PLOS ONE: Bacterial Microbiota profils Gastrite sans Helicobacter pylori infection ou non-stéroïdiens anti-inflammatoires consommation de drogues

Résumé

16S récents gène de l'ARN ribosomique (ARNr) de profil moléculaire de la muqueuse de l'estomac ont révélé une complexité surprenante de la microflore. l'infection de Helicobacter pylori et médicament anti-inflammatoire non-stéroïdien (AINS) sont deux principaux contributeurs à la gastrite et de l'ulcère gastro-duodénal. Cependant, on sait peu sur l'association entre les autres membres de la microflore de l'estomac et des maladies gastriques. Dans cette étude, le clonage et le séquençage de l'ARNr 16S a été utilisé pour profiler la microflore de l'estomac chez des patients normaux et une gastrite. Cent trente-trois phylotypes de huit embranchements bactérienne ont été identifiés. Le microbiote de l'estomac a été trouvé à être scrupuleusement respectée à la muqueuse. Onze Streptococcus de les phylotypes ont été cultivées avec succès à partir des biopsies. Un à deux genres représentés à la majorité des clones au sein de l'un des embranchements identifié. Nous avons développé en outre deux tests de PCR quantitative en temps réel pour quantifier l'abondance relative du phylum Firmicutes et Streptococcus
genre. abondance significativement plus élevée du phylum Firmicutes et Streptococcus du genre dans le phylum Firmicutes a été observée chez les patients atteints de gastrite antrale, par rapport aux témoins normaux. Cette étude suggère que le niveau genre taxon peut largement représenter les taxons beaucoup plus élevés tels que le phylum. La pertinence clinique et le mécanisme qui sous-tend la composition du microbiote modifiée dans la gastrite nécessitent des études plus fonctionnels

Citation:. Li XX, Wong GL-H, Pour KF, Wong VW-S, Lai LH, Chow DK-L, et al. (2009) bactérienne Microbiota profils Gastrite sans Infection de Helicobacter pylori ou non-stéroïdiens anti-inflammatoires consommation de drogues. PLoS ONE 4 (11): e7985. doi: 10.1371 /journal.pone.0007985

Editeur: Niyaz Ahmed, Université de Hyderabad, en Inde

reçues: 4 Juin 2009; Accepté le 27 Octobre 2009; Publié le 24 Novembre, 2009

Droit d'auteur: © 2009 Li et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail est soutenu par l'Université chinoise de Hong Kong. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

Commensal microbiote est une partie intégrante d'un être humain [1]. La grande majorité des microbes habitent notre tractus gastro-intestinal, avec plus de 800 espèces de neuf bactérienne et un phyla Archaea. Ce microbiote diversifié contribue à maturation de l'intestin [2], [3], [4], la nutrition de l'hôte et la résistance aux pathogènes [5]. Microbes également interagir directement avec l'hôte humain en régulant la prolifération épithéliale intestinale, le stockage des graisses et des réponses inflammatoires [3], [6], [7]. Alors que certains microbes peuvent lui seul causer des maladies graves, de nombreuses maladies chroniques sont probablement dues à des perturbations de la microflore globale. Par exemple, les allergies et l'asthme sont liés à l'enfance l'utilisation d'antibiotiques qui peuvent modifier microbiote intestinal [8]. D'autres conditions associées à microbiote intestinal incluent l'autisme à début tardif [9], la maladie inflammatoire de l'intestin [10], et le cancer [11].

Traditionnellement, les méthodes à base de culture sont utilisés pour obtenir des souches microbiennes pour une caractérisation plus poussée. Ces études ont fourni la base de notre compréhension de la microbiologie. Cependant, la culture est souvent main-d'œuvre et peut échouer pour de nombreux microbes. L'observation microscopique est également utilisé pour estimer l'abondance des microbes, et dans une mesure limitée, attribue des microbes à des taxons [12]. Récemment, les profils de séquence génique 16S de l'ARN ribosomique (ARNr) sont utilisés pour élucider la diversité microbienne, souvent au niveau de la phylotype. Utilisation de 16S séquençage ARNr, les microbes de la bouche [13], [14], de l'œsophage [15], de l'estomac [16], l'intestin grêle [17], du côlon [18], [19] et le vagin [20] ont été étudiés. Ces études ont exploré la diversité microbienne dans le corps humain et a révélé une vaste population de microbes incultes et non caractérisées, qui avait été difficile à atteindre pour les méthodes basées sur culture. Grâce à ces séquençage à haut débit ARNr 16S et d'autres efforts de séquençage métagénomique, perturbations du microbiote se sont révélés être associés à la maladie parodontale [21] et de l'obésité [22], [23], [24].

Dans l'estomac , l'acidité gastrique tue de nombreux microbes ingérés. Il a été généralement considéré que l'estomac est pas inhabitables par un microbe jusqu'à la découverte de Helicobacter pylori
et son association avec la gastrite et de l'ulcère gastro-duodénal [25]. Autre que quelques autres Helicobacter
espèces [26], [27], [28], il n'a pas été prévu que l'estomac contiendrait beaucoup d'autres microbes vivants. Réduction de l'acidité due à une gastrite atrophique progressive peut augmenter la diversité microbienne [29]. Une étude réalisée par Monstein et al.
En utilisant du gel temporel gradient de température électrophorèse (TTGE) et une petite échelle séquençage 16S ARNr a suggéré d'autres microbes tels que Enterococcus
, Pseudomonas
, Streptococcus
, Staphylococcus
et Stomatococcus
étaient également présents dans l'estomac [30]. Une récente ARNr 16S effort plus grande échelle de séquençage a identifié 128 phylotypes de 8 embranchements chez 23 patients en Amérique du Nord [16]. Fait intéressant, la présence de H. pylori
dans l'estomac n'a pas affecté la composition globale du microbiote au niveau du phylum.

Dans cette étude, nous sommes allés plus loin pour étudier les liens potentiels entre les changements de microbiote de l'estomac et non H. pylori
et non-AINS (NHNN) gastrite. Nous avons supposé que lorsque H. pylori
est pas présent, d'autres groupes bactériens /espèces peuvent contribuer ou être associées au développement de la gastrite. Au niveau du microbiote, nous aimerions également aborder une question clé dans le domaine: à quel taxon profondeur (s) le microbiote apparaissent relativement stables tels que les perturbations à ces niveaux peuvent être pertinents pour la santé humaine? Nous avons utilisé ARNr 16S clonage de gènes et le séquençage au profil du microbiote de l'estomac de la normale et NHNN gastrite patients, et en temps réel de PCR quantitative (qPCR) dosages spécifiques du taxon de quantifier l'abondance relative du phylum Firmicutes et Streptococcus
genre.
<

arbre taxon analyse
h2> Résultats

Nous avons analysé les deux corps et antre des biopsies de 5 individus normaux et 5 NHNN individus gastrite antrale (toutes les femelles, appariés selon l'âge) . Tous les patients étaient H. pylori
négatif à la fois par test uréase rapide et le séquençage de l'ARNr 16S. Aucun des patients avait pris des AINS dans les 6 mois avant de subir une endoscopie. Au moins 60 clones de chaque biopsie (corps ou antrum, donc au moins 120 clones de chaque individu) ont été séquences en utilisant une large de gamme de produits 16S ARNr PCR. Un total de 1223 non H. séquences microbiennes de pylori ont été obtenus. Ces microbes appartiennent à 8 embranchements (133 phylotypes), dont 5 embranchements (Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteia, Fusobacteria et Proteobacteria) sont présents dans une grande majorité (1211 sur 1223, ou 99,0%). Neuf phylotypes avec similarité de séquence inférieure à 97% à des séquences présentes dans les bases de données publiques ont été identifiés. Six de ces 9 phylotypes étaient représentés par des clones individuels (tableau complémentaire S1).

Pour étudier la représentation globale des différents niveaux de taxon dans le biote de l'estomac, nous avons construit un arbre de taxon (Figure 1 et supplémentaire Figure S1). Fait intéressant, chaque phylum a été dominé par seulement un ou deux niveaux taxonomiques inférieurs (classe, ordre, famille ou genre). En fait, chaque phylum a été dominée par seulement 1-2 genres. Par exemple, Firmicutes les phylum les plus abondantes ont été représentés par 383 clones, de ces 333 clones sont de la classe des Bacilli. Par la suite, 273 clones étaient de l'ordre Lactobacillales. Deux cent cinquante quatre clones étaient de la famille Streptococcaceae. Et les 254 clones étaient du genre Streptococcus
. Les genres cinq plus commune, y compris (254 clones)
Streptococcus, Prevotella
(243), Neisseria
(175), Haemophilus
(122) , Porphyromonas
(68), constitué de 70,5% de tous les clones microbiens.

la richesse des espèces et de la diversité

Lorsque l'ensemble des données (1223 clones) a été utilisé, la couverture était bonne 96%, ce qui indique que quatre phylotypes supplémentaires seraient attendus pour 100 clones supplémentaires pour être séquencés. Ce taux de couverture a indiqué que la majorité des séquences bactériennes étaient présentes dans les clones séquencés. estimation de la diversité par EstimateS version 8.0 indique que environ 200 phylotypes peuvent être présents dans les échantillons de biopsie de l'estomac humain (supplémentaire Figure S2). Nous avons estimé plus la richesse des espèces dans quatre échantillons de biopsie différentes (NMA (Normal Antrum), NMB (Organe Normal), AGA (antrale Gastrite Antrum), AGB (antrale Gastrite corps); Tableau complémentaire S2). La richesse des espèces ne différait pas entre les biopsies de gastrite antrale et biopsies normales (p > 0,1, test t apparié)

de comparaison de microbiote bactérienne entre deux emplacements anatomiques différents (antre et du corps) chez les patients normaux
<. p> Dans les patients normaux, aucune différence significative n'a été observée entre les deux sites anatomiques (de antre et du corps) pour l'un des groupes de taxons, sauf pour la famille Prevotellaceae et le genre Prevotella
où les valeurs de p (chi de Pearson essai -carré) se situaient entre 0,01 à 0,05 (Figure 1).

Firmicutes phylum et Streptococcus du genre ont été enrichis de l'estomac des patients atteints de gastrite antrale

Basé sur le 1223 séquences ARNr 16S, le phylum Firmicutes était le phylum le plus abondant avec 383 clones. Le phylum Proteobacteria était une seconde près avec 345 clones. Fait intéressant, le phylum des Firmicutes est plus abondant dans les biopsies de gastrites antrales que dans les biopsies normales (41% vs. 22%, tableau 1), tandis que le phylum protéobactéries est plus abondant dans les biopsies normales (37% contre 20%). Depuis ARNr 16S séquençage est un coût prohibitif pour un plus grand échantillon, nous avons développé une quantitative en temps réel approche spécifique du taxon PCR (qPCR) pour quantifier l'abondance des Firmicutes et Streptococcus
(Figure 2). Les données qPCR spécifiques du taxon pour Firmicutes étaient fortement corrélées avec les données de séquençage de l'ARNr 16S pour les susdits 20 échantillons de biopsie (2 biopsies pour chacun des 5 normal et 5 patients antrale gastrite) (Figure complémentaire S3).

Dix-sept autres paires d'échantillons de biopsie antre et du corps des patients normaux et 18 paires supplémentaires d'échantillons de biopsie antre et du corps de patients atteints de gastrite antrale ont été analysés par qPCR Firmicutes spécifique. Au total, 90 biopsies (46 échantillons provenant de patients atteints de gastrite 23 antraux et 44 échantillons provenant de 22 patients normaux) ont été analysés (tableau 2). L'âge moyen des patients atteints de gastrite antrale était de 67,6 ± 11,4 (médiane: 69, plage: 46-86), tandis que l'âge moyen des commandes était de 58,3 ± 14,7 (médiane: 52, plage: 40 à 87). L'âge moyen du groupe normal était plus jeune que celle du groupe de gastrite antrale. Mais l'analyse statistique a montré qu'il n'y avait pas de corrélation entre l'âge et Firmicutes ou Streptococcus abondance (p > 0,1) (Figure supplémentaire S4). Ces échantillons ont été divisés en 4 groupes, antrale gastrite antrale (AGA), le corps antrale gastrite (AGB), antre normale (NMA), et le corps normale (NMB). L'abondance des Firmicutes était significativement plus élevée chez AGA que dans NmA ou NMB (One-way ANOVA (analyse de variance) test, p = 0,004 et p = 0,046, respectivement) et AGB que dans NmA (aller ANOVA, p = 0,039 ) (figure 3A). Aucune différence significative n'a été observée entre AGA et AGB (aller ANOVA, p = 0,855), ou NmA et NMB (p = 0,832).

Pour les mêmes échantillons de biopsie, le genre Streptococcus
a également été analysé par qPCR spécifique de
Streptococcus. Streptococcus l'abondance était de 72% et 76% plus élevé chez AGA vs NmA ou NmB, respectivement, et 66% et 70% plus élevé en AGB vs. NmA ou NmB, respectivement (figure 3B). Les valeurs p pour ANOVA sont présentés sur la figure 3B. Comme pour le dosage des Firmicutes, aucune différence significative n'a été observée entre AGA et AGB (aller ANOVA, p = 0,999), ou NmA et NMB (p = 0,999).

Streptococcus la culture et biopsie lavage

la simple détection de séquences de gènes ARNr 16S ne signifie pas que des bactéries vivantes sont présents ou les bactéries sont en effet résident au lieu de passants dans l'estomac. Nous avons donc procédé à deux expériences supplémentaires.

Tout d'abord, nous avons essayé la culture de bactéries à partir des biopsies. Une condition de culture approprié pour Streptococcus
a été utilisé car ils semblaient être sur-représentés chez les patients de gastrite antrale. Seize paires (corps et antre) des biopsies ont été utilisés pour la culture sur les plaques de gélose au sang. Les colonies ont été séquencés pour le gène ARNr 16S pour l'identification. Onze phylotypes de Streptococcus
ont été isolés (tableau S3 supplémentaire). Ces 11 phylotypes constituaient 93,3% (ou 237 sur les 254 clones) de tous les clones identifiés dans le séquençage à large gamme ARNr 16S, ce qui indique que la majorité des Streptococcus de les phylotypes sont vivants dans les biopsies gastriques.

en second lieu, les 14 échantillons de biopsie provenant à la fois des gastrites antrales, et les patients normaux ont été lavés dans du tampon phosphate salin (PBS) avec trois conditions plus sévères. Si les conditions de lavage difficiles ne suppriment pas les bactéries de la biopsie, il suggère que ces bactéries attachent étroitement à la muqueuse de l'estomac. Plus de 90% des bactéries totales est resté attaché aux biopsies après trois lavages consécutifs avec des conditions plus sévères (complémentaire Figure S5A). La dernière étape de lavage a été fait sur une puissance élevée sur une machine de bureau de vortex. De même, la majorité des Les bactéries Streptococcus de resté attaché aux biopsies après les 3 étapes de lavage (supplémentaire Figure S5B).

Discussion

Dans cette étude, nous avons analysé la microbiote bactérienne dans les biopsies gastriques appariées (antre et du corps) de patients atteints de gastrite normaux et antraux. Tous les patients sont H. pylori
négatif et sans utilisation d'AINS. Grâce à une large gamme ARNr 16S séquençage des gènes, nous avons identifié 1223 non H pylori
bactéries clones, similaire à une précédente étude (étude Bik, 1056 non H pylori
bactéries clones) [16 ]. Bien que les deux études ont analysé deux géographiquement (Hong Kong par rapport à la Californie) et ethnique (chinoise vs Caucasien, les Hispaniques et les Afro-américains) populations divergentes, de la complexité globale du microbiote sont étonnamment semblables (tableau 3). Les deux études ont identifié environ 130 (133 et 127 pour cela, et l'étude Bik, respectivement) phylotypes sept à huit embranchements. La majorité des clones (77,4% de cette étude et 79,8% des études Bik) ont été partagés. Les deux genres les plus abondants ( Streptococcus
et Prevotella
) étaient également identiques. Ces deux genres représentaient 40,6% et 41,5% de tous les clones de cette étude et l'étude Bik. Les deux études ont indiqué qu'environ 200 phylotypes différents peuvent être présents dans la muqueuse de l'estomac. Une telle similitude considérable entre les deux études met en évidence la pression sélective pour le microbiote dans l'environnement de l'estomac sévère. De plus, nous avons trouvé peu de différence dans microbiote bactérienne entre les deux sites anatomiques (de antre et du corps) chez les patients normaux, en dépit de la pertinence clinique pour les biopsies à différents sites anatomiques [31].

Étant donné que les étapes de lavage rigoureuses étaient pas en mesure de séparer le microbiote des biopsies, nous émettons l'hypothèse que la majorité des bactéries identifiées sont associées étroitement avec la muqueuse de l'estomac. De plus, nous avons été en mesure de cultiver majorité de la Streptococcus de les phylotypes identifiés grâce à une large gamme ARNr 16S séquençage, ce qui suggère que ces bactéries peuvent en effet être de vrais habitants de la muqueuse de l'estomac.

Pour apprécier encore la complexité globale du microbiote de l'estomac, nous avons construit un arbre de taxon basé sur les clones identifiés à se pencher sur chaque niveau de taxon y compris phylum, classe, ordre, famille et genre. Chose intéressante, on a trouvé que, pour chaque embranchement, un ou deux genres sont principalement présents. Les genres cinq plus commune, y compris (phylum Firmicutes)
Streptococcus, Prevotella
et (Bacteroidetes)
Porphyromonas, ainsi que Neisseria
et Haemophilus
(Proteobacteria), constitué de 70,5% de tous les clones microbiens.

Fait intéressant, le profilage ARNr 16S a révélé une surreprésentation importante du phylum Firmicutes (principalement en raison de la sur-représentation de la Streptococcus du genre dans le phylum) et une sous-représentation du phylum Proteobacteria dans les biopsies de patients atteints de gastrite antrale. Nous avons développé une approche qPCR spécifique du taxon pour analyser l'abondance des Firmicutes et streptococcus
taxa pour 90 biopsies (46 échantillons provenant de 23 patients atteints de gastrite antrale et 44 échantillons provenant de 22 patients normaux) et a confirmé la surreprésentation des ces deux taxons dans antrale gastrite estomac de 42% et 71%, respectivement. La plupart des Streptococcus de les phylotypes identifiés par séquençage étaient les bactéries alpha-hémolytiques qui sont des agents pathogènes potentiels (par exemple Streptococcus pneumoniae
, Streptococcus mitis
et Streptococcus salivarius
). Certains Les espèces Streptococcus de sont résistantes à des conditions de faible pH et peuvent survivre dans l'estomac [32]. Notre expérience des données de culture et laver a également suggéré que ceux-ci étaient en effet vivant, biote dans l'estomac.

Si l'augmentation de la Streptococcus l'abondance est responsable pour la gastrite antrale ou en raison du changement environnemental local en raison de la gastrite antrale est restée sans réponse. Une approche possible est d'utiliser le modèle de la souris sans germes [33]. Une autre question intéressante est que si certaines compositions de microbiote protéger, ou encore, de sensibiliser la muqueuse de l'estomac d'agents pathogènes envahisseurs tels que H. pylori
. Enfin, les nouvelles technologies de séquençage à haut débit sont susceptibles de fournir des données plus complètes sur microbiote de différents endroits anatomiques le long du tube digestif humain et à différents points de temps [34].

Matériaux et méthodes

gastriques échantillons de biopsie

Cette étude a été approuvée par l'Université chinoise de Hong Kong du comité d'éthique de la recherche clinique. Tous les patients ont donné leur consentement éclairé écrit pour obtenir les échantillons d'étude. Deux biopsies de la muqueuse gastrique (de antre et du corps de l'estomac) ont été recueillies auprès de chaque patient au cours de l'endoscopie de routine à l'hôpital Prince of Wales, Hong Kong. Pour éviter toute contamination, une nouvelle pince d'endoscopie stérilisées a été utilisé lors de la prise d'une seconde biopsie du même patient. Les biopsies étaient snap-congelés sur glace sèche et conservés à -80 ° C. Les patients qui prennent des antibiotiques ou des AINS (définis comme toute utilisation d'AINS pendant au moins une semaine au cours des 3 derniers mois avant l'endoscopie) ou testés positifs pour H. pylori
par test rapide à l'uréase (RUT) ou un test histologique ont été exclus. la démographie des patients est présentée dans le tableau 2.

Construction de bibliothèques de clones ARNr 16S et séquençage

L'ADN génomique total a été isolé à partir des biopsies en utilisant le kit ADN mini-(Qiagen, Valencia, CA, USA ) avec le verre battement procédé de battage comme décrit précédemment [16]. Deux contrôles négatifs avec seulement de l'eau stérile ont également été extraits en utilisant le même protocole. Les concentrations d'ADN extraites ont été mesurées par NanoDrop 1000 spectrophotomètre (Thermo Scientific, Minneapolis, MN, USA). Deux universel 16S ARNr amorces, B8F20 [35] (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') et B806R20 [36] (5'- GGACTACCAGGGTATCTAAT-3') ont été utilisées pour amplifier la région correspondant à la position 8-806 de gène ARNr 16S de Escherichia coli. Les 25 mélanges ul de PCR comprenaient un tampon 1 x PCR comprenant MgCl 1,5 mM _{2 (Qiagen), 20 mM de chlorure de tétraméthylammonium, 0,1 mM de chaque dNTP, 0,4 uM de chaque amorce, 1 unité de HotStar Taq DNA polymerase (Qiagen), et 2 ul d'ADN extrait. Une PCR trente-cycle a été réalisée pour amplifier le fragment de 799 pb. Les produits de PCR ont été vérifiés par électrophorèse sur gel d'agarose. Pour chaque produit, une seule bande a pu être observé sous la lumière UV, alors qu'aucune bande a été observée pour les contrôles négatifs. Les produits ARNr 16S ont été purifiés avec Sephadex colonne G-50 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ligaturé avec T vecteurs et transformé en E. coli
cellules JM109 en utilisant le système de vecteur facile pGEM-T (Promega, Madison, WI, USA). Nous avons sélectionné 5 patients (10 échantillons de biopsie) avec la gastrite antrale et 5 témoins normaux (10 échantillons de biopsie) pour construire 20 16S banques de gènes ARNr. Pour chaque bibliothèque de biopsie gastrique, d'au moins 60 colonies ont été sélectionnées pour le séquençage. Les produits de PCR ont été séquences en utilisant BigDye terminateur v3.1 kit de séquençage de cycle (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Les réactions de séquençage utilisant B8F20 comme l'amorce de séquençage ont été effectuées sur un séquenceur ABI 3730xl (Applied Biosystems)}

L'analyse phylogénétique et de la diversité microbienne estimation

Le test chimérique en utilisant le serveur Bellerophon (http.: //foo.maths.uq.edu.au/~huber/bellerophon.pl) [37] a été utilisé pour tester des séquences chimères potentielles. Un clone a été trouvé pour être chimérique, puis exclue. Ensuite, les séquences non chimérique 1223 ont été analysées par RDP II (base de données du projet ribosomique II) classificateur (http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp) sur la base d'un classificateur bayésien naïf ARNr [38]. Outil de base locale de recherche d'alignement (BLAST) fournies par Green Genes (http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-blast_interface.cgi) a été effectuée pour trouver les séquences les plus similaires dans la base de données. Nous avons utilisé une identité de séquence de 97% comme le seuil pour phylotypes définissant [39]. Sequences avec identité < 97% aux séquences existantes dans la base de données ont été considérées comme nouvelles. L'arbre de taxon a été construit en utilisant le résultat de classification du classificateur SPR II. estimateur Chao1 du EstimateS 8 programme (http://viceroy.eeb.uconn.edu/estimates) a été utilisé pour estimer la diversité microbienne. La méthode de bonne été utilisée pour calculer la couverture de séquençage [40].

PCR quantitative (qPCR)

amorces et sondes Q-PCR en temps réel ont été conçues à partir des séquences obtenues à partir des bibliothèques de clones. Nous avons d'abord aligné toutes les séquences clonées par ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) avec les paramètres par défaut. Les amorces ont été qPCR B8F20 et B801R21 (5'- ACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3 '). Les séquences de sondes MGB sont: sonde générique (VIC) 5'CAGCAGCCGCGGTAA-3 ', la sonde Firmicutes (FAM) 5'AAGATTCCCTACTGCTGCCT-3' et Streptococcus la sonde (FAM) 5'TACACATGGAATTCCAC-3 ' . Pour mesurer l'abondance d'un taxon spécifique, deux sondes (une spécifiques pour le taxon d'intérêt et le second générique pour toutes les bactéries) ont été utilisés dans le même amplicon PCR. (Figure 2). Le mélange 25 ul de PCR comprenait 1 x tampon A mM MgCl 3,5 _{2, 200 uM de dNTP avec du dUTP au lieu de dTTP, 400 nM de chaque amorce, 100 nM de chaque sonde, 0,01 U /ul uracile-N-glycosylase, et 0,05 U /ul TaqGold (Applied Biosystems). Pour le dosage Firmicutes spécifique, la condition de vélo était: 1) 50 ° C pendant 2 minutes; 2) 95 ° C pendant 10 min; 3) 40 cycles de 95 ° C pendant 20 s, 58 ° C pendant 15 s, 70 ° C pendant 80 sec. Pour le test spécifique de Streptococcus, la condition de vélo était: 1) 50 ° C pendant 2 minutes; 2) 95 ° C pendant 10 min; 3) 40 cycles de 95 ° C pendant 20 s, 57 ° C pendant 1 min, 70 ° C pendant 1 min. Le 16S ARNr le fragment de Streptococcus (DQ346438) cloné dans le vecteur facile pGEM-T a été utilisé comme standard pour qPCR (tant pour les Firmicutes et les Streptococcus
essais) dans le ABI 7500 réel système PCR -temps (Applied Biosystems). En raison de une légère différence entre les sondes génériques et spécifiques du taxon, le cycle delta de seuil delta (DDCT) a été utilisé pour indiquer l'abondance du taxon spécifique dans l'ensemble de la population de bactéries (Ct TSU:. Ct de sonde spécifique de taxon échantillons inconnus, Ct BUU: Ct de sonde universelle bactérienne à partir d'échantillons inconnus, Ct TSS: Ct du taxon sonde spécifique de la norme plasmidique, Ct BSS: Ct de sonde universelle bactérienne de la norme plasmidique)}

Théoriquement, l'abondance d'un taxon est 2 ^-ddCt.

Culture de
Streptococcus

Nous avons obtenu 32 biopsies supplémentaires à partir de 16 patients culture bactérienne. Les biopsies ont été mis en tampon phosphate salin (PBS, pH = 7,2) et découpés en petits morceaux par un scalpel. Les échantillons ont ensuite été étalées sur des plaques de gélose au sang (CM331, Oxoid, Basingstoke, Royaume-Uni) avec 5% de sang de cheval. Les plaques ont été placées dans un 5% de CO _{2 incubateur à 37 ° C pendant 24 heures. Les colonies avec hémolyse sur la gélose au sang ont été prélevés pour le séquençage de l'ARNr 16S.}

Biopsy laver

Pour le test de biopsie de lavage, 14 échantillons supplémentaires des deux patients atteints de gastrite antraux et les gens normaux ont été recueillies. Chaque échantillon a été placé dans un tube de 2,0 ml et lavé 3 fois (200 pi PBS pour chaque lavage) dans des conditions de plus en plus difficiles. Le premier lavage a été fait par une agitation à la main douce. Le surnageant a été transféré. Nouveau PBS a été ajouté aux biopsies pour un lavage supplémentaire. Pour les deuxième et troisième lavage, les tubes ont été vortexés par le mélangeur de tube Trio TM-2F (All-laboratoire scientifique, UA) au grade 3 et 6 respectivement le niveau de puissance, ce qui correspond à peu près à tourbillonnement doux et vigoureux. Puis PCR duplex en temps réel a été réalisée pour tester les bactéries totales et Les quantités Streptococcus de dans les surnageants PBS des trois étapes de lavage et les biopsies lavées.

Statistiques d'analyse

le test du chi carré de Pearson a été utilisé pour comparer les numéros de clone de taxons différents entre les groupes d'échantillons différents (NMA: antrum normal, NmB: corps normal, AGA: antrale gastrite antrale, AGB: corps de gastrite antrale) à partir du résultat de séquençage de l'ARNr 16S, lorsque le numéro de clone pour chaque groupe d'échantillons était au moins 10. test ANOVA a été utilisée pour comparer les données d'abondance bactériennes de qPCR essais. Toutes les analyses ont été effectuées en utilisant SPSS pour Windows, version 11.5 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). P < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Pour comparer la richesse des espèces entre les patients gastrite normaux et antraux, le nombre de phylotype réelle pour chaque patient a été compté en premier. t-test non apparié a ensuite été utilisé pour comparer les deux groupes de patients.

Informations complémentaires
Figure S1.
détaillée arbre taxon
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s001
(2.00 MB TIF)
Figure S2.
espèces estimation richesse
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s002
(0,97 MB TIF)
Figure S3.
Corrélation entre qPCR et 16S ARNr clonage et le séquençage
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s003
(0,98 MB TIF)
Figure S4.
Le manque de corrélation entre l'âge du patient et de Firmicutes ou Streptococcus abondance
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s004
(2.01 MB TIF)
Figure S5.
laver Harsh ne supprime pas les bactéries à partir des biopsies
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s005
(1.90 MB TIF)
Tableau S1.
Novel phyltoypes
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s006
(0.03 MB XLS)
Tableau S2.
espèces estimation richesse dans les différents échantillons de biopsie
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s007
(0.02 MB XLS)
Tableau S3.
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s008
(0.02 MB XLS)

• PLOS ONE: Enhanced M1 Macrophage Polarisation dans Human Helicobacter pylori Associated atrophique Gastrite et Vaccinés Mice
• PLOS ONE: isocitrate déshydrogénase de Helicobacter pylori potentiellement Induit réponse immunitaire humorale chez les sujets atteints de la maladie ulcère peptique et Gastritis