PLOS ONE: En bekväm modell av svår, hög incidens autoimmun gastrit orsakad av polyklonala T-celler och utan störning av regulatoriska T Cells

Abstrakt

autoimmun gastrit resultat från fördelningen av T-cells-tolerans mot mag-H ^{+ /K + ATPas. Den gastriska H + /K + ATPas ansvarar för surgörning av magsaft och består av en α-subenhet (H /Ka) och en β-subenheten (H /Kβ). Här visar vi att CD4 + T-celler från H /Ka-brist möss (H /Ka - /-) är högpatogen och autoimmun gastrit kan induceras i subletalt bestrålas vildtyp möss genom adoptiv överföring av ofraktionerat CD4 + T-celler från H /Ka - /- möss. Alla mottagande möss utvecklade konsekvent den allvarligaste formen av autoimmun gastrit 8 veckor efter överföringen, med hypertrofi av magslemhinnan, fullständig utarmning av parietala och zymogena celler, och närvaron av autoantikroppar mot H + /K + ATPas i serum. Dessutom är vi visat att sjukdomen påverkas betydligt magen vikt och magen pH av mottagande möss. Utarmning av parietalceller i denna sjukdomsmodell krävs närvaro av både H /Ka och H /Kβ sedan överföring av H /Ka - /- CD4 + T-celler resulterade inte i utarmning av parietalceller i H /Ka - /- eller H /Kβ - /- mottagande möss. Konsistensen på sjukdomens svårighetsgrad, användning av polyklonala T-celler och en specifik T-cellsvar till gastric autoantigen gör detta till en idealisk modell sjukdom för att studera många aspekter av organspecifik autoimmunitet inklusive förebyggande och behandling av sjukdomen.}

Citation: Tu E, Ang DKY, Hogan TV, läsa S, Chia CPZ, Gleeson PA, et al. (2011) En bekväm modell av svår, hög incidens autoimmun gastrit orsakad av polyklonala T-celler och utan störning av regulatoriska T-celler. PLoS ONE 6 (11): e27153. doi: 10.1371 /journal.pone.0027153

Redaktör: Ciriaco A. Piccirillo, McGill University Health Center, Kanada

Mottagna: 21 januari 2011. Accepteras: 11 oktober 2011; Publicerad: 9 november 2011

Copyright: © 2011 Tu et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av forskningsanslag från National Health och Medical Research Council of Australia och University of Melbourne. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen. Författarna kan bekräfta att Simon Läs var vid University of Melbourne när denna studie var avslutats och att Novo Nordisk är hans nuvarande adress. Författarna har förklarat inga konkurrerande intressen finns.

Introduktion

Autoimmun gastrit är ett utmärkt system för att undersöka förlusten av T-celltolerans till själv vävnader eftersom det är en väl karakteriserad autoimmun sjukdom med en känd målantigen och musmodell av sjukdomen har många likheter med den mänskliga motsvarigheten. Perniciös anemi, slutstadiet av autoimmun gastrit, har en beräknad prevalens av 1,9% i Väst vuxna befolkningen är äldre än 60 år [1], som representerar den vanligaste orsaken till vitamin B _{12 brist hos äldre [2] . Autoimmun gastrit terar infiltrering av mononukleära celler i submucosa vilket sträcker sig in i magslemhinnan, utarmning av gastriskt parietal och zymogena celler och hypertrofi i magslemhinnan [1].}

målantigen vid autoimmun gastrit har identifierats som mag H ^{+ /K + ATPas uttrycks av magsäckens parietalceller [3] - [5]. Den gastriska H + /K + ATPas är ett membranprotonpump som ansvarar för den försurning av magsaft och det är en heterodimer som består av en katalytisk α-subenhet (H /Ka) och ett glykoprotein β-subenheten (H /Kβ). Tidigare studier har visat att både H /Ka och H /Kβ är riktade i autoimmun gastrit [4], [6] - [8]. Det är väl dokumenterat att, i både möss och människor, CD4 + T-celler som känner igen gastric H + /K + ATPas initiera autoimmun gastrit medan CD8 + T-celler och B-celler är ineffektiv i att göra så [7] - [17]. Ändå efter initiering av sjukdomen, autoantikroppar mot H + /K + ATPas produceras och är ett mycket användbart diagnostiskt verktyg av sjukdomen trots att de inte är patogena [3], [16], [18 ].}

BALB /c-möss har visat sig vara den mest känsliga för lymfopeni-inducerad autoimmun gastrit med en incidens på 30-90% [19], [20]. Sjukdomen kan framkallas genom tymektomi av 3 dagar gamla möss eller vuxen tymektomi i kombination med en enda dos av cyklofosfamid [19], [21]. Trots detta är det svårt att utvärdera terapeutiska effekterna av behandlingar som ges till thymectomised möss sedan ett spektrum av sjukdomens svårighetsgrad från mild till svår alltid iakttas och förekomsten varierar, således stora gruppstorlekar som krävs för att testa statistisk signifikans. Vidare operationen involverad och postoperativ underhåll av djur är tekniskt krävande. Autoimmun gastrit kan också induceras i BALB /c-möss genom immunisering med renat gastriskt H ^{+ /K + ATPas [5]. Dock är sjukdomen reversibel efter avslutad immunisering och har en låg svårighetsgrad. Överföring av BALB /c-T-celler utarmat av regulatoriska T (Treg) celler i atymiska mottagande möss orsakar allvarlig autoimmun gastrit [15]. Det är därför omöjligt att dissekera förhållandet mellan autoreaktiva T-celler och Treg-celler under sjukdomsutvecklingen i den här inställningen eftersom Treg-celler är frånvarande.}

Hög förekomst av spontan autoimmun gastrit observeras i transgena möss som uttrycker en TCR specifik för H /Ka [8]. Emellertid inte dessa möss inte representera en idealisk modell sjukdom för alla experiment eftersom den monoklonala naturen hos de patogena T-celler inte rekapitulera det polyklonala svar som förekommer i patofysiologiska tillstånd.

Ur detta perspektiv vi utvecklat en sjukdomsmodell som förlitade sig på överföring av polyklonala T-celler från H /Ka-brist (H /Ka ^{- /-) möss i subletalt-bestrålade vildtyp möss. Vi visade att möss som fick ofraktionerade T-celler från H /Ka - /- möss alla dukade under för den allvarligaste autoimmun gastrit med patologiska förändringar som observerats i hela magen. Dessutom är dessa sjukliga förändringar som väsentligt påverkas fysiologi magen. Vi demonstrerade nyttan av denna modell genom att visa att var strikt beroende av närvaron av både H + /K + ATPas a- och p-subenheter utvecklingen av autoimmun gastrit i denna modell.}

Resultat

Förhöjda T- och B-cellssvar i H /Ka ^{- /- möss efter immunisering med H + /K + ATPas}

för att få ett system som är lämplig för studier av olika aspekter av autoimmunitet, har vi etablerat en sjukdomsmodell där sjukdomen orsakas av patogena polyklonala T-celler och sjukdomen svårighetsgrad är genomgående svår. En T-cell respons på H /Ka krävs för uppkomsten av autoimmun gastrit och kan vara den dominerande källan till gastric autoreaktiva epitoper [7], [8], [22]. Som T-cell tolerans mot H /Ka var osannolik i H /Ka ^{- /- möss, undersökte vi om T-celler som var specifika för H + /K + ATPas och som kan orsaka gastrit var närvarande i H /Ka - /-. möss}

för att avgöra om det var förhöjda immunsvar till H ^{+ /K + ATPas i H /Ka - /- möss i förhållande till vildtyp möss immuniserades möss två gånger med renat gastric H + /K + ATPas. Efter immuniseringen, var autoantikroppar specifika för H + /K + ATPas detekteras i den immuniserade H /Ka - /- möss, men inte i vildtyp-möss (Figur 1A). T-cellssvar till In vitro
stimulering med H + /K + ATPas var också signifikant större i H /Ka - /- möss än i vildtyp möss (Figur 1B). Därför, såsom tidigare har visats i H /Kβ - /- möss [23], finns det också en signifikant T- och B-cellsvar till H + /K + ATPas i H /Ka - /-. möss som inte förekommer i vildtyp möss}

CD4 ^{+ T-celler från H /Ka - /- möss var högpatogen}

För att bestämma om adoptiv överföring av T-celler från H /Ka ^{- /- möss skulle kunna orsaka autoimmun gastrit, berikat vi CD4 + T-celler från antingen H /Ka - /- eller vildtyp möss till -85 % renhet och överfördes 5 x 10 7 av dessa celler i subletalt bestrålade vildtyp möss. Eftersom det var tidigare visat att H + /K + ATPas-specifika CD4 + T-celler snabbt bort i periferin och oförmögen att inducera autoimmun gastrit i icke-bestrålade vildtyp möss [24], alla mottagande möss som användes i denna studie var lätt bestrålas vid 600 rad för att öka överlevnaden av överförda T-celler från H /Ka - /-. möss}

Åtta veckor efter överföringen, möss som fick H /Ka ^{- /- CD4 + T-celler utvecklas hela de allvarligaste formerna av autoimmun gastrit (skala 5 och 6). Detta visades genom hela utarmning av parietalcellerna och zymogena celler, och hypertrofi i magslemhinnan (Figur 2A, 2B). I kontrast, möss som erhöll vildtyp CD4 var helt fria från gastrit (figur 2A, 2B) + T-celler, vilket indikerade att autoimmun gastrit i möss som fick H /Ka - /- CD4 + T-celler orsakades inte av bestrålning i sig
, utan snarare cell inokulat T.}

Patologiska förändringar i magen av gastritic möss påverkade deras mage fysiologi avsevärt. Hypertrofi av magslemhinnan resulterade i utvidgningen av magen rugae (figur 2C) och en ökning av magen vikt (figur 2D). För det andra, utarmning av parietalceller orsakat en ökning av magen pH på grund av avsaknaden av syrasekretion (figur 2E). Dessutom autoantikroppar som är specifika för det gastriska H ^{+ /K + ATPas kunde detekteras i alla gastritic möss (Figur 2F). Autoantikroppar nått höga nivåer i alla möss 6 veckor efter överföringen (figur 2G). Tillsammans visade dessa resultat närvaron av högpatogen H + /K + ATPas-specifika T-celler i H /Ka - /-. Möss}

Autoimmun gastrit orsakades av CD4 ^{+ T-cellmedierad inflammation}

Möss med autoimmun gastrit framkallad genom överföring av H /Ka ^{- /- CD4 + T-celler hade betydligt fler celler i magen-dränerande paragastric lymfa noder jämfört med normala möss och möss som fick CD4 + T-celler från vildtyp donatorer. I motsats härtill fanns det ingen skillnad i storleken på den inguinal lymfkörtel mellan gastritic och icke-gastritic möss (figur 3A). Detta antydde att ökningen av cellularitet i paragastric lymfkörtlar i gastritic möss orsakades av den lokala gastric inflammation och inte genom preferentiell överlevnad eller expansion av H /Ka - /- CD4 + T-celler jämfört med vildtyp CD4 + T-celler efter överföring}

i dessa experiment, celler från donator H /Ka ^{-. /- eller vildtyp möss kunde skiljas från mottagarceller, eftersom de bar olika CD90-alleler. Donator befolkningen i paragastric lymfkörtel hos möss som fick H /Ka - /- CD4 + T-celler hade betydligt fler CD4 + T-celler med en effektor /minne fenotyp (CD44 hiCD62 lo) i jämförelse med möss som fick vildtyp CD4 + T-celler. Emellertid nivåerna av effektor /minnes-T-celler var liknande i den icke-dränerande lymfkörteln (figur 3B). Tillsammans utgör dessa resultat tyder på att utvecklingen av autoimmun gastrit hos möss som fick CD4 + T-celler från H /Ka - /- möss orsakades av en T-cellmedierad inflammatorisk reaktion i mag miljön snarare än en mer generell respons.}

utvecklingen av autoimmun gastrit i denna sjukdomsmodell förknippades inte med en lägre nivå av reglerande T (Treg) celler eftersom gastritic möss innehöll liknande proportioner av Treg-celler i paragastric lymfkörtel jämfört med icke -gastritic kontroller (Figur 4A, 4B). I själva verket var betydligt fler Treg-celler som finns i magen hos möss med autoimmun gastrit (Figur 4A, 4C) katalog

H /Ka ^{-. /- CD4 + T-celler snabbt inducerad vävnadsskada i magen}

Svårighetsgraden av autoimmun gastrit analyserades vid olika tidpunkter efter överföringen av H /Ka ^{- /- CD4 + T-celler. Måttlig utarmning av parietalcellerna och zymogena celler, vilket indikeras av en gastrit poäng av 4 [24], kunde observeras så tidigt som två veckor efter överföringen och sjukdomen fortskred snabbt med de flesta av mössen visar allvarlig gastrit, vilket framgår av en gastrit poäng 5 och 6, 4 veckor efter överföringen (Figur 5).}

Mage vikt kan användas som ett kvantitativt mått på autoimmun gastrit

Vi har visat att möss med autoimmun gastrit hade en större mage vikt än sjukdomsfria möss på grund av hypertrofi av magslemhinnan (figur 2D). Därför undersökte vi om magen vikt kunde användas som ett kvantitativt mått på svårighetsgraden av autoimmun gastrit. För att ytterligare testa om magen vikt kunde skilja mellan olika svårighetsgrader av autoimmun gastrit, undersökte vi neonatalt-thymectomised möss som ett större antal möss med poäng varierande sjukdom kunde erhållas. Vi fann att det fanns stora skillnader i medel magen vikt mellan vart och ett av de första fem nivåer av autoimmun gastrit (poäng 0-4) (Figur 6). Men den genomsnittliga magen vikter av gastrit betygsättning 4, 5 och 6 var inte signifikant skilda från varandra (Figur 6). Detta beror sannolikt på det faktum att graden av hypertrofi av magslemhinnan inte ökar allteftersom sjukdomen fortskrider till sena stadier

Induktion av autoimmun gastrit av H /Ka ^{-. /- CD4 + T-celler var beroende av närvaron av H /Ka och H /Kβ}

Vi hypotesen att patogeniciteten av CD4 ^{+ T-celler från H /Ka - /- möss orsakades av avsaknaden av tolerans mot H /Ka i frånvaro av detta gastrisk autoantigen. För att testa detta, var CD4 + T-celler överfördes från H /Ka - /- möss i subletalt-bestrålade H /Ka - /- och vildtyp möss. Det har visat sig att H /Ka, i frånvaro av H /Kβ kan inte presenteras av MHC-molekyler [25] (S Allen, personlig kommunikation). Vi överförs därför CD4 + T-celler från H /Ka - /- möss i subletalt-bestrålade H /Kβ - /- möss och jämfört dem med H /Ka - /- och vildtyp mottagarmöss. Analysen av autoimmuna attacken på magslemhinnan kompliceras i H /Ka - /- och H /Kβ - /- möss genom de förändringar som sker i magslemhinnan eftersom en brist på magsyra i dessa möss resulterar i förhöjda nivåer av trofiska hormonet gastrin. Detta leder till konstitutiv hypertrofi och utarmning av zymogena celler [26],. Därför, för att bedöma om en autoimmun reaktion angriper magslemhinnan i dessa möss, istället bestämde vi förekomsten av parietalceller, som normalt förbrukas i autoimmun gastrit men finns i överflöd i H /Ka - /- och H /Kβ - /- möss och även närvaron av gastric autoantikroppar}

magen morfologi i H /Ka ^{-. /- möss eller H /Kβ - /- möss påverkades inte av överlåtelsen av H /Ka - /- CD4 + T-celler (Figur 7A, 7B). I synnerhet finns det ingen utarmning av parietalcellerna indikerar avsaknaden av ett autoimmunt svar. Däremot var fullständig utarmning av parietalceller ses i vildtyp mottagarmöss som fick H /Ka - /- CD4 + T-celler (figur 7C). Eftersom magar av H /Ka - /- och H /Kβ - /- möss verkade skiljer sig både normala och gastritic möss, kunde vi inte bedöma dessa möss med hjälp av vår standard gastrit poängsystem. Men H + /K + ATPas-specifika autoantikroppar, ett annat kännetecken för autoimmun gastrit, inte upptäcktes i serum från både H /Ka - /- och H /Kβ - /- mottagande möss, men upptäcktes i vildtyp mottagande möss (Figur 7D). Dessa resultat visade att närvaron av både a- och p-subenheter krävdes för utarmning av parietalceller av H /Ka - /-. CD4 + T-celler}

Diskussion

Autoimmun gastrit kan induceras i BALB /c-möss genom flera sätt, bland annat neonatal tymektomi, vuxen tymektomi med cyklofosfamid [19], [21], immunisering med gastric H ^{+ /K + ATPas [5] och generering av H + /K + ATPas-specifika TCR transgena möss [7], [8]. Emellertid inte ett immunsystemet som domineras av T-celler med en enda specificitet som observeras i TCR-transgena möss inte likna normala fysiologiska betingelser. Dessutom gör tymektomi och immunisering inte ger konsekvent sjukdomens svårighetsgrad och de är tekniskt krävande, vilket gör det besvärligt att använda dessa modeller för analys av immunterapier. Vi utvecklade därför en ny sjukdom modell som förlitade sig på överföring av T-celler från H /Ka - /-. Möss, en polyklonal population som innehöll mycket gastritogenic T-celler}

Vi fann att immunisering av H /Ka ^{- /- möss med renat H + /K + ATPas inducerade en kraftig T-cellsvar som ett resultat av bristen på T-celltolerans till mag autoantigen, som visade närvaro av H + /K + ATPas-specifika T-celler i H /Ka - /- möss. Vi visade vidare att överföring av CD4 + T-cellspopulationer från H /Ka - /- möss inducerade skador på magen vävnader hos mottagande möss snart efter överföringen. Autoimmun gastrit framkallad genom överföring av H /Ka - /- CD4 + T-celler var genomgående svår alla mottagande möss utvecklade den allvarligaste sjukdomen åtta veckor efter överföring och deras mage fysiologi signifikant påverkas indikeras av ökningen i magen vikt och pH. Denna modell är fördelaktigt eftersom svårighetsgraden och förekomsten av sjukdoms metoder som observerats i TCR transgena möss ännu orsakas av en polyklonal repertoar, är det tekniskt enkelt att fastställa det inte förlitar sig på störning av den normala Treg cellrepertoar.}

donatorcellpopulationen från H /Ka ^{- /- möss anrikades till -85% CD4 + T-celler genom ett förfarande "negativt urval" eftersom de stora Syftet med detta arbete var att producera en enkel , billigt och bekvämt sjukdomsmodell. Vi drar slutsatsen att det är CD4 + T-celler i ympen som orsakade autoimmun gastrit eftersom den har etablerat genom många studier som CD4 + T-celler och inte andra celltyper kan initiera autoimmun gastrit [7 ] - [17]. Det är tydligt att T- och B-cellpopulationer reaktiva till H + /K + ATPas är närvarande i repertoaren av normala möss [5], [14] - [16], [21], [24 ], [28] - [33]. Därför föreslår vi att H + /K + ATPas-specifika T- och B-celler från mottagaren sedan rekryteras till skadan och de mottagande härrörande B-celler är ansvariga för produktionen av autoantikroppar.}

Det har tidigare dokumenterat att CD4 ^{+ T-celler från H /Kβ - /- möss inducerar autoimmun gastrit i atymiska BALB /c-möss men inte i bestrålade vildtyp möss [24]. CD4 + T-celler från H /Ka - /- möss orsakade gastrit i bestrålade vildtyp möss tyder på att denna patientgrupp är mer patogena än CD4 + T-celler från H /Kβ - /- möss . Dessa data stöder en mer dominerande roll för immunsvar mot H /Ka i patogenesen av autoimmun gastrit, i linje med resultaten i TCR transgena möss [7], [8].}

Till skillnad från andra sjukdomsmodeller som används Treg cell -depleted polyklonala T-celler från vildtyp möss för att inducera autoimmunitet [15], var det inte nödvändigt att avlägsna Treg-celler från H /Ka ^{- /- CD4 + T-cellpopulationen för induktion av svår autoimmun gastrit. Vidare utveckling av autoimmun gastrit i de mottagande mössen inte orsakas av en lägre nivå av Treg-celler från givaren befolkningen sedan gastritic möss innehöll lika stor andel av Treg-celler i paragastric lymfkörtel jämfört med icke-gastritic kontroller. Vi har tidigare visat att Treg-celler från H /Ka - /- möss var lika effektiva som tregs celler från vildtyp möss undertrycka H /Ka-specifika autoreaktiva T-celler [34]. Därför, våra resultat här stödjer tidigare arbete tyder på att T-cell-repertoarer som inte hade genomgått perifer cell radering T inte kan undertryckas av den normala Treg cellpopulationen [24], [35].}

Även om en normal nivå av Treg-celler detekterades i paragastric lymfkörtel av gastritic möss, och en betydligt högre andel av Treg celler hittades i magen hos gastritic möss jämfört med normala möss, Treg celler var inte i stånd att förhindra eller undertrycka sjukdom. Detta överensstämmer med upptäckten att även om Treg celler ackumuleras i CNS när experimentell allergisk encefalomyelit utlöstes [36], var de inte i stånd att förhindra expansionen och funktion av myelin oligodendrocyt-glykoprotein-specifika T-celler, eftersom den lokala inflammatoriska cytokinet milieu återges patogena T-celler som är resistenta mot Treg undertryckande.

Utarmning av parietalceller är ett kännetecken för autoimmun gastrit och det främsta skälet att perniciös anemi är en livshotande sjukdom eftersom parietala celler producerar inre faktor, av vilka en är fatal brist . Vi fann att utarmning av parietalceller i denna sjukdomsmodell var beroende av närvaron av både H ^{+ /K + ATPas subenheter som CD4 + T-celler från H /Ka - /- möss endast inducerad parietalcellens utarmning i vildtyp möss men inte i H /Ka - /- och H /Kβ - /- möss. Parietalcellens utarmning orsakades inte av T-cellsvar mot H /Kβ sedan H /Ka - /- CD4 + T-celler inducerade inte parietalcellens utarmning i H /Ka - /- mottagarmöss medan H /Kβ uttrycktes i dessa möss [26]. Å andra sidan, avsaknad av parietalcellens utarmning i H /Kβ - /- mottagarmöss som fick H /Ka - /- CD4 + T-celler förstärkt våra tidigare studier tyder på behovet av H /Kβ för att H /Ka som presenteras av MHC-molekyler [22]. Tillsammans föreslår dessa resultat som parietalcellens utarmning i denna överföring modell som utvecklats som en följd av immunsvar mot H /Ka av CD4 + T-celler från H /Ka - /- möss. Vi noterar att vi i tidigare arbeten har funnit att parietalcellerna inte utarmat på antingen H /Ka - /- eller H /Kβ - /- möss efter neonatal tymektomi, som belyser konsekvensen av denna nya modell med resultat från detta tidigare, väl etablerad modell.}

Vi visade också här att magen vikt kan användas som ett kvantitativt mått på svårighetsgraden sjukdomen sedan hypertrofi av magslemhinnan observerades hos möss med autoimmun gastrit och resulterade i ökningen av magen vikt [37]. Det fanns en signifikant korrelation mellan magen vikt och svårighetsgraden av autoimmun gastrit hos möss som erhöll H /Ka ^{- /- CD4 + T-celler. Detta samband bekräftades ytterligare i neonatalt-thymectomised möss, med medel magen vikt i varje gastrit poäng är betydligt annorlunda än en annan. Men på grund av variationen inom grupperna, stora provstorleken kommer att krävas om magen vikt är att användas för att beräkna sjukdomens svårighetsgrad. Därför kan histologisk undersökning i kombination med magen vikt ses som kompletterande åtgärder för att bedöma svårighetsgraden av autoimmun gastrit}

Vi visade att autoimmun gastrit inducerad av adoptiv överföring av H /Ka ^{-. /- CD4 + T-celler representerade en utmärkt modell sjukdom för dissektion av autoimmunsvar och utformningen av interventionistiska terapier för autoimmuna sjukdomar. I denna sjukdomsmodell, var autoimmun gastrit som orsakas av en ofraktionerat polyklonal T-cellpopulation som innehöll patogena T-celler specifika för en enda antigen, och konsekvent hög kvalitet sjukdomens svårighetsgrad observeras i alla mottagande möss. Dessutom visade vi att sjukdomens svårighetsgrad kan lätt bestämmas genom magen vikt, mage pH och histologisk undersökning av magen avsnitt.}

Material och metoder

Etik uttalande

Detta arbete syftar för att få en mer detaljerad kunskap om autoimmuna sjukdomar och immunologiska mekanismer som förhindrar autoimmunitet i normala individer. Eftersom immunsystemet är ett mycket komplext, integrerat nätverk, djuren krävs för att korrekt bedöma dessa frågor.

De flesta av förfarandena var kliniska tester som utförs på blod- och vävnadsprover tagna från möss som hålls i utmärkt boendeförhållanden . Möss övervakas noggrant och dödas om hårt drabbade eller upprörd. Vid slutet av varje experiment dödades mössen genom CO2-kvävning eller cervikal luxation, som är förknippade med ett minimum av obehag.

Alla experiment planeras noggrant för att minska antalet djur och genomförs i strikt följsamhet till riktlinjer dikt av University of Melbourne djurförsöks etiska kommittén; förhindrande av djurplågeri Act 1986; och NHMRC /CSIRO /AAC australiska kodex för vård och användning av djur för vetenskapliga ändamål (1997).

Detta arbete godkändes av University of Melbourne djuretik kommittén enligt projektnummer 0.706.327,3.

Möss

BALB /cCrSlc [38], BALB /cCrSlc.CD90.1 kongena, H /Ka ^{- /- [26], H /Kβ - /- [ ,,,0],27] och BALB.B6- Gasa
kongena möss [20] har tidigare beskrivits. Både H /Ka - /- och H /Kβ - /- möss hade korsades större än 10 gånger till BALB /cCrSlc. H /Ka - /- möss korsades till BALB /c.CD90.1 möss för att generera H /Ka - /-. CD90.1 möss. Samtliga möss hölls i en konventionell djuranläggning vid Bio21 Molekylär vetenskap och bioteknik Institute, University of Melbourne. Alla möss och experiment godkändes av University of Melbourne djurförsöksetisk nämnd.}

Antikroppar och flödescytometrisk analys

Anti-CD3-FITC (145-2C11), anti-CD90.1- FITC (HIS51), anti-CD90.2-FITC (30H-12), anti-CD62L-PE (MEL-14), anti-CD4 PerCP (RM4-5), och anti-CD8-APC (53-6,7) köptes från BD Pharmingen; anti-CD44-APC (IM-7) köptes från eBioscience. Intracellulär färgning av Foxp3 utfördes med användning av anti-Foxp3-APC (FJK-16S) och Foxp3 Staining Kit (eBioscience) enligt tillverkarens anvisningar. Flödescytometri utfördes på en Becton Dickinson FACSort flödescytometer och analyserades med användning av Cellquest Pro mjukvara eller Beckman Coulter cyan och analyserades med användning Summit programvara.

Analys av T-cellsvar i möss immuniserade med H + /K + ATPas

Renat gris gastric H ^{+ /K + ATPas framställdes i ett 1:01 förhållande med Freunds kompletta adjuvans (Life Technologies). Möss injicerades subkutant i varje sida av svansen bas. H /Ka - /- och BALB /cCrSlc möss immuniserades två gånger med 30 mikrogram av H + /K + ATPas, med en månads mellanrum mellan vaccinationer. En vecka efter den andra immuniseringen avlivades mössen för deras sera och inguinala lymfknutor. H + /K + ATPas-specifika autoantikroppar detekterades med ELISA. Celler från de inguinala lymfkörtlar användes i en T-cellsproliferationsanalys. 1 × 10 5-celler odlades under 72 timmar med 2 x 10 4 mjält DC från BALB /cCrSlc möss. T-cellproliferation bedömdes genom inkorporering av 3H-tymidin under de sista 16 timmarna av odlingen. T-celler odlades i triplikat med antingen DC med antigen (50 ^ g /ml mus gastric membran) eller med DC enbart. Gastric membran framställdes från mus magar som tidigare beskrivits [5]}

Induktion av autoimmun gastrit hos möss

CD4 ^{+ T-celler anrikades till >. 85% renhet från lymfkörtlar och mjältar av H /Ka - /- och BALB /cCrSlc möss. Enkelcellsuspensioner inkuberades i en blandning av F4 /80 och B220 hybridomsupernatanter plus anti-CD8-antikropp (53.6.72, BioXCell). De icke-CD4-celler avlägsnades med användning av anti-rått-IgG-belagda magnetiska pärlor (Dynal, Invitrogen). CD4 + (5 x 10 7) T-celler från antingen H /Ka - /- eller BALB /cCrSlc möss injicerades i subletalt bestrålade (600 rad) vildtyp kongena BALB /cCrSlc.CD90.1 möss via den intraperitoneala vägen. I vissa experiment, renat H /Ka - /- var CD4 + T-celler injiceras i bestrålade BALB /cCrSlc, H /Ka - /- och H /Kβ - /- möss. Alla mottagande möss bestrålades vid 600 rad en dag före T-cell överföring. Åtta veckor senare, var mottagande möss dödades och magar, lymfkörtlar och sera skördades.}

BALB /cCrSlc och BALB.B6- Gasa
kongena möss användes i tymektomi experiment. Neonatal tymektomi utfördes såsom tidigare beskrivits [20].

undersöktes med avseende på närvaron av patologiska förändringar Histologisk undersökning av magar och mätning av pH i magsäcken

Mage sektioner såsom beskrivits tidigare [24]. Scoring utfördes i en blint och varje objektglas var oberoende poängsätts av minst två personer. För att mäta magen pH mössen fasta över natten före avlivning. Magar skars öppna och sköljdes i en ml saltlösning som tillvaratogs och mäts med en pH-mätare.

H + /K + ATPas-specifik enzymkopplad immunsorbentanalys (ELISA) Review

En ELISA för att detektera H ^{+ /K + ATPas-specifika autoantikroppar utfördes med användning av renat gris H + /K + ATPas såsom tidigare beskrivits [29].}

Statistisk analys

Statistisk analys utfördes med användning av GraphPad Prism 5,0 (GraphPad). Data analyserades med användning av Mann-Whitney U-test eller Spearman korrelationstest och ett P-värde < 0,05 ansågs signifikant
.

• PLOS ONE: Gene expression profiling i magslemhinna från Helicobacter pylori-infekterade och oinfekterade patienter som genomgår kronisk ytlig gastrit
• PLOS ONE: Noggrannhet och brytvärden av pepsinogener I, II och Gastrin 17 för diagnos av Gastric Fundic Atrofi: Inverkan av gastrit