementario S2). La riqueza de especies no fue diferente entre las biopsias antrales gastritis y las biopsias normales (p > 0,1, prueba t no pareada) guía

Comparación de la microbiota bacteriana entre dos localizaciones anatómicas diferentes (antro y cuerpo) en pacientes normales
<. p> En los pacientes normales, no se observó diferencia significativa entre dos localizaciones anatómicas (antro y cuerpo) para cualquiera de los grupos de taxones, a excepción de la Prevotellaceae familia y género Prevotella
donde los valores de p (chi de Pearson prueba -square) tenían entre 0,01 a 0,05 (Figura 1).

filo Firmicutes y Streptococcus
género fueron enriquecidos en el estómago de pacientes con gastritis antral

Con base en el 1223 secuencias de 16S rRNA, al filo Firmicutes fue el phylum más abundante con 383 clones. El filo Proteobacteria fue un cercano segundo lugar con 345 clones. Curiosamente, el filo Firmicutes fue más abundante en las biopsias de gastritis antral que en las biopsias normales (41% vs. 22%, Tabla 1), mientras que el filo Proteobacteria fue más abundante en las biopsias normales (37% vs. 20%). Desde la secuenciación del ARNr 16S es un costo prohibitivo para un tamaño de muestra más grande, hemos desarrollado un enfoque cuantitativo en tiempo real de cada taxón PCR (qPCR) para cuantificar la abundancia de Firmicutes y Streptococcus gratis (Figura 2). Los datos qPCR taxón para Firmicutes están altamente correlacionados con los datos de secuenciación del 16S rRNA de los artículos mencionados 20 muestras de biopsia (2 biopsias para cada uno de los 5 normal y 5 pacientes con gastritis antral) (Figura S3).

diecisiete pares adicionales de muestras de biopsias del antro y el cuerpo de los pacientes normales y 18 pares adicionales de muestras de biopsias del antro y el cuerpo de los pacientes con gastritis antrales fueron analizados por Firmicutes-qPCR específica. En total, 90 biopsias (46 muestras de pacientes con gastritis antral 23 y 44 muestras procedentes de 22 pacientes normales) se analizaron (tabla 2). La edad media de los pacientes con gastritis antral fue 67,6 ± 11,4 (mediana: 69 años, rango: 46 a 86), mientras que la edad media de los controles fue de 58,3 ± 14,7 (mediana: 52 años, rango: 40 a 87). La edad media del grupo normal era más joven que la del grupo de gastritis antral. Sin embargo, el análisis estadístico mostró que no hubo correlación entre la edad y Firmicutes o Streptococcus
abundancia (p > 0,1) (Figura S4). Estas muestras se dividieron en 4 grupos, antral gastritis antral (AGA), cuerpo antral gastritis (AGB), antro normal (NMA), y el cuerpo normal (NmB). La abundancia de Firmicutes fue significativamente mayor en AGA que en NMA o NmB (ANOVA de una vía (análisis de varianza) de prueba, p = 0,004 y p = 0,046, respectivamente) y en AGB que en NMA (ANOVA de una vía, p = 0,039 ) (Figura 3A). No se observó ninguna diferencia significativa entre AGA y AGB (ANOVA de una vía, p = 0,855), o NMA y NMB (p = 0,832).

En las mismas muestras de biopsia, el género Streptococcus
también se analizó por Streptococcus
específico de qPCR. Streptococcus
abundancia fue del 72% y un 76% mayor en comparación AGA NMA o NmB, respectivamente, y el 66% y el 70% más alto en comparación AGB NMA o NmB, respectivamente (Figura 3B). Los valores de p para la prueba de ANOVA se muestran en la Figura 3B. Al igual que en el ensayo de Firmicutes, no se observó ninguna diferencia significativa entre AGA y AGB (ANOVA de una vía, p = 0,999), o NMA y NMB (p = 0,999).

Streptococcus
cultivo y la biopsia de lavado

la mera detección de secuencias de genes 16S rRNA no implica que las bacterias vivas están presentes o las bacterias son, en efecto residente en lugar de los transeúntes en el estómago. por tanto, hemos llevado a cabo dos experimentos adicionales.

En primer lugar, se intentó el cultivo de bacterias de las biopsias. Una condición de cultivo adecuado para se utilizó Streptococcus
ya que parecían estar sobre-representados en los pacientes con gastritis antral. Dieciséis pares (antro y cuerpo) de las biopsias fueron utilizados para el cultivo en las placas de agar sangre. Las colonias se secuenciaron para el gen 16S rRNA para la identificación. Once filotipos de Streptococcus
fueron aislados (S3) que complementa el cuadro. Estos 11 filotipos constituían 93,3% (o 237 de los 254 clones) de todos los clones identificados en la secuenciación de ARNr 16S de gama amplia, lo que indica que la mayoría de la Streptococcus
filotipos están vivos en las biopsias gástricas.

en segundo lugar, 14 muestras de biopsia de pacientes tanto de gastritis antral y normales se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con tres condiciones cada vez más duras. Si las condiciones de lavado duras no eliminan las bacterias de la biopsia, es sugerente de que estas bacterias se adhieren estrechamente a la mucosa del estómago. Más del 90% de las bacterias totales se mantuvo unido a las biopsias después de tres lavados consecutivos con condiciones cada vez más duras (Figura S5A). La última etapa de lavado se realiza a alta potencia en una máquina de escritorio vórtice. Del mismo modo, la mayoría de los Streptococcus
bacterias permanecían unidas a las biopsias después de las etapas de lavado 3 (Figura S5B).

Discusión

En este estudio, se han perfilado el microbiota bacteriana en las biopsias gástricas emparejados (antro y del cuerpo) de pacientes normales y antrales gastritis. Todos los pacientes son H. pylori
negativo y sin el uso de AINE. A través de un amplio rango-16S rRNA secuenciación de genes, se identificaron 1.223 H pylori
clones bacterianos, similar a un estudio previo no (Bik estudio, 1.056 no H pylori
clones bacterianos) [16 ]. Aunque los dos estudios analizaron dos geográficamente (Hong Kong vs. California) y étnicamente (China vs raza caucásica, hispanos y afroamericanos) poblaciones divergentes, la complejidad de la microbiota en general son sorprendentemente similares (Tabla 3). En ambos estudios se identificaron aproximadamente 130 (133 y 127 para este y el estudio Bik, respectivamente) filotipos de siete a ocho filos. La mayoría de los clones (77,4% de este estudio y el 79,8% del estudio Bik) fueron compartidos. Los dos géneros más abundantes ( Streptococcus
y Prevotella
) también fueron idénticos. Estos dos géneros representados 40,6% y 41,5% de todos los clones en este estudio y el estudio Bik. Ambos estudios indicaron que aproximadamente 200 diferentes filotipos pueden estar presentes en la mucosa del estómago. Tal similitud dramática entre los dos estudios pone de relieve la presión selectiva para la microbiota en el entorno del estómago duras. Además, se encontró poca diferencia en la microbiota bacteriana entre los dos sitios anatómicos (antro y cuerpo) en pacientes normales, a pesar de la relevancia clínica para la toma de biopsias en diferentes sitios anatómicos [31].

Dado que los rigurosos pasos de lavado no fueron capaces de separar la microbiota de las biopsias, que postula que la mayoría de las bacterias identificadas se asocian fuertemente con la mucosa del estómago. Además, hemos sido capaces de cultivar la mayoría de los Streptococcus
filotipos identificados a través de amplio espectro secuenciación del ARNr 16S, lo que sugiere que estas bacterias pueden ser efectivamente cierto residentes en la mucosa del estómago.

Para apreciar más la complejidad general de la microbiota del estómago, que construye un árbol taxón basado en los clones identificados para mirar en cada nivel de taxón incluyendo filo, clase, orden, familia y género. Curiosamente, encontramos que por cada filo, uno o dos géneros fueron predominantemente presentes. Los géneros más comunes incluyendo cinco Streptococcus gratis (phylum Firmicutes), Prevotella
y Porphyromonas gratis (Bacteroidetes), así como Neisseria
y Haemophilus gratis (Proteobacteria), constituida el 70,5% de todos los clones microbianos.

Curiosamente, la elaboración de perfiles de ARNr 16S reveló una significativa representación excesiva del filo Firmicutes (principalmente debido a la falta de representación más de la Streptococcus
género dentro del phylum) y una falta de representación del filo Proteobacteria en las biopsias de pacientes con gastritis antral. Hemos desarrollado un enfoque qPCR específica del taxón para analizar la abundancia de la Firmicutes y estreptococos
taxones durante 90 biopsias (46 muestras de 23 pacientes con gastritis antral y 44 muestras procedentes de 22 pacientes normales) y confirmó la representación de más de estos dos taxones en el estómago gastritis antral en un 42% y 71%, respectivamente. La mayoría de los Streptococcus
filotipos identificados por secuenciación fueron bacterias alfa-hemolítico que son potenciales agentes patógenos (por ejemplo, Streptococcus pneumoniae
, Streptococcus mitis
y Streptococcus salivarius
). Certain Streptococcus
especies son resistentes a condiciones de pH bajo y pueden sobrevivir en el estómago [32]. Nuestro experimento de cultivo de datos y de lavado también sugirió que se trataba de hecho de estar, la biota residente en el estómago.

Si el aumento de Streptococcus
abundancia es causante de la gastritis antral o resultado del cambio ambiental local debido a la gastritis antral quedó sin respuesta. Un enfoque potencial está utilizando libre de gérmenes modelo de ratón [33]. Otra cuestión interesante es que si ciertas composiciones microbiota protegen, o, alternativamente, a sensibilizar a la mucosa del estómago de los patógenos invasores tales como H. pylori
. Por último, las nuevas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento tienden a proporcionar datos más completos sobre la microflora de los diferentes localizaciones anatómicas a lo largo del tracto digestivo humano y en diferentes puntos de tiempo [34].

Materiales y Métodos

gástricos muestras de biopsia

Este estudio fue aprobado por la Universidad china de Hong Kong comité de ética de investigación clínica. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para la obtención de las muestras de estudio. Dos biopsias de la mucosa gástrica (antro y cuerpo del estómago) se obtuvieron de cada paciente durante la endoscopia de rutina en el Prince of Wales Hospital, Hong Kong. Para evitar la contaminación, se utilizó una nueva endoscopia fórceps esterilizados cuando se toma una segunda biopsia del mismo paciente. Las biopsias fueron instantánea congelada en hielo seco y almacenados a -80 ° C. Los pacientes que toman antibióticos o AINES (definidos como cualquier uso de AINE durante al menos una semana en los últimos 3 meses antes de la endoscopia) o dado positivo a H. pylori fotos: por prueba rápida de ureasa (RUT) o la prueba histológica fueron excluidos. la demografía del paciente se muestra en la Tabla 2.

Construcción de bibliotecas de clones ARNr 16S y secuenciación

El ADN genómico total fue aislado de las biopsias mediante el uso de la DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU. ) con un vaso batidor método vencieron a lo descrito previamente [16]. Dos controles negativos sólo con agua estéril también se extrajeron utilizando el mismo protocolo. Las concentraciones de ADN extraídas se midieron por NanoDrop 1000 espectrofotómetro (Thermo Scientific, Minneapolis, MN, EE.UU.). Dos 16S rRNA bacterianas cebadores universales, B8F20 [35] (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') y B806R20 [36] (5' GGACTACCAGGGTATCTAAT-3 ') se utilizaron para amplificar la región correspondiente a la posición 8 a 806 de la Escherichia coli
gen 16S rRNA. Las 25 mezclas l de PCR incluían 1 x tampón de PCR incluyendo MgCl 1,5 mM _{2 (Qiagen), mM de cloruro 20 de tetrametilamonio, 0,1 mM de cada dNTP, 0,4 mM de cada cebador, 1 unidad de Taq ADN HotStar polimerasa (Qiagen), y 2 l extrajeron el ADN. A treinta y ciclo de PCR se realizó para amplificar el fragmento de 799 pb. Los productos de PCR se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Para cada producto, una sola banda pudo observarse a la luz ultravioleta, mientras que la banda no se observó en los controles negativos. Los productos 16S rRNA se purificaron con una columna Sephadex G-50 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.), se ligó con los vectores T y transformado en E. coli
células JM109 usando el sistema de vector pGEM-T fácil (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Se seleccionaron 5 pacientes (10 muestras de biopsia) con gastritis antral y 5 controles normales (10 muestras de biopsia) para construir 20 bibliotecas de genes 16S rRNA. Para cada biblioteca de biopsia gástrica, se seleccionaron al menos 60 colonias para la secuenciación. Los productos de PCR fueron secuenciados utilizando BigDye Terminator v3.1 ciclo de secuenciación kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las reacciones de secuenciación utilizando B8F20 como el cebador de secuenciación se llevaron a cabo en un secuenciador ABI 3730xl (Applied Biosystems)}

El análisis filogenético y la diversidad microbiana de estimación

La prueba quimérico utilizando el servidor de Belerofonte (http.: //foo.maths.uq.edu.au/~huber/bellerophon.pl) [37] fue utilizado para poner a prueba nuevas secuencias quiméricas. Se encontró un clon que ser quimérico y posteriormente excluidos. A continuación, las secuencias de 1223 no quiméricos fueron analizados por RDP II (base de datos ribosomal Proyecto II) clasificador (http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp) basado en un ingenuo Bayesiano rRNA clasificador [38]. herramienta básica de búsqueda local de alineación (BLAST) proporcionada por Green Genes (http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-blast_interface.cgi) se llevó a cabo para encontrar las secuencias más similares en la base de datos. Se utilizó el 97% de identidad de secuencia que el punto de corte para filotipos que definen [39]. Las secuencias con identidad de < 97% a las secuencias existentes en la base de datos se consideraron novela. El árbol de taxón se construyó utilizando el resultado de la clasificación del clasificador RPD II. estimador Chao1 del 8 programa estima (http://viceroy.eeb.uconn.edu/estimates) se utilizó para estimar la diversidad microbiana. método de Good se utilizó para calcular la cobertura de la secuenciación [40].

-PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) guía

cebadores y sondas Q-PCR se diseñaron basándose en las secuencias obtenidas a partir de las bibliotecas clonados. En primer lugar, todos alineados secuencias clonadas por ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) con los parámetros por defecto. Los cebadores fueron qPCR B8F20 y B801R21 (5'-ACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3 '). Las secuencias de la sonda MGB son: sonda genérica (VIC) 5'-CAGCAGCCGCGGTAA-3 ', la sonda Firmicutes (FAM) 5'-AAGATTCCCTACTGCTGCCT-3' y Streptococcus
sonda (FAM) 5'-TACACATGGAATTCCAC-3 ' . Para medir la abundancia de un taxón, dos sondas específicas (uno para el taxón de interés y el segundo genéricos para todas las bacterias) se utilizaron en la misma amplificación de PCR. (Figura 2). La mezcla de 25 l de PCR incluía 1 x tampón A, MgCl 3,5 mM _{2, 200 dNTP mu M con dUTP en lugar de dTTP, 400 nM de cada cebador, 100 nM de cada sonda, 0,01 U /l de uracilo-N-glicosilasa, y 0,05 U /l TaqGold (Applied Biosystems). Para el ensayo de Firmicutes-específico, la condición de ciclo fue: 1) 50 ° C durante 2 min; 2) 95 ° C durante 10 min; 3) 40 ciclos de 95 ° C para 20 segundos, 58 ° C durante 15 seg, 70 ° C durante 80 seg. Para el Streptococcus
ensayo específico de la condición de ciclismo fue: 1) 50 ° C durante 2 min; 2) 95 ° C durante 10 min; 3) 40 ciclos de 95 ° C para 20 segundos, 57 ° C durante 1 min, 70 ° C durante 1 min. El Streptococcus
fragmento 16S rRNA (DQ346438) clonado en el vector pGEM fácil-T fue utilizado como el estándar para la qPCR (tanto para los Firmicutes y los Streptococcus
ensayos) en el ABI 7500 reales sistema de PCR-tiempo (Applied Biosystems). Debido a alguna ligera diferencia entre las sondas genéricas y taxón, se utilizó ciclo umbral delta delta (DDCT) para indicar la abundancia del taxón específico en toda la población de bacterias (Ct TSU:. Ct de la sonda específica del taxón de muestras desconocidas, Ct BUU: Ct de la sonda universal de bacterias a partir de muestras desconocidas, Ct TSS: Ct del taxón sonda específica de la norma plásmido, Ct BSS: Ct de la sonda universal de bacterias de la norma plásmido)}

en teoría, la abundancia de un taxón es 2 ^-ddCt.

Streptococcus
Cultivo

se obtuvieron 32 biopsias adicionales de 16 pacientes para cultivo bacteriano. Las biopsias se pusieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH = 7,2) y se cortaron en trozos más pequeños por un bisturí. Las muestras fueron luego se extendió en placas de agar sangre (CM331, Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) con sangre de caballo 5%. Las placas se colocaron en un CO 5% _{2 incubadora a 37 ° C durante 24 horas. Las colonias con hemólisis en el agar sangre se recogieron para la secuenciación del 16S rRNA.}

Biopsia de lavado

Para ensayo de lavado biopsia, se recogieron 14 muestras adicionales de ambos pacientes gastritis antrales y la gente normal. Cada muestra se colocó en un tubo de 2,0 ml y se lavó 3 veces (200 l de PBS para cada lavado) en condiciones cada vez más duras. El primer lavado se realizó mediante agitación suave mano. El sobrenadante se transfirió a cabo. New PBS se añadió a las biopsias de lavado adicional. Para el segundo y tercer lavado, los tubos se agitaron por el Trío mezclador de tubos TM-2F (All-laboratorio científico, AU) en el grado 3 y grado 6 Nivel de potencia, respectivamente, que corresponde aproximadamente a un vórtex suave y vigoroso. Entonces duplex PCR en tiempo real se realizó para probar las bacterias totales y el Streptococcus
cantidades en los sobrenadantes de PBS a partir de las tres etapas de lavado y las biopsias lavadas.

Estadísticas análisis

se utilizó la prueba de chi-cuadrado de Pearson para comparar los números de clones de diferentes taxones entre los diferentes grupos de la muestra (NMA: antro normal NmB: corporal normal, AGA: antral gastritis antro, AGB: gastritis antral) a partir del resultado de secuenciación de ARNr 16S, cuando el número clon para cada grupo de muestra fue de al menos 10. se utilizó la prueba ANOVA para comparar los datos de abundancia de bacterias de los ensayos de qPCR. Todos los análisis se realizaron con SPSS para Windows, versión 11.5 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Para la comparación de la riqueza de especies entre los pacientes normales y antrales gastritis, el número filotipo real para cada paciente se contó por primera vez. A continuación se utilizó la prueba t no pareada para comparar los dos grupos de pacientes.

Apoyo a la Información
Figura S1.
Árbol detallado taxón
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s001 gratis (2.00 MB TIF)
figura S2.
Especies estimación de la riqueza
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s002 gratis (0.97 MB TIF)
Figura S3.
Correlación entre qPCR y 16S rRNA clonación y secuenciación
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s003 gratis (0.98 MB TIF)
figura S4.
La falta de correlación entre la edad del paciente y Firmicutes o Streptococcus abundancia
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s004 gratis (2.01 MB TIF)
Figura S5.
lavado Harsh no elimina las bacterias de las biopsias
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s005 gratis (1.90 MB TIF)
Tabla S1.
Novel phyltoypes
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s006 gratis (XLS 0.03 MB)
Tabla S2.
Especies estimación de la riqueza en diferentes muestras de biopsia
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s007 gratis (XLS 0.02 MB)
cuadro S3.
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s008 gratis (0.02 MB XLS)

• PLOS ONE: Enhanced M1 macrófago humano polarización en Helicobacter pylori asociada a gastritis atrófica y en Vacunados Mice
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