Extracto
Resultados de la gastritis autoinmune de la ruptura de la tolerancia de células T a la H gástrica + /K + ATPasa. El H gástrico + /K + ATPasa es responsable de la acidificación de jugo gástrico y se compone de una subunidad α (H /Ka) y una subunidad β (H /Kβ). Aquí nos muestran que las células CD4 + células T de ratones H /Ka-deficiente (H /Ka - /-) son altamente patógena y autoinmune La gastritis puede ser inducida en subletal irradiaron los ratones de tipo salvaje por la transferencia adoptiva de no fraccionada CD4 + células T de H /Ka - /- ratones. Todos los ratones receptores desarrollaron consistentemente la forma más grave de la gastritis autoinmune 8 semanas después de la transferencia, con hipertrofia de la mucosa gástrica, el agotamiento completo de las células parietales y zimogénicas, y la presencia de autoanticuerpos a H + /K + ATPasa en el suero. Por otra parte, hemos demostrado que la enfermedad afectó significativamente el peso del estómago y el pH del estómago de ratones receptores. El agotamiento de las células parietales en este modelo de la enfermedad requiere la presencia de ambos H /Ka y H /Kβ ya que la transferencia de H /Ka - /- CD4 + células T no dieron como resultado el agotamiento de las células parietales en H /ratones receptores - Ka - /- o H /Kβ - /. La consistencia de gravedad de la enfermedad, el uso de células T policlonales y una respuesta de células T específicas para el autoantígeno gástrico hacen de este un modelo de enfermedad ideal para el estudio de muchos aspectos de la autoinmunidad específica de órgano, incluyendo la prevención y el tratamiento de la enfermedad. Visto: Tu E, Ang DKY, Hogan TV, Lee S, Chia CPZ, Gleeson PA, et al. (2011) Un modelo práctico de Grave, gastritis autoinmune alta incidencia causada por policlonal células T efectoras y sin perturbación de las células T reguladoras. PLoS ONE 6 (11): e27153. doi: 10.1371 /journal.pone.0027153 Editor: A. Ciriaco Piccirillo, Universidad McGill Centro de Salud, Canada | Recibido: 21 Enero, 2011; Aceptado: 11 Octubre 2011; Publicado: 9 de noviembre 2011 Derechos de Autor © 2011 Tu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación del Consejo de investigación médica de Australia y Nacional de Salud y la Universidad de Melbourne. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito Conflicto de intereses:. Los autores pueden confirmar que Simon Lee estaba en la Universidad de Melbourne, cuando este estudio fue completado y que Novo Nordisk es su dirección actual. Los autores han declarado no existen intereses en competencia. gastritis autoinmune es un excelente sistema para investigar la pérdida de la tolerancia de las células T a los tejidos propios, ya que es una enfermedad autoinmune bien caracterizado con un antígeno diana conocido y el modelo de ratón de la enfermedad tiene muchas similitudes con el equivalente humano. La anemia perniciosa, la etapa final de la gastritis autoinmune, tiene una prevalencia estimada del 1,9% en la población adulta occidental durante la edad de 60 años [1], que representa la causa más común de la vitamina B 12 deficiencia en los ancianos [2] . gastritis autoinmune cuenta con infiltración de células mononucleares en la submucosa que se extiende en la mucosa gástrica, el agotamiento de parietal gástrica y células zimogénicas y la hipertrofia de la mucosa gástrica [1]. El antígeno objetivo en la gastritis autoinmune ha sido identificado como el gástrico H + /K + ATPasa expresado por las células parietales gástricas [3] - [5]. El gástrico H + /K + ATPasa es una bomba de protones de membrana responsable de la acidificación de jugo gástrico y es un heterodímero que consiste en una subunidad catalítica α (H /Ka) y una glicoproteína β subunidad (H /Kβ). Estudios anteriores han demostrado que tanto H /Ka y H /Kβ están dirigidos en la gastritis autoinmune [4], [6] - [8]. Está bien documentado que, tanto en ratones como hombre, CD4 + células T que reconocen el gástrica H + /K + ATPasa iniciado la gastritis autoinmune, mientras que CD8 + células T y células B son ineficaz, al hacerlo, [7] - [17]. Sin embargo, tras el inicio de la enfermedad, los anticuerpos contra el H + /K + ATPasa se producen y son una herramienta de diagnóstico muy útil de la enfermedad a pesar de que no son patógenos [3], [16], [18 ]. ratones BALB /c se han demostrado ser los más susceptibles a gastritis autoinmune linfopenia inducida con una incidencia de 30 a 90% [19], [20]. La enfermedad puede ser inducida por la timectomía de los ratones 3 días de edad o timectomía adulta combinada con una dosis única de ciclofosfamida [19], [21]. A pesar de esto, es difícil evaluar los efectos terapéuticos de los tratamientos administrados a ratones sufrido una timectomía desde un espectro de gravedad de la enfermedad de leve a grave siempre se observa y la incidencia es variable, se requieren por lo tanto grandes tamaños de los grupos para poner a prueba la significación estadística. Por otra parte, la cirugía implicaba y mantenimiento post-operatorio de los animales es técnicamente exigente. gastritis autoinmune también puede ser inducida en ratones BALB /c por inmunización con purificada gástrico H + /K + ATPasa [5]. Sin embargo, la enfermedad es reversible después de la interrupción de la inmunización y tiene una baja severidad. La transferencia de células T BALB /c agotados de células T reguladoras (Treg) en ratones receptores atímicos causa grave gastritis autoinmune [15]. Por tanto, es imposible para diseccionar la relación entre las células T autorreactivas y células Treg durante el desarrollo de la enfermedad en este contexto ya que las células Treg están ausentes Alta incidencia de gastritis autoinmune espontánea se observa en ratones transgénicos que expresan un TCR específico para H /Ka [8]. Sin embargo, estos ratones no representan un modelo de enfermedad ideal para todos los experimentos debido a la naturaleza monoclonal de las células T patógenas no recapitula la respuesta policlonal que se produce en condiciones fisiopatológicas Desde esta perspectiva, hemos desarrollado un modelo de enfermedad que se basó en la transferencia de células T policlonales desde /Ka-deficientes H (H /Ka - /-) ratones de tipo salvaje en ratones irradiados subletalmente. Hemos demostrado que los ratones que recibieron células T no fraccionadas de H /Ka - /- ratones todos sucumbieron a la gastritis autoinmune más grave con los cambios patológicos observados en todo el estómago. Además, estos cambios patológicos afectados significativamente la fisiología del estómago. Hemos demostrado la utilidad de este modelo, demostrando que el desarrollo de gastritis autoinmune en este modelo era estrictamente dependiente de la presencia de ambos H + /K + ATPasa subunidades alfa y beta. T elevada y la respuesta de las células B en H /Ka - /- ratones después de la inmunización con H + /K + ATPasa con el fin de tener un sistema de que es adecuado para el estudio de diferentes aspectos de la autoinmunidad, establecimos un modelo de enfermedad en el que la enfermedad es causada por las células T policlonales patógenos y la gravedad de la enfermedad es consistentemente grave. se requiere una respuesta de células T a H /Ka para el inicio de la gastritis autoinmune y puede ser la fuente dominante de epítopos autorreactivos gástricas [7], [8], [22]. Como la tolerancia de las células T a H /Ka era poco probable que se produzca en H /Ka - /- ratones, se investigó si las células T que son específicas de H + /K + ATPasa y capaz de causar la gastritis estaban presentes en H /Ka - /-. para determinar si había elevado la respuesta inmune a H + /K + ATPasa en H /Ka - /- ratones en relación con los ratones de tipo salvaje, los ratones se inmunizaron dos veces con purificada gástrico H + /K + ATPasa. Después de la inmunización, se detectaron autoanticuerpos específicos para H + /K + ATPasa en la inmunizados H /Ka - /- ratones, pero no en ratones de tipo salvaje (Figura 1A). respuesta de las células T a in vitro CD4 + células T de H /Ka - /- ratones eran altamente patógena Para determinar si la transferencia adoptiva de células T de H /Ka - /- ratones serían capaces de causar gastritis autoinmune, que enriquece CD4 + T células de cualquiera de H /Ka - /- ratones de tipo salvaje o de ~ 85 % de pureza y se transfiere 5 × 10 7 de estas células en ratones de tipo salvaje irradiados subletalmente. Desde que se demostró previamente que H + /K + ATPasa específica de CD4 + células T se eliminan rápidamente en la periferia y incapaz de inducir gastritis autoinmune en ratones no irradiados de tipo salvaje [24], todos ratones receptores utilizados en este estudio fueron ligeramente irradiaron a 600 rads para mejorar la supervivencia de las células T transferidas desde H /Ka - /-. Ocho semanas después de la transferencia, los ratones que recibieron H /Ka - /- células CD4 + T toda desarrollaron las formas más graves de gastritis autoinmune (puntuación de 5 y 6). Esto se demostró por el agotamiento completo de las células parietales y células zimogénicas, y la hipertrofia de la mucosa gástrica (Figura 2A, 2B). En contraste, los ratones que recibieron de tipo salvaje CD4 + células T fueron completamente libre de gastritis (Figura 2A, 2B), lo que indica que la gastritis autoinmune en los ratones que recibieron H /Ka - /- CD4 + células T no fue causada por la irradiación per se los cambios patológicos en el estómago de los ratones gastritic afectados significativamente su fisiología del estómago. La hipertrofia de la mucosa gástrica como resultado la ampliación de rugosidades estómago (Figura 2C) y un aumento de peso del estómago (Figura 2D). En segundo lugar, el agotamiento de las células parietales causó un aumento en el pH del estómago debido a la falta de secreción de ácido (Figura 2E). Además, los autoanticuerpos específicos de la gástrico H + /K + ATPasa podría ser detectada en todos los ratones gastritic (Figura 2F). Los autoanticuerpos alcanzaron niveles elevados en todos los ratones de 6 semanas después de la transferencia (Figura 2G). En conjunto, estos resultados demostraron la presencia de alta patogenicidad H + /K células T + ATPasa-específicas en H /Ka - /-. gastritis autoinmune fue causado por CD4 + T mediada por células inflamación Los ratones con gastritis autoinmune inducida por la transferencia de H /Ka - /- CD4 + células T tenían significativamente más células en su estómago linfático paragastric-drenaje nodos en comparación con los ratones normales y ratones que recibieron células CD4 + T de los donantes de tipo salvaje. En contraste, no hubo diferencia en el tamaño del ganglio linfático inguinal entre los ratones gastritic y no gastritic (Figura 3A). Esto sugirió que el aumento de la celularidad de los ganglios linfáticos paragastric en ratones gastritic fue causado por la inflamación gástrica local y no por la supervivencia o la expansión de H /Ka preferencial - /- CD4 + células T en comparación con los de tipo salvaje CD4 + T después de la transferencia En estos experimentos, las células del donante H /Ka -. /- o los ratones de tipo salvaje podían diferenciarse de las células receptoras, ya que llevaban diferentes alelos CD90. La población de donantes en el ganglio linfático paragastric de ratones que recibieron H /Ka - /- CD4 + T células tenían significativamente más + células CD4 T con un fenotipo efector /memoria (CD44 hiCD62 lo) en comparación con los ratones que recibieron de tipo salvaje CD4 + células T . Sin embargo, los niveles de las células T efectoras /de memoria fueron similares en el ganglio linfático no drenaje (Figura 3B). En conjunto, estos resultados sugieren que el desarrollo de gastritis autoinmune en ratones que recibieron CD4 + T células de H /Ka - ratones fue causada por una respuesta inflamatoria mediada por células T en el entorno gástrico en lugar de una - /respuesta más generalizada. el desarrollo de gastritis autoinmune en este modelo de la enfermedad no se asoció con una reducción del nivel de T reguladoras (Treg) ya que los ratones células gastritic contenía una proporción similar de las células Treg en el ganglio linfático paragastric comparación con los no controles -gastritic (Figura 4A, 4B). De hecho, se encontraron significativamente más células Treg en el estómago de ratones con gastritis autoinmune (Figura 4A, 4C) H /Ka -. /- CD4 + células T inducida rápidamente el daño tisular en el estómago la gravedad de la gastritis autoinmune se analizó en diversos puntos temporales después de la transferencia de H /Ka - /- células CD4 + T. agotamiento moderado de células parietales y células zimogénicas, como se indica por una puntuación de gastritis de 4 [24], se observó ya a las 2 semanas después de la transferencia y la enfermedad progresó rápidamente con la mayor parte de los ratones que muestra gastritis severa, como se muestra por una el marcador de la gastritis 5 y 6, 4 semanas después de la transferencia (Figura 5). peso del estómago puede ser utilizado como una medida cuantitativa de la gastritis autoinmune Hemos demostrado que los ratones con gastritis autoinmune tenía un mayor peso del estómago que los ratones libres de la enfermedad debido a la hipertrofia de la mucosa gástrica (Figura 2D). Por lo tanto, se investigó si el peso del estómago se podría utilizar como una medida cuantitativa de la gravedad de la gastritis autoinmune. Para realizar pruebas adicionales si el peso del estómago podría diferenciar entre los diferentes niveles de gravedad de la gastritis autoinmune, se examinaron los ratones han sufrido una timectomía neonatal-como se podían obtener un mayor número de ratones con puntuaciones de enfermedad variables. Se encontró que no había diferencias significativas en el peso del estómago medio entre cada uno de los cinco primeros niveles de la gastritis autoinmune (puntuación 0-4) (Figura 6). Sin embargo, los pesos medios de las puntuaciones de estómago gastritis 4, 5 y 6 no fueron significativamente diferentes entre sí (Figura 6). Esto es probablemente debido al hecho de que el grado de hipertrofia de la mucosa gástrica no aumenta como la enfermedad progresa a las etapas finales Inducción de la gastritis autoinmune por H /Ka -. /- CD4 + células T era dependiente de la presencia de H /Ka y H /Kβ Tenemos la hipótesis de que la patogenicidad de CD4 + T células de H /Ka - /- ratones fue causada por la falta de tolerancia a H /Ka en ausencia de este autoantígeno gástrico. Para probar esto, las células CD4 + T fueron transferidos de H /Ka - /- ratones irradiados en subletal-H /Ka - los ratones de tipo salvaje y - /. Se ha demostrado que H /Ka, en ausencia de H /Kβ, no puede ser presentado por moléculas de MHC [25] (S Allen, comunicación personal). Por lo tanto, hemos transferido CD4 + T células de H /Ka - /- ratones en irradiados subletalmente-H /Kβ - /- ratones y los compararon con H /Ka - /- y de tipo salvaje los ratones receptores. El análisis de ataque autoinmune sobre la mucosa gástrica se complica en H /Ka - /- y H /Kβ - /- ratones por los cambios que ocurren en la mucosa gástrica ya que la falta de ácido gástrico en estos ratones da como resultado niveles elevados de la hormona gastrina tróficos. Esto conduce a la hipertrofia constitutiva y agotamiento de las células zimogénicas [26],. Por lo tanto, con el fin de evaluar si una respuesta autoinmune ataca la mucosa gástrica en estos ratones, que en lugar determinó la prevalencia de las células parietales, que normalmente se agotan en la gastritis autoinmune, pero se encuentran en abundancia en H /Ka - /- y H /Kβ - /- ratones, y también la presencia de autoanticuerpos gástricos la morfología del estómago en H /Ka -. /- ratones o H /Kβ - /- ratones no se vio afectada por la transferencia de H /Ka - /- CD4 + células T (Figura 7A, 7B). En particular, no había agotamiento de las células parietales que indican la falta de una respuesta autoinmune. Por el contrario, el agotamiento completo de las células parietales se observó en los ratones de tipo salvaje receptores que recibieron H /Ka - células T CD4 + (Figura 7C) - /. Desde estómagos de H /Ka - /- y H /Kβ - /- ratones aparecieron diferente a los ratones normales y gastritic, no pudimos evaluar estos ratones utilizando nuestro sistema de puntuación de la gastritis estándar. Sin embargo, H + /K autoanticuerpos + ATPasa-específicos, otra característica de la gastritis autoinmune, no se detectaron en el suero de ambos H /Ka - /- y H /Kβ - /- se detectaron los ratones receptores, pero en los ratones de tipo salvaje (Figura receptores 7D). Estos resultados demostraron que era necesaria la presencia de las dos subunidades alfa y beta para el agotamiento de las células parietales de H /Ka - /-. Células CD4 + T Discusión gastritis autoinmune puede ser inducida en ratones BALB /c por varios medios, incluyendo la timectomía neonatal, la timectomía adulta con ciclofosfamida [19], [21], la inmunización con gástrica H + /K + ATPasa [5] y generación de H + /K + ATPasa-ratones transgénicos TCR específicos [7], [8]. Sin embargo, un sistema inmune dominado por las células T con una única especificidad como se observa en ratones transgénicos TCR no se parece a las condiciones fisiológicas normales. Además, la timectomía y la inmunización no confieren gravedad de la enfermedad consistente y son técnicamente exigentes, lo que hace que sea un inconveniente para utilizar estos modelos para el análisis de inmunoterapias. Por lo tanto, hemos desarrollado un nuevo modelo de enfermedad que se basaba en la transferencia de células T de H /Ka - /-. ratones, una población policlonal que contenía las células T altamente gastritogenic Hemos encontrado que la inmunización de H /Ka - /- ratones con purificada H + /K + ATPasa indujo una respuesta de células T vigorosa como resultado de la falta de tolerancia de las células T para el autoantígeno gástrico, lo que indicó la presencia de H + /K la población de células de donantes de la H /Ka - /- ratones se enriqueció a ~ 85% de CD4 + células T mediante un procedimiento de "selección negativa" porque el principal objetivo de este trabajo fue producir un simple , modelo de enfermedad barato y conveniente. Llegamos a la conclusión de que es el CD4 + T células en el inóculo que causaron gastritis autoinmune ya que se ha establecido firmemente por muchos estudios que CD4 + T células y no otros tipos de células son capaces de iniciar gastritis autoinmune 7 [ ] - [17]. Está claro que las poblaciones de células T y B reactivos a la H + /K + ATPasa están presentes en el repertorio de ratones normales [5], [14] - [16], [21], [24 ], [28] - [33]. Por lo tanto, sugerimos que el H + /K + ATPasa específicos de células T y B del receptor se reclutaron de la lesión y las células B receptores derivados son responsables de la producción de autoanticuerpos. se ha documentado previamente que las células CD4 + T de H /Kβ - /- ratones inducen gastritis autoinmune en ratones atímicos Balb /c, pero no en los ratones de tipo salvaje irradiados [24]. CD4 células de H /Ka + T - /- ratones provocaron la gastritis en los ratones de tipo salvaje irradiados lo que sugiere que esta población es más patógeno que CD4 + células T de H /Kβ - /- ratones . Estos datos apoyan un papel más dominante de la respuesta inmune frente a H /Ka en la patogénesis de la gastritis autoinmune, consistente con los hallazgos en ratones transgénicos TCR [7], [8]. A diferencia de otros modelos de enfermedad que utilizaron células Treg células T policlonales -agotadas de los ratones de tipo salvaje para inducir autoinmunidad [15], que no era necesario para eliminar las células Treg de H /Ka - /- CD4 + población de células T para la inducción de la gastritis autoinmune severa. Además, el desarrollo de gastritis autoinmune en los ratones receptores no fue causada por un nivel reducido de células Treg de la población de donantes ya que los ratones gastritic contenía proporción similar de las células Treg en el ganglio linfático paragastric en comparación con los controles no gastritic. Hemos demostrado previamente que las células Treg de H /Ka - /- ratones eran tan eficaces como las células Tregs de los ratones de tipo salvaje en la supresión de células H /Ka-específicas T autorreactivas [34]. Por lo tanto, nuestros resultados aquí apoyan el trabajo previo que indica que los repertorios de células T que no se habían sometido a eliminación periférica de células T no pueden ser suprimidos por la población normal de las células Treg [24], [35]. A pesar de un nivel normal se detectó de Treg células en el ganglio linfático de los ratones paragastric gastritic, y un porcentaje significativamente mayor de las células Treg se encontró en el estómago de los ratones gastritic comparación con los ratones normales, las células Treg no fueron capaces de prevenir o suprimir la enfermedad. Esto es consistente con el hallazgo de que aunque las células Treg acumulan en el sistema nervioso central cuando se ha activado la encefalomielitis alérgica experimental [36], que no fueron capaces de prevenir la expansión y función de las células T-glicoproteína específica de mielina de oligodendrocitos, ya que el entorno de citoquinas inflamatoria local rindió las células T patógenas resistentes a la supresión de Treg. el agotamiento de las células parietales es un sello distintivo de la gastritis autoinmune y la razón principal de que la anemia perniciosa es una enfermedad que amenaza la vida, porque las células parietales producen el factor intrínseco, la falta de los cuales es fatal . Se encontró que el agotamiento de las células parietales en este modelo de enfermedad dependía de la presencia de ambos H + /K + ATPasa subunidades como CD4 + células T de H /Ka - /- ratones solamente inducida agotamiento de las células parietales en los ratones de tipo salvaje pero no en H /Ka - /- y H /Kβ - /- ratones. el agotamiento de las células parietales no fue causada por la respuesta de células T hacia H /Kβ desde /Ka H - /- CD4 + células T no indujo la depleción de células parietales en H /Ka - /- ratones receptores, mientras H /Kβ se expresó en estos ratones [26]. Por otro lado, la reducción de células ausencia de parietal en H /Kβ - ratones receptores que recibieron H /Ka - - //- CD4 + células T reforzados nuestros estudios previos que sugieren la necesidad de H /Kβ con el fin de H /Ka que será presentado por moléculas MHC [22]. En conjunto, estos resultados sugieren que la depleción de las células parietales en este modelo de transferencia desarrollado como consecuencia de la respuesta inmune a H /Ka por CD4 + células T de H /Ka - /- ratones. Observamos que en trabajos anteriores hemos encontrado que las células parietales no se agotan, ya sea en el H /Ka - /- ni H /Kβ - /- ratones después de la timectomía neonatal, lo que pone de manifiesto la coherencia de este nuevo modelo con los resultados de este modelo anterior, bien establecida. también se ha demostrado aquí que el peso del estómago se puede utilizar como una medida cuantitativa de la gravedad de la enfermedad desde la hipertrofia de la mucosa gástrica se observó en ratones con gastritis autoinmune y resultó en el aumento de peso del estómago [37]. Hubo una correlación significativa entre el peso del estómago y de la gravedad de la gastritis autoinmune en ratones que recibieron H /Ka - células T CD4 + - /. Esta correlación se confirmó en ratones han sufrido una timectomía neonatal-, con el peso del estómago media en cada gastritis puntuación de ser significativamente diferente a otro. Sin embargo, debido a la variación dentro de los grupos, se requerirá gran tamaño de la muestra si el peso del estómago se va a utilizar para estimar gravedad de la enfermedad. Por lo tanto, el examen histológico combinado con el peso del estómago puede ser vista como medidas complementarias para valorar la gravedad de la gastritis autoinmune Hemos demostrado que la gastritis autoinmune inducida por la transferencia adoptiva de H /Ka -. /- CD4 + células T representan un modelo de enfermedad excelente para la disección de la respuesta autoinmune y el diseño de terapias intervencionistas para enfermedades autoinmunes. En este modelo de enfermedad, gastritis autoinmune fue causada por una población de células T policlonales no fraccionada que contenía las células T patógenas específicas para un único antígeno, y se observa gravedad de la enfermedad de alto grado consistente en todos los ratones receptores. Por otra parte, hemos demostrado que la severidad de la enfermedad podría ser fácilmente determinada por el peso del estómago, el pH del estómago y el examen histológico de la sección del estómago. Ética declaración Este trabajo busca para obtener un conocimiento más detallado de la enfermedad autoinmune y los mecanismos inmunológicos que evitan la autoinmunidad en individuos normales. A medida que el sistema inmunológico es una red muy compleja, integrada, se requieren animales para evaluar adecuadamente estos problemas. La mayoría de los procedimientos eran pruebas clínicas realizadas sobre muestras de sangre y de tejido tomadas de ratones que se mantienen en excelentes condiciones de vivienda . Los ratones se controlaron de cerca y asesinados si severamente afectada o angustiado. Al término de cada experimento, los ratones murieron por asfixia con CO2 o dislocación cervical, que están asociados con un mínimo de dificultad. Todos los experimentos se planifican cuidadosamente para reducir el número de animales y se llevan a cabo en estricto cumplimiento de las directrices dictadas por la Universidad de Comité Ético de Experimentación Animal de Melbourne; la Prevención de la Crueldad a los Animales Ley de 1986; y el NHMRC /CSIRO /AAC Código Australiano de Prácticas para el Cuidado y Uso de Animales con Fines Científicos (1997). Este trabajo fue aprobado por la Universidad de Melbourne Comité de Ética Animal con el número de proyectos 0.706.327,3. Ratones BALB /cCrSlc [38], BALB /cCrSlc.CD90.1 congenic, H /Ka - /- [26], H /Kβ - /- [ ,,,0],27] y BALB.B6- Gasa anti-CD3-FITC (145-2C11), anti-CD90.1- FITC (HIS51), anti-CD90.2-FITC (30H-12), anti-CD62L-PE (MEL-14), anti-CD4 PerCP (RM4-5), y anti-CD8-APC (53-6,7) se compraron de BD Pharmingen; anti-CD44-APC (IM-7) se adquirió de eBioscience. tinción intracelular de Foxp3 se realizó con anti-Foxp3-APC (fjk-16S) y Foxp3 Staining Kit (eBioscience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La citometría de flujo se realizó en un Becton Dickinson FACSort citómetro de flujo y se analizaron usando el software CellQuest Pro o Beckman Coulter cian y analizados utilizando el software Cumbre. cerdo purificada gástrica H + /K + ATPasa se preparó en una proporción 1:01 con adyuvante completo de Freund (Life Technologies). Los ratones fueron inyectados por vía subcutánea en cada lado de la base de la cola. H /Ka - /- y BALB /cCrSlc ratones fueron inmunizados dos veces con 30 g de H + /K + ATPasa, con un mes de diferencia entre las vacunas. Una semana después de la segunda inmunización, los ratones fueron sacrificados por sus sueros y los ganglios linfáticos inguinales. H + /K autoanticuerpos + ATPasa-específicos fueron detectados por ELISA. Las células de los ganglios linfáticos inguinales se utilizaron en un ensayo de proliferación de células T. 1 × 10 5 células se cultivaron durante 72 horas con 2 × 10 4 DC esplénicas de ratones BALB /cCrSlc. la proliferación de células T se evaluó por incorporación de 3H-timidina durante las 16 horas finales de cultivo. Las células T se cultivaron por triplicado o bien con DC con antígeno (membrana gástrica /ml ratón 50 mg) o con DC solo. membranas gástricas se preparan a partir de estómagos de ratón como se describe anteriormente [5] Inducción de la gastritis autoinmune en ratones CD4 + células T fueron enriquecidos a >. 85% de pureza de los ganglios linfáticos y el bazo de H /Ka - /- y ratones BALB /cCrSlc. suspensiones de células individuales se incubaron en una mezcla de F4 /80 y B220 sobrenadantes de hibridoma más anticuerpo anti-CD8 (53.6.72, BioXCell). Las células no CD4 fueron eliminadas mediante anti-rata perlas magnéticas recubiertas de IgG (Dynal, Invitrogen). CD4 + (5 x 10 7) las células T de bien H /Ka - /- o ratones Balb /cCrSlc se inyectaron en subletalmente irradiados (600 rads) de tipo salvaje congenic BALB /cCrSlc.CD90.1 los ratones por vía intraperitoneal. En algunos experimentos, H purificada /Ka - Se inyectaron células CD4 + T células en irradiado BALB /cCrSlc, H /Ka - - //- y H /Kβ - /- ratones. Todos los ratones receptores fueron irradiados a 600 rads un día antes de la transferencia de células T. Ocho semanas después, los ratones receptores fueron sacrificados y se recogieron los estómagos, los ganglios linfáticos y sueros. BALB /cCrSlc y BALB.B6- Gasa El examen histológico de los estómagos y medición del pH gástrico secciones del estómago se examinaron para detectar la presencia de cambios patológicos como se describe anteriormente [24]. La puntuación se lleva a cabo de una manera ciega y cada portaobjetos se obtuvo de forma independiente por al menos dos personas. Con el fin de medir el pH del estómago, los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche antes del sacrificio. Los estómagos se cortaron abierto y enjuagarse en 1 ml de solución salina que se recogió y se mide con un medidor de pH. Un ELISA para detectar H + /K autoanticuerpos + ATPasa específica se lleva a cabo utilizando cerdo purificada H + /K + ATPasa tal como se describe anteriormente [29]. El análisis estadístico El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism 5.0 (GraphPad). Los datos fueron analizados utilizando el test U de Mann-Whitney o la prueba de correlación de Spearman y un valor de P < 0,05 fue considerado significativo
Introducción
.
.
Resultados
ratones
re-estimulación con H + /K + ATPasa también fue significativamente mayor en H /Ka - /- ratones que en los ratones de tipo salvaje (Figura 1B). Por lo tanto, como se ha demostrado previamente en H /Kβ - /- ratones [23], también es un T y B respuesta celular significativa a H + /K + ATPasa en H /Ka - /-. ratones que no están presentes en los ratones de tipo salvaje
ratones
, sino más bien, el inóculo de células T.
Ratones
Materiales y Métodos
congenic ratones [20] se han descrito anteriormente. Tanto H /Ka - /- y H /Kβ - /- ratones habían sido backcrossed mayor que 10 veces a ratones BALB /cCrSlc. H /Ka - /- ratones se cruzaron con los ratones BALB /c.CD90.1 para generar H /Ka - /-. Ratones CD90.1. Todos los ratones se mantuvieron en una instalación para animales convencional en el Instituto de Ciencia y Biotecnología Molecular Bio21, la Universidad de Melbourne. Todos los ratones y los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Melbourne Experimentación Animal.
Los anticuerpos y citometría de flujo análisis
Ensayo de respuestas de células T en ratones inmunizados con H + /K + ATPasa
congenic ratones fueron utilizados en los experimentos timectomía. timectomía neonatal se llevó a cabo como se describe anteriormente [20].
H + /K enzima + ATPasa específica ensayo inmunoenzimático (ELISA)
.
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