Ploche ONE: výhodná Model of Severe, vysoký výskyt autoimunitné gastritída spôsobená Polyklonálne Effector T bunky a bez rozrušenia regulačných T lymfocytov

abstraktné

Autoimunitné gastritída výsledky z havarovaných tolerancie T-buniek žalúdočnej H ^{+ /K + ATPázy. Žalúdočné H + /K + ATPázy je zodpovedný za okysleniu žalúdočnej šťavy a skladá sa z podjednotky (H /Ka) a beta podjednotky (H /Kβ). Tu ukazujeme, že CD4 + T buniek z H /Ka-deficitom myší (H /Ka - /-) sú vysoko patogénne a autoimunitné gastritída možno indukovať v subletálne ožiarené divokého typu myši tomu prenos nefrakcionovaného CD4 + T buniek z H /Ka - /- myší. Všetky myši sú príjemcami dôsledne vyvinula najzávažnejšie formu autoimunitné gastritídu 8 týždňov po prevode predstavovať hypertrofiu žalúdočnej sliznice, kompletné vyčerpanie parietálnych a zymogenního buniek a prítomnosť protilátok pre h + /K + ATPázy v sére. Ďalej sme preukázali, že toto ochorenie významne ovplyvnená žalúdka hmotnosť a žalúdočné pH recipientních myšou. Depléciu parietálnych buniek v tomto modeli ochorenia vyžaduje prítomnosť ako H /Ka a H /Kβ od prevodu H /Ka - /- CD4 + T-buniek neviedlo k vyčerpaniu parietálnych buniek v H /ka - /- alebo H /Kβ - /- príjemcu myšou. Konzistencia závažnosti ochorenia, použitie polyklonálne T buniek a špecifickú odpoveď T buniek na žalúdočné autoantigén, aby to ideálne modelu ochorenia pre štúdium mnohých aspektoch orgánovo špecifické autoimunity, vrátane prevencie a liečby ochorení.}

Citácia: Tú E, Ang vaka, Hogan TV, Čítať S, Chia CPZ, Gleeson PA, et al. (2011) výhodnú Model of Severe, vysoký výskyt autoimunitné gastritída spôsobená Polyklonálne Effector T bunky a bez rozrušenia regulačných T-buniek. PLoS ONE 6 (11): e27153. doi: 10,1371 /journal.pone.0027153

Editor: Ciriaco A. Piccirillo, McGill University Health Center, Kanada

prijatá: 21.januára 2011; Prijaté: 11.10.2011; Uverejnené: 09.11.2011

Copyright: © 2011 Tú et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bola podporená výskumnými granty z Národného zdravie a Rade pre lekársky výskum Austrálie a University of Melbourne. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

konkurenčnými záujmami :. Autori môžu potvrdiť, že Simon Read bol na University of Melbourne, keď táto štúdia bola dokončená a že Novo Nordisk je jeho súčasná adresa. Autori vyhlásili žiadne konkurenčné záujmy neexistujú.

Úvod

Autoimunitné gastritída je výborný systém vyšetrovať stratu T buniek tolerancia k self-tkanív, pretože je dobre charakterizovaného autoimunitné ochorenie s známy cieľový antigén a myší model ochorení má veľa podobností s ľudským ekvivalentom. Zhubnej anémie, koniec fázy autoimunitné gastritídy, má odhadovanú prevalenciu 1,9% v západnej dospelej populácie vo veku nad 60 rokov [1], čo predstavuje najčastejšou príčinou vitamínu B _{12 deficitu u starších ľudí [2] , Autoimunitná gastritída je možné infiltráciu mononukleárnych buniek v submukóze, ktorá zasahuje do žalúdočnej sliznice, vyčerpávanie parietálnej a zymogenní buniek a hypertrofia žalúdočnej sliznice [1].}

cieľový antigén v autoimunitné gastritída bola identifikovaná ako žalúdočné H ^{+ /k + ATPázy, vyjadrené žalúdočných parietálnych bunkách [3] - [5]. Žalúdočné H + /K + ATPázy, je membrána protónovej pumpy zodpovedný za okyslenie žalúdočnej šťavy, a to je heterodiméry, ktorý sa skladá z katalytickej podjednotky (H /Ka) a glykoproteín beta podjednotky (H /Kβ). Predchádzajúce štúdie preukázali, že obaja H /Ka a H /Kβ sú zamerané na autoimunitné gastritídu [4], [6] - [8]. Je dobre zdokumentované, že v oboch myší a človeka, CD4 + T bunky, ktoré rozpoznávajú žalúdočné H + /K + ATPázy, začne autoimunitné gastritídu, zatiaľ čo CD8 + T bunky a B bunky sú neúčinné v tom [7] - [17]. Avšak, po začatí ochorení, autoprotilátky proti H + /K + ATPázy sú vyrobené a sú veľmi užitočný nástroj pre diagnostiku ochorení, aj keď nie sú patogénne [3], [16], [18 ].}

Balb /c myši bolo preukázané, že je najviac náchylná k lymfopénia vyvolané autoimunitné gastritídu s výskytom 30-90% [19], [20]. Toto ochorenie môže byť indukovaná tymektómie 3 dní starých myší alebo dospelých tymektómie v kombinácii s jednou dávkou cyklofosfamidu [19], [21]. Aj cez to, že je ťažké posúdiť terapeutické účinky ošetrenia daných thymectomised myšou, pretože spektrum závažnosti ochorenia od miernej až ťažké je vždy pozorovaná, a incidencia je variabilný, teda veľké veľkosti skupín sú potrebné na testovanie štatistickej významnosti. Okrem toho je operácia zapojení a pooperačnej udržiavanie zvierat je technicky náročné. Autoimunitná gastritída môže byť tiež vyvolaná u myší Balb /c imunizáciou purifikovaným žalúdočnej H ^{+ /K + ATPázy, [5]. Avšak, toto ochorenie je reverzibilné po ukončení imunizácii a má nízku závažnosť. Prevod Balb /c T buniek vyčerpaných regulačných T (Treg) buniek do athymických myší prijímajúcich spôsobuje ťažkú ​​autoimunitné gastritídu [15]. Je preto nemožné, aby pitvať vzťah medzi autoreaktívnych T buniek a buniek Treg v priebehu vývoja ochorenia v tomto nastavení, pretože Treg chýbajú.}

Vysoký výskyt spontánnych autoimunitné gastritídy je pozorovaná u transgénnych myší exprimujúcich TCR špecifický pre H /Ka [8]. Avšak, tieto myši nepredstavujú model ideálny ochorenie pre všetky pokusy, pretože je monoklonálna povahu patogénnych T buniek nie je zhrnúť polyklonálnej odpoveď, ktorá sa vyskytuje v patofyziologických podmienok.

Z tohto pohľadu sme vyvinuli model choroby ktorý sa spoliehal na prenos polyklonálne T buniek z /Ka-deficitným (H /Ka ^{- /-) H myší do subletálne-ožiarených divokého typu myší. Preukázali sme, že myši, ktoré dostali nefrakcionovaného T bunky z H /Ka - /- myši všetko podľahol najzávažnejšie autoimunitné gastritída s patologickými zmenami pozorovanými v celom žalúdku. Okrem toho tieto patologické zmeny významne ovplyvnené fyziológiu žalúdka. Preukázali sme užitočnosť tohto modelu tým, že ukazuje, že rozvoj autoimunitné gastritídy v tomto modeli bolo prísne závislý na prítomnosti ako H + /K + ATPázy, a a p podjednotiek.}

Výsledky

Zvýšený T a reakcie B lymfocytov v H /Ka ^{- /- myší po imunizácii s H + /k + ATPázy}

, aby sme mali systém, ktorá je vhodná pre štúdium rôznych aspektov autoimunity, sme vytvorili model choroby, v ktorom je ochorenie spôsobené patogénnymi polyklonálne T buniek a na závažnosti ochorenia je stále závažnejšie. Reakcia T buniek na H /Ka je nutné pre nástup autoimunitné gastritídy a môže byť hlavným zdrojom žalúdočných autoreaktívnych epitopov [7], [8], [22]. Ako T tolerancia buniek na H /Ka bol nepravdepodobný v H /Ka ^{- /- myšou, sme skúmali, ak T-bunky, ktoré boli špecifické pre h + /K + ATPázy a schopná pôsobiť gastritída boli prítomné v H /Ka - /-. myšiach}

Ak chcete zistiť, či boli zvýšené imunitnú odpoveď na H ^{+ /k + ATPázy v H /Ka - /- myši v porovnaní s myšou divokého typu, boli myši dvakrát imunizovaní purifikovaným žalúdočnej H + /k + ATPázy. Po imunizáciu, protilátky špecifické pre H + /K + ATPázy bola detekovaná v imunizovaných H /Ka - /- myší, ale nie u myší divokého typu (obrázok 1A). T bunkovú odpoveď na in vitro
restimulaci s H + /K + ATPázy bola tiež významne vyššia u H /Ka - /- myší ako u divokého typu myší (obrázok 1b). Z tohto dôvodu, ako už bolo preukázané v H /Kβ - /- myší [23], je tiež významným T a B bunkovú odpoveď na H + /K + ATPázy v H /Ka - /-. myši, ktoré nie je k dispozícii v divokého typu myší}

CD4 ^{+ T buniek z H /Ka - /- myší boli vysoko patogénnej}

Ak chcete zistiť, či adoptívny transfer T buniek z H /Ka ^{- /- myši by mal byť schopný spôsobiť autoimunitná gastritídu, máme obohatený CD4 + T bunky z buď H /Ka - /- alebo myšou divokého typu, aby ~ 85 % čistota a prenesie 5 × 10 7 z týchto buniek do subletálne ožiarených myší divokého typu. Keďže bolo skôr preukázané, že H + /K + ATPázy špecifické CD4 + T bunky boli rýchlo odstránené v periférii a neschopný indukovať autoimunitné gastritídu v neožiarené divokého typu myší [24], to všetko príjemcov myši použité v tejto štúdii boli ľahko ožiarené 600 rád k zvýšeniu prežitia prenesených T-buniek z H /Ka - /-. myšiach}

Osem týždňov po prevode myší, ktoré dostali H /Ka ^{- /- CD4 + T-buniek všetky rozvinuté najzávažnejšie formy autoimunitné gastritídu (skóre 5 a 6). To potvrdzuje úplné vyčerpanie parietálnych buniek a zymogenní buniek a hypertrofia žalúdočnej sliznice (obrázok 2A, 2B). Na rozdiel od toho u myší, ktoré dostali divoký typ buniek CD4 + T bunky boli úplne bez gastritída (obrázok 2A, 2B), čo ukazuje, že autoimunitné gastritída v myší, ktoré dostali H /Ka - /- CD4 + T buniek nebola spôsobená ožiarením samy o sebe
, ale skôr, bunka očkovacie T.}

Patologické zmeny v žalúdku gastritic myší významne ovplyvnená ich žalúdok fyziológiu. Hypertrofia žalúdočnej sliznice za následok rozšírenie žalúdka Rugao (obrázok 2C) a zvýšenie žalúdka hmotnosti (obr 2D). Po druhé, vyčerpávanie parietálnych buniek spôsobila zvýšenie pH žalúdka v dôsledku nedostatku sekrécie kyseliny (obrázok 2E). Okrem toho, protilátky špecifické pre žalúdočné H ^{+ /K + ATPázy, by mohli byť detekované vo všetkých gastritic myší (obrázok 2F). Autoprotilátky dosiahli vysokú úroveň vo všetkých myší 6 týždňov po prenose (pozri obrázok 2G). Dohromady tieto výsledky preukázali prítomnosť vysoko patogénnej H + /K + ATPázy-špecifických T-lymfocytov v H /Ka - /- myší.}

autoimunitné gastritídu bol spôsobený CD4 + T lymfocyty sprostredkovaná zápal

Myši s autoimunitné gastritídy vyvolanej prevodom H /Ka ^{- /- CD4 + T-bunky mali výrazne viac buniek v ich žalúdku-vypúšťanie paragastric lymfy uzly, v porovnaní s normálnou myši a myši, ktoré dostali CD4 + T bunky od darcov divokého typu. Na rozdiel od toho nebol žiadny rozdiel vo veľkosti trieslovinové lymfatické uzliny medzi gastritic a non-gastritic myší (obrázok 3A). To ukazuje, že nárast v bunkovom paragastric lymfatických uzlín v gastritic myší bolo spôsobené miestnej žalúdočné zápalom a nie sú prednostné prežitie alebo rozšírenie H /Ka - /- CD4 + T-buniek v porovnaní s divokého typu CD4 + T-bunky po prenose}

V týchto experimentoch bolo bunky od darcu H /Ka ^{-. /- alebo myší divokého typu by mohli byť odlíšené od buniek príjemcu, pretože otvor rôzne CD90 alely. Populácia darcom v paragastric lymfatických uzlín z myší, ktorým H /Ka - /- CD4 + T-bunky mali podstatne viac buniek CD4 + T buniek s efektor /pamäťové fenotypu (CD44 hiCD62 lo) v porovnaní s myšami, ktoré dostali divoký typ buniek CD4 + T-buniek. Avšak množstvo efektorových /pamäťových T buniek boli podobné v vážky lymfatických uzlín (obrázok 3B). Spoločne tieto výsledky naznačujú, že rozvoj autoimunitné gastritídy u myší, ktoré dostali CD4 + T buniek z H /Ka - /- myší bol spôsobený bunkami sprostredkovanej zápalovej odpovede T v prostredí žalúdka a nie všeobecnejšej odpoveď.}

vývoj autoimunitné gastritídy v tomto modeli chorobe nebola spojená so zníženou úrovňou regulačných T (Treg) buniek od gastritic myší obsahovali podobné podiely Treg buniek v paragastric lymfatických uzlín v porovnaní s non -gastritic kontroly (obrázok 4A, 4B). V skutočnosti, významne viac Treg boli nájdené v žalúdku myší s autoimunitné gastritída (obrázok 4A, 4C)

H /Ka ^{-. /- CD4 + T bunky sa rýchlo indukovanej poškodenia tkaniva v žalúdku}

závažnosť autoimunitné gastritída bola analyzovaná v rôznych časových bodoch po prevode H /Ka ^{- /- CD4 + T bunky. Mierne vyčerpania parietálnych buniek a zymogenní buniek, ako je indikované gastritída skóre 4 [24], bolo možné pozorovať už 2 týždne po prenose a ochorení postupovalo rýchlo sa väčšinou z myší so závažnými gastritída, ako ukazuje gastritída skóre 5 a 6, 4 týždne po prenose (Obrázok 5).}

žalúdka váha môže byť použitý ako kvantitatívne miera autoimunitné gastritída

sme preukázali, že myši s autoimunitné gastritídu mal väčší ako žalúdok hmotnosť bez ochorenia u myší vzhľadom k hypertrofii žalúdočnej sliznice (obrázok 2D). Preto sme skúmali, či žalúdka hmotnosť by mohli byť použité ako kvantitatívne miera závažnosti autoimunitné gastritídy. K ďalšiemu testu, či žalúdok hmotnosť mohla rozlíšiť medzi rôznymi závažnosťou autoimunitné gastritídy, sme sa zaoberali neonatálnu-thymectomised myši ako by bolo možné získať väčší počet myší s variabilnými skóre ochorenia. Zistili sme, že existujú významné rozdiely v priemernej hmotnosti žalúdku medzi každým z prvých piatich úrovniach autoimunitné gastritídy (skóre 0-4) (obrázok 6). Avšak priemernej hmotnosti žalúdočnej gastritídy skóre 4, 5 a 6, neboli významne odlišné od seba navzájom (obrázok 6). To je pravdepodobne spôsobené tým, že sa stupeň hypertrofia žalúdočnej sliznice, nedôjde k zvýšeniu ako choroba postupuje do neskorých štádiách

indukcie autoimunitné gastritída H /Ka ^{-. /- CD4 + T-buniek bola závislá na prítomnosti H /Ka a H /Kβ}

predpokladal, že patogenita CD4 ^{+ T buniek z H /Ka - /- myši boli spôsobené nedostatok tolerancie na H /Ka v neprítomnosti tejto žalúdočnej autoantigén. Tento test CD4 + T bunky boli prenesené z H /Ka - /- myší do subletálne-ožiarený H /Ka - /- a divokého typu myší. Bolo preukázané, že H /Ka, v neprítomnosti H /Kβ, nemôže byť prezentované molekulami MHC [25] (S Allen, osobné oznámenie). Preto sme previedli CD4 + T buniek z H /Ka - /- myší do subletálne-ožiarených H /Kβ - /- myší a porovnala ich s H /Ka - /- a prirodzeného príjemcov myšou. Analýza autoimúnne útokom na žalúdočnú sliznicu je komplikované v H /Ka - /- a H /Kβ - /- myší so zmenami, ktoré sa vyskytujú v žalúdočnej sliznici, pretože nedostatok žalúdočnej kyseliny u týchto myší má za následok zvýšené hladiny trofického hormónu gastrínu. To vedie ku konštitutívne hypertrofia a vyčerpanie zymogenní buniek [26] ,. Z tohto dôvodu, aby bolo možné posúdiť, či autoimunitné reakcie napáda žalúdočnú sliznicu u týchto myší, namiesto toho sme stanovili prevalenciu parietálnych buniek, ktoré sú obvykle ochudobnené o autoimunitné gastritída, ale sa nachádzajú vo veľkom množstve v H /Ka - /- a H /Kβ - /- myši, a tiež prítomnosť žalúdočných protilátok}

žalúdok morfológie v H /Ka ^{. - /- myší alebo H /Kβ - /- myší nebola ovplyvnená prevodom H /Ka - /- CD4 + T-buniek (7A, 7B). Predovšetkým nebolo deplécia parietálnych buniek označujúcich nedostatok autoimunitnej reakcie. Na rozdiel od toho úplné vyčerpanie parietálnych buniek bola pozorovaná u divokého typu myší, ktorým príjemca H /Ka - /- CD4 + T buniek (Obrázok 7c). Vzhľadom k tomu, žalúdky H /Ka - /- a H /Kβ - /- myší sa objavili odlišné od normálnej aj gastritic myšou, nemôžeme hodnotiť tieto myši pomocou nášho štandardného gastritídu bodovacieho systému. Avšak, H + /K + ATPázy-špecifické protilátky, ďalšie punc autoimúnne gastritídy, neboli zistené v sére ako H /Ka - /- a H /Kβ - /- príjemca myši, ale boli zistené u divokého typu recipientních myší (obr 7d). Tieto výsledky ukázali, že bola nutná prítomnosť oboch a a p podjednotky pre vyčerpanie parietálnych buniek H /Ka - /-. CD4 + T bunky}

Diskusia

autoimunitné gastritída možno indukovať v Balb /c myší niekoľkými spôsobmi, vrátane novorodeneckej tymektómie, dospelých tymektómie s cyklofosfamidom [19], [21], imunizácia s žalúdočnej H ^{+ /K + ATPázy, [5] a generácie H + /K + ATPázy, špecifické pre TCR transgénnych myší [7], [8]. Avšak, imunitný systém ovládaný T buniek s jednou špecifickosťou, ako bolo pozorované v TCR transgénnych myší sa nepodobá normálnych fyziologických podmienok. Okrem toho, tymektómie a imunizácia neudeľujú konzistentné závažnosti ochorenia a sú technicky náročné, čo je nevhodné na použitie týchto modelov pre analýzu imunoterapiou. Preto sme vyvinuli nový model choroby, ktorý sa spoliehal na prenose T buniek z H /Ka - /-. Myši, polyklonálne populácie, ktorá obsahovala veľmi gastritogenic T bunky}

Zistili sme, že imunizácia H /ka ^{- /- myší purifikovaným H + /k + ATPázy vyvolané energickú odpoveď T-buniek, ako v dôsledku nedostatku tolerancie T buniek žalúdočnej autoantigén, ktorý ukazuje na prítomnosť H + /K + ATPázy-špecifických T-lymfocytov v H /Ka - /- myší. Ďalej sme ukázali, že prenos CD4 + T bunkovej populácie od H /Ka - /- myší vyvolané poškodenie žalúdka tkaniva myší prijímajúcich skoro po prevode. Autoimunitná gastritída vyvolaná prevodom H /Ka - /- CD4 + T bunky boli po závažné: všetky myši príjemcu vyvinuli najzávažnejšie ochorenie osem týždňov po prenose a ich žalúdok fyziológie bol významne ovplyvnený ako je uvedené zvýšenie žalúdka hmotnosti a pH. Tento model je výhodné preto, že závažnosť a výskyt ochorení prístupov, ktoré pozorované v TCR transgénnych myší, ale je spôsobená polyklonálnej repertoáru, že je technicky jednoducho stanoviť, že sa nespolieha na rozrušenie normálneho bunkového repertoáru Treg.}

populácie darcovskej bunky z H /Ka ^{- /- myší bola obohatená na ~ 85% buniek CD4 + T-buniek podľa postupu "negatívny selekcia", pretože hlavným cieľom tejto práce bolo vytvoriť jednoduchý , lacné a pohodlné modelu choroby. Sme došli k záveru, že je to CD4 + T bunky v očkovacej látky, ktorá spôsobila autoimunitné gastritídu, pretože to bolo pevne zakotvená v mnohých štúdiách, že CD4 + T bunky a nie iné bunky sú schopné iniciovať autoimunitné gastritídu [7 ] - [17]. Je zrejmé, že populácia buniek T a B reaktívne s H + /K + ATPázy, sú prítomné v repertoári normálnych myší [5], [14] - [16], [21], [24 ], [28] - [33]. Preto navrhujeme, aby H + /K + ATPáza-špecifických T a B lymfocytov od príjemcu sú potom odvádzané do lézie a prijímajúci odvodené od B-bunky sú zodpovedné za produkciu protilátok.}

už skôr bolo preukázané, že CD4 ^{+ T buniek z H /Kβ - /- myší indukovať autoimunitnú gastritídu v athymických Balb /c myší, ale nie u myší divokého typu ožiarených [24]. CD4 + T buniek z H /Ka - /- myší spôsobil gastritídu v ožiarených divokého typu myší, čo naznačuje, že táto populácia je viac patogénny než CD4 + T buniek z H /Kβ - /- myší , Tieto dáta podporujú viac dominantnú úlohu imunitnej odpovede proti H /Ka v patogenéze autoimunitné gastritídu, konzistentné s nálezmi v TCR transgénnych myší [7], [8].}

Na rozdiel od iných modelov ochorení, ktoré využívali Treg buniek -depleted polyklonálne T bunky z myší divokého typu pre indukciu autoimunity [15], že nie je nutné odstrániť Treg z H /Ka ^{- /- CD4 + populácie T buniek pre indukciu ťažké autoimunitné gastritídy. Okrem toho je rozvoj autoimunitnej gastritídy u myší prijímajúcich nebolo spôsobené zníženie úrovne Treg buniek z populácie darcov od gastritic myší obsahovala podobný podiel buniek Treg v paragastric lymfatických uzlinách v porovnaní s non-gastritic kontrol. Už skôr sme preukázali, že Treg bunky z H /Ka - /- myši boli rovnako účinné ako Treg buniek z divokého typu myší pri potláčaní H /Ka-špecifické autoreaktívnych T buniek [34]. Preto sú naše nálezy tu podporujú skoršie prácu o tom, že T-buniek repertoárov, ktoré neprešli odstránenie periférnych T-buniek sú schopné potlačiť populácie normálne Treg buniek [24], [35].}

Hoci normálnu hladinu Treg buniek bola detekovaná v paragastric lymfatických uzlín z myší gastritic, a významne vyššie percento Treg buniek bola nájdená v žalúdku gastritic myší v porovnaní s normálnou myši, Treg bunky neboli schopné zabrániť alebo potlačiť ochorenia. To je v súlade so zistením, že aj keď Treg nahromadené v CNS pri experimentálnej alergická encefalomyelitída bola vyvolaná [36], neboli schopní zabrániť expanzii a funkciu myelínu oligodendrocyty T buniek glykoproteínom je špecifická, lebo miestna zápalový cytokín prostredia tavené patogénne T bunky rezistentné k potlačeniu Treg.

Vyčerpanie parietálnych bunkách je charakteristickým znakom autoimunitné gastritídy a hlavným dôvodom, prečo zhubnej anémie je život ohrozujúce ochorenie, pretože parietálnej bunky produkujú vnútorný faktor, nedostatok, ktorý má za následok smrť , Zistili sme, že deplécia parietálnych buniek v tomto modeli ochorení bol závislý na prítomnosti ako H ^{+ /K + ATPázových podjednotiek ako CD4 + T buniek z H /Ka - /- myší iba vyvolané vyčerpania parietálnych buniek v myšiach divokého typu, ale nie v H /Ka - /- a H /Kβ - /- myší. vyčerpanie parietálnych buniek nebola spôsobená reakciu T-buniek voči H /Kβ od H /Ka - /- CD4 + T-buniek nevyvolal vyčerpania parietálnych buniek v H /Ka - /- príjemca myšou pri súčasnom H /Kβ bol vyjadrený v týchto myší [26]. Na druhej strane, deplécie buniek absencia parietálnych v H /Kβ - /- recipientních myší, ktorým H /Ka - /- CD4 + T bunky vystužené naše predchádzajúce štúdie, ktoré naznačili, že je potrebné H /Kβ aby pre H /Ka ktoré sa majú predložiť molekulami MHC [22]. Spoločne tieto výsledky naznačujú, že deplécia parietálnych buniek v tomto modeli prenose vyvinutého v dôsledku imunitnej odpovede na H /Ka CD4 + T buniek z H /Ka - /- myší. Zaznamenali sme, že v predchádzajúcej práci sme zistili, že parietálnej bunky nie sú vyčerpané v buď H /Ka - /-, ani H /Kβ - /- myší po novorodeneckej tymektómie, ktorá zdôrazňuje konzistenciu tohto nového modelu s výsledkami z tohto predchádzajúceho, dobre zavedený model.}

i tu preukázané, že žalúdok váha môže byť použitý ako kvantitatívne miera závažnosti ochorenia od hypertrofia žalúdočnej sliznice bolo pozorované u myší s autoimunitné gastritídu a viedlo v náraste hmotnosti žalúdku [37]. Bola významná korelácia medzi žalúdka hmotnosti a závažnosti autoimunitné gastritídy u myší, ktoré dostávali H /Ka ^{- /- CD4 + T bunky. Tento vzájomný vzťah bol potvrdený v neonatálnu-thymectomised myší, pričom priemerná hmotnosť žalúdka v každom žalúdku skóre významne odlišné od druhého. Avšak, vzhľadom na zmeny, v rámci skupiny, veľká veľkosť vzorky je potrebná, ak je žalúdok hmotnosť má byť použitý pre odhad závažnosti ochorenia. Preto histologické vyšetrenie žalúdka v kombinácii s hmotnosťou môže byť videná ako doplnkové opatrenia na posúdenie závažnosti autoimunitné gastritídu}

Ukázali sme, že autoimunitné gastritídu vyvolaná adoptívnym prenosom H /Ka ^{-. /- CD4 + T bunky predstavovali vynikajúci model ochorenia na otvorenie autoimunitné reakcie a konštrukcia interventionary terapiou pre autoimunitných ochorení. V tomto modeli ochorenia, autoimúnne gastritídu bol spôsobený bunkovú populácií nefrakcionovaného polyklonálnej T, ktorá obsahovala patogénne T-lymfocyty špecifické pre jeden antigén a konzistentné high-grade závažnosť ochorenia je pozorovaná vo všetkých recipientních myšou. Navyše sme ukázali, že závažnosť ochorenia môže byť ľahko určené žalúdka hmotnosti, žalúdočné pH a histologického vyšetrenia žalúdka časti.}

materiáloch a metódach

Ethics vyhlásenie

Táto práca sa snaží pre získanie podrobnejšie znalosti autoimunitného ochorenia a imunologických mechanizmov proti autoimunity u normálnych jedincov. Vzhľadom k tomu, imunitný systém je veľmi zložitý, integrovaná sieť, zvieratá musia správne vyhodnotiť tieto problémy.

Väčšina postupov boli klinické skúšky vykonané na vzorkách krvi a tkanív odobratých z myší, ktoré sú udržiavané vo výborné podmienky bývania , Myši boli pozorne sledovaní a ak je ťažko postihnutý alebo zúfalý zabitý. Po ukončení každého experimentu boli myši zabité zadusením CO2 alebo cervikálna dislokáciou, ktoré sú spojené s minimálne úzkosti.

Všetky pokusy sú starostlivo naplánované pre zníženie počtu zvierat a sú vykonávané v prísnom súlade s pokynmi diktovaných univerzitou experimentovanie Etické komisie Melbourne zvierat; prevenciu krutosti k zvieratám zákona z roku 1986; a NHMRC /CSIRO /AAC Australian kódex pre starostlivosť a používanie zvierat na vedecké účely (1997).

Táto práca bola schválená na University of Melbourne Etickej komisie zvierat pod číslo projektu 0706327.3.

Myši

Balb /cCrSlc [38], Balbo /cCrSlc.CD90.1 kongenní, H /Ka ^{- /- [26], H /Kβ - /- [ ,,,0],27] a BALB.B6- Gasa
kongenní myšou [20], už boli popísané. Oba H /Ka - /- a H /Kβ - /- myší boli spätne krížené o viac ako 10 krát Balb /cCrSlc. H /Ka - /- myši boli prešiel do Balb /c.CD90.1 myší generovať H /Ka - /-. CD90.1 myšou. Všetky myši boli udržiavané v bežnom zvierat zariadení na Bio21 molekulárnej vedy a Biotechnologický ústav, University of Melbourne. Všetky myši a experimenty boli schválené na University experimentovanie etickej komisie Melbourne zvierat.}

Protilátky a prietokovej cytometrie

Anti-CD3-FITC (145-2C11), anti-CD90.1- FITC (HIS51), anti-CD90.2-FITC (30H-12), anti-CD62L-PE (MEL-14), anti-CD4 PerCP (RM4-5) a anti-CD8-APC (53 - 6,7) boli zakúpené od BD Pharmingen; anti-CD44-APC (IM-7) bol zakúpený od eBioscience. Intracelulárne farbenie Foxp3 bola vykonaná s použitím anti-foxp3-APC (FJK-16) a foxp3 farbiaca súprava (eBioscience) podľa inštrukcií výrobcu. Prietoková cytometria bola vykonaná na prístroji Becton Dickinson FACSort prietokového cytometra a analyzované pomocou CellQuest Pro softvér alebo Beckman Coulter azúrová a analyzujú s použitím softvéru Summit.

Stanovenie reakcie T lymfocytov u myší imunizovaných H + /K + ATPázy

Vyčistená prasacej žalúdočnej H ^{+ /k + ATPázy bola pripravená v pomere 1: 1 s Freundovým kompletným adjuvans (Life Technologies). Myšou bolo subkutánne na každej strane koreňa chvosta. H /Ka - /- a Balb /cCrSlc imunizovaných dvakrát s 30 ug H + /K + ATPázy, s odstupom jedného mesiaca medzi očkovania. Jeden týždeň po druhej imunizácii, boli myši usmrtené a ich séra tanínových lymfatických uzlín. H + /K + ATPázy-špecifické protilátky boli detekované testom ELISA. Bunky z tanínových lymfatických uzlín, boli použité v teste T bunkovej proliferácie. 1 x 10 5 bunky boli kultivované po dobu 72 hodín s 2 x 10 4 sleziny DC z Balb /cCrSlc myšou. Proliferácie T-buniek bola stanovená inkorporáciou 3H-tymidínu počas posledných 16 hodín kultivácie. T-bunky boli kultivované v troch vyhotoveniach buď DC s antigénom (50 ug /ml myšieho žalúdočnej membrány) alebo DC sám. Žalúdočné membrány boli pripravené z myších žalúdkov, ako bolo opísané skôr [5]}

Indukcia autoimunitné gastritídy u myší

CD4 ^{+ T bunky boli obohatené na teplotu gt;. 85% čistota z lymfatických uzlín a sleziny H /Ka - /- a myší Balb /cCrSlc. Jednotlivé suspenzie buniek boli inkubované v zmesi F4 /80 a B220 hybridómových supernatantov pripočítaním antidumpingových CD8 protilátkou (53.6.72, BIOXCELL). Bunky non-CD4 boli odstránené za použitia anti-potkania IgG potiahnutých magnetických guľôčok (Dynal, Invitrogen). CD4 + (5 x 10 7), T-bunky z buď H /Ka - /- alebo myší Balb /cCrSlc boli injekčne podané do subletálne ožiarených (600 rad) prirodzeného kongenním Balb /cCrSlc.CD90.1 myšou intraperitoneálnou cestou. V niektorých experimentoch sa čistí H /Ka - /- CD4 + T bunky boli injikované do ožarované Balb /cCrSlc, H /Ka - /- a H /Kβ - /- myší. Všetky myši príjemca boli ožiarené 600 rád jeden deň pred prevodom T buniek. Osem týždňov neskôr, recipientních myší bolo zabitých a žalúdky, lymfatických uzlín a séra boli zozbierané.}

Balb /cCrSlc a BALB.B6- Gasa
kongenní myši boli použité v pokusoch tymektómie. Neonatálne tymektómie bola vykonaná, ako bolo opísané skôr [20].

Histologické vyšetrenie žalúdka a meranie pH žalúdka

žalúdka úseky boli skúmané na prítomnosť patologických zmien, ako bolo opísané skôr [24]. Vyhodnocovanie sa vykonáva v slepá štúdia a každý snímok bol nezávisle ktorého autorom je najmenej dvoch osôb. Aby bolo možné merať žalúdočné pH, myši nechajú hladovať cez noc pred usmrtením. Žalúdky boli rozrezať a opláchnuť v 1 ml fyziologického roztoku, ktoré boli zhromaždené a merané pH metra.

H + /K + ATPázy špecifický enzým linked ImmunoSorbent assay (ELISA)

ELISA pre detekciu H ^{+ /k + ATPázy, špecifické autoprotilátky sa vykonáva za použitia čistenej prasa H + /k + ATPázy, ako bolo opísané skôr [29].}

Štatistická analýza

Štatistická analýza bola vykonaná za použitia GraphPad Prism 5.0 (GraphPad). Dáta boli analyzované s použitím Mann-Whitneyho U-test alebo porovnávacie Spearmanovým testom a hodnotu P menšie ako 0,05 bola považovaná za významnú
.

• Ploche ONE: profilovanie génovej expresie v žalúdočnej sliznice z Helicobacter pylori infikovaných a neinfikované pacientov podstupujúcich chronickou Povrchné Gastritis
• PLoS ONE: Presnosť a limitných hodnôt pre Pepsinogens I, II a gastrínu 17 pre diagnostiku žalúdočného fundusu atrofiou: Vplyv Gastritis