PLoS ONE: En praktisk modell for utvikling av alvorlig, høy forekomst Autoimmune gastritt forårsaket av polyklonale T-celler og uten forstyrrelse av regulatoriske T Cells

Abstract

Autoimmune gastritt resultater fra nedbryting av T-celletoleranse på mage H ^{+ /K + ATPase. Den gastriske H + /K + ATPase er ansvarlig for surgjøring av magesaft og består av en subenhet α (H /Ka) og en β subenhet (H /Kβ). Her viser vi at CD4 + T celler fra H /Ka-mangelfull mus (H /Ka - /-) er svært patogene og autoimmune gastritt kan induseres i sublethally bestrålt villtype mus ved adoptiv overføring av ufraksjonert CD4 + T-celler fra H /Ka - /- mus. Alle mottaker mus konsekvent utviklet den mest alvorlige formen for autoimmun gastritt 8 uker etter overføringen, med hypertrofi av mageslimhinnen, komplett uttømming av parietal og zymogenic celler, og tilstedeværelse av autoantistoffer mot H + /K + ATPase i serum. Videre demonstrerte vi at sykdommen betydelig påvirket mage vekt og mage pH i resipientmus. Uttømming av parietal-celler i denne sykdomsmodell som kreves nærvær av både H /Ka og H /Kβ siden overføring av H /Ka - /- CD4 + T-celler har ikke resultere i uttømming av parietalceller i H /Ka - /- eller H /Kβ - /- mottaker mus. Konsistensen av sykdommens alvorlighetsgrad, bruk av polyklonale T-celler og en spesifikk T-cellerespons på mage autoantigen gjør dette til et ideelt sykdommen modell for studiet av mange aspekter av organspesifikk autoimmunitet, inkludert forhindring og behandling av sykdom.}

Citation: Tu E, Ang DKY, Hogan TV, Les S, Chia CPZ, Gleeson PA, et al. (2011) En enkel modell av Alvorlig, høy forekomst Autoimmune gastritt forårsaket av polyklonale T-celler og uten forstyrrelse av regulatoriske T-celler. PLoS ONE 6 (11): e27153. doi: 10,1371 /journal.pone.0027153

Redaktør: Ciriaco A. Piccirillo, McGill University Health Center, Canada

mottatt: 21 januar 2011; Godkjent: 11 oktober 2011; Publisert: 09.11.2011

Copyright: © 2011 Tu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler fra National Health and Medical Research Council of Australia og Universitetet i Melbourne. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne kan bekrefte at Simon Les var på The University of Melbourne når denne studien var fullført og at Novo Nordisk er hans nåværende adresse. Forfatterne har erklært noen konkurrerende interesser eksisterer.

Innledning

Autoimmune gastritt er et utmerket system for å undersøke tapet av T-celle toleranse for selv vev siden det er en godt karakterisert autoimmun sykdom med en kjent målantigen og den musemodell av sykdommen har mange likheter med human tilsvarende. Pernisiøs anemi, slutten stadium av autoimmun gastritt, har en estimert prevalens på 1,9% i Vest voksne befolkningen over fylte 60 år [1], som representerer den vanligste årsaken til vitamin B _{12 mangel hos eldre [2] . Autoimmun gastritt har infiltrasjon av mononukleære celler i submucosa som strekker seg inn i den gastriske slimhinne, uttømming av mage parietal og zymogenic celler og hypertrofi av gastrisk mucosa [1].}

målantigen i autoimmun gastritt har blitt identifisert som den gastrisk H ^{+ /K + ATPase uttrykt av gastriske parietalceller [3] - [5]. Den gastriske H + /K + ATPase er en membran proton pumpe som er ansvarlig for surgjøring av magesyren, og det er en heterodimer som består av en katalytisk α subenhet (H /Ka) og et glykoprotein β subenhet (H /Kβ). Tidligere studier har vist at både H /Ka og H /Kβ er rettet i autoimmun gastritt [4], [6] - [8]. Det er godt dokumentert at, i både mus og menneske, CD4 + T-celler som gjenkjenner den gastriske H + /K + ATPase initiere autoimmun gastritt mens CD8 + T-celler og B-celler er ineffektive i å gjøre det [7] - [17]. Ikke desto mindre, etter initiering av sykdommen, autoantistoffer mot H + /K + ATPase er produsert og er en meget nyttig diagnostisk verktøy av sykdommen, selv om de ikke er patogene [3], [16], [18 ].}

BALB /c-mus har vist seg å være mest utsatt for lymfopeni-indusert autoimmun gastritt med en hyppighet på 30 til 90% [19], [20]. Sykdommen kan induseres ved tymektomi av tre dager gamle mus eller voksen tymektomi kombinert med en enkelt dose av cyklofosfamid [19], [21]. Til tross for dette, er det vanskelig å vurdere terapeutiske effekten av behandlinger gitt til mus thymectomised siden et spektrum av sykdommens alvorlighetsgrad fra mild til alvorlig er alltid observert og forekomst er variabel, er således store gruppestørrelser nødvendig for å teste statistisk signifikans. Videre er operasjonen er involvert og postoperativ vedlikehold av dyr er teknisk krevende. Autoimmun gastritt kan også bli indusert i BALB /c-mus ved immunisering med renset gastrisk H ^{+ /K + ATPase [5]. Imidlertid er sykdommen reversibel etter opphør av immunisering og har en lav alvorlighetsgrad. Overføring av BALB /c T-celler utarmet av regulatoriske T (treg) celler i atymiske mottaker mus forårsaker alvorlig autoimmun gastritt [15]. Det er derfor umulig å dissekere forholdet mellom autoreaktive T-celler og treg celler under sykdomsutviklingen i denne innstillingen siden treg cellene er fraværende.}

Høy forekomst av spontan autoimmun gastritt er observert i transgene mus som uttrykker en TCR som er spesifikt for H /Ka [8]. Men disse musene ikke representerer en ideell sykdomsmodell for alle eksperimenter fordi det monoklonale natur patogene T-cellene ikke rekapitulere det polyklonale reaksjon som oppstår i patofysiologiske forhold.

I dette perspektivet vi utviklet et sykdomsmodell som støttet seg på overføring av polyklonale T-celler fra H /Ka-mangel (H /Ka ^{- /-) mus inn sublethally-bestrålt villtype mus. Vi viste at mus som fikk ufraksjonerte T-celler fra H /Ka - /- mus alle bukket under for den mest alvorlige autoimmune gastritt med patologiske forandringer observert i hele magen. Videre disse patologiske forandringer påvirkes betydelig fysiologi av magen. Vi har demonstrert nytten av denne modell ved å vise at utviklingen av autoimmun gastritt i denne modellen var strengt avhengig av tilstedeværelse av både H + /K + ATPase a- og p-subenheter.}

Resultater

Forhøyet T- og B-cellerespons i H /Ka ^{- /- mus etter immunisering med H + /K + ATPase}

for å ha et system som er egnet for studier av ulike aspekter av autoimmunitet, vi etablert en sykdomsmodell der sykdommen er forårsaket av patogene polyklonale T-celler og sykdomsalvorligheten er gjennomgående alvorlig. En T-cellerespons mot T /Ka er nødvendig for inntreden av autoimmun gastritt, og kan være den dominerende kilde av mage autoreaktive epitoper [7], [8], [22]. Som T-celletoleranse til H /Ka var det usannsynlig at det i H /Ka ^{- /- mus, undersøkte vi om T-celler som var spesifikke for H + /K + ATPase og i stand til å forårsake gastritt var tilstede i H /Ka - /-. mus}

for å finne ut om det var forhøyet immunresponser til H ^{+ /K + ATPase i H /Ka - /- mus i forhold til villtype-mus, mus ble immunisert to ganger med renset gastrisk H + /K + ATPase. Etter immunisering ble autoantistoffer som er spesifikke for H + /K + ATPase detektert i immuniserte H /Ka - /- mus, men ikke i villtype-mus (figur 1A). T-celle respons på in vitro
restimulering med H + /K + ATPase var også signifikant større i H /Ka - /- mus enn hos villtype mus (Figur 1b). Derfor, som tidligere har blitt demonstrert i H /Kβ - /- mus [23], er det også en vesentlig T- og B-celle respons på H + /K + ATPase i H /Ka - /-. mus som ikke er til stede i villtype mus}

CD4 ^{+ T-celler fra H /Ka - /- mus var høypatogen}

For å finne ut om adoptiv overføring av T-celler fra H /Ka ^{- /- mus ville være i stand til å forårsake autoimmun gastritt, anriket vi CD4 + T-celler fra enten H /Ka - /- eller villtype-mus til -85 % renhet og overført 5 x 10 7 i disse celler til sublethally bestråles villtype-mus. Siden det ble tidligere vist at H + /K + ATPase-spesifikke CD4 + T-celler ble hurtig slettet i periferien og ute av stand til å indusere autoimmun gastritt hos ikke-bestrålte villtype-mus [24], alt mottaker mus brukt i denne studien var lett bestrålt ved 600 rads å forbedre overlevelsen av overførte T-celler fra H /Ka - /-. mus}

Åtte uker etter overføringen, mus som fikk H /Ka ^{- /- CD4 + T-celler alle utviklet de mest alvorlige former for autoimmun gastritt (skår 5 og 6). Dette ble demonstrert ved fullstendig uttømming av parietal-celler og zymogenic celler, og hypertrofi av den gastriske slimhinne (figur 2A, 2B). I kontrast til mus som mottok villtype CD4 + T-celler var helt fri for gastritt (figur 2A, 2B), som indikerte at autoimmun gastritt i mus som mottok H /Ka - /- CD4 + T-celler var ikke forårsaket av bestråling per se
, men heller, T-celle podestoff.}

patologiske forandringer i magen av gastritic mus påvirket deres mage fysiologi betydelig. Hypertrofi av den gastriske mucosa resulterte i utvidelsen av magesekken rugae (figur 2C) og en økning i mage vekt (figur 2D). For det andre, uttømming av parietal-celler medførte en økning i mage pH-verdien på grunn av mangel av syresekresjon (figur 2E). I tillegg autoantistoffer som er spesifikke for de gastriske H ^{+ /K + ATPase kunne påvises i alle gastritic mus (figur 2F). Autoantistoffer nådd høye nivåer i alle mus 6 uker etter overføringen (figur 2G). Sammen utgjør disse resultatene viste tilstedeværelsen av høypatogen H + /K + ATPase-spesifikke T-celler i H /Ka - /-. Mus}

Autoimmune gastritt var forårsaket av CD4 ^{+ T-celle-mediert betennelse}

Mus med autoimmun gastritt forårsaket av overføring av H /Ka ^{- /- CD4 + -T-celler, hadde signifikant flere celler i deres mage-drenerende lymfeknute paragastric noder sammenlignet med vanlige mus og mus som fikk CD4 + T-celler fra villtype givere. I motsetning til dette var det ingen forskjell i størrelsen av lyske lymfeknute mellom gastritic og ikke-gastritic mus (figur 3A). Dette antydet at økningen i celletall paragastric lymfeknuter i gastritic mus ble forårsaket av lokal gastrisk inflammasjon, og ikke ved preferanse overlevelse eller utvidelse av H /Ka - /- CD4 + T-celler sammenlignet med villtype-CD4 + T-celler etter overføring}

i disse forsøk celler fra donor H /Ka ^{-. /- eller villtype-mus kan bli differensiert fra mottakercellene fordi de bar forskjellige CD90 alleler. Donor befolkningen i paragastric lymfeknute av mus som fikk H /Ka - /- CD4 + T-celler hadde signifikant flere CD4 + T-celler med en effektor /minne fenotype (CD44 hiCD62 lo) sammenlignet med mus som mottok villtype CD4 + T-celler. Imidlertid nivåene av effektor /minne T-celler var tilsvarende i de ikke-drenerende lymfeknute (figur 3B). Sammen tyder disse resultater på at utviklingen av autoimmun gastritt i mus som mottok CD4 + T-celler fra H /Ka - /- mus ble forårsaket av en T-celle-mediert betennelsesreaksjon i den gastriske miljø i stedet for en mer generalisert respons.}

utviklingen av autoimmun gastritt i denne sykdommen modellen var ikke assosiert med en redusert nivå av regulatoriske T (treg) celler siden gastritic mus inneholdt tilsvarende andeler av treg celler i paragastric lymfeknute i forhold til ikke -gastritic kontroller (figur 4A, 4B). Faktisk ble betydelig flere Treg celler funnet i magen på mus med autoimmun gastritt (figur 4A, 4C)

H /Ka ^{-. /- CD4 + T celler raskt vevsskade i magen}

alvorlig~~POS=TRUNC av autoimmun gastritt ble analysert ved forskjellige tidspunkter etter tilførsel av H /Ka ^{- /- CD4 + T-celler. Moderat uttømming av parietal-celler og zymogenic-celler, som angitt med en gastritt score på 4 [24], kunne observeres så tidlig som 2 uker etter overføringen, og den sykdommen utviklet seg raskt med de fleste av de musene som viser alvorlig gastritis, som vist ved en gastritt score på 5 og 6, 4 uker etter overføringen (figur 5).}

magen vekt kan brukes som et kvantitativt mål for autoimmun gastritt

Vi har vist at mus med autoimmun gastritt hadde en større mage vekt enn sykdoms-frie mus på grunn av hypertrofi av den gastriske slimhinne (figur 2D). Derfor, undersøkte vi om mage vekt kan brukes som et kvantitativt mål for graden av autoimmun gastritt. For ytterligere å teste om magen vekt kan skille mellom ulike alvorlighetsgrader av autoimmun gastritt, undersøkte vi neonatally-thymectomised mus som større antall mus med variabel sykdom score kunne oppnås. Vi fant ut at det var signifikante forskjeller i gjennomsnitts magen vekten mellom hver av de fem første nivåene av autoimmun gastritt (scorer 0-4) (figur 6). Imidlertid, de midlere mage vekter av gastritt resultatet 4, 5 og 6 var ikke signifikant forskjellige fra hverandre (figur 6). Dette skyldes sannsynligvis det faktum at graden av hypertrofi av mageslimhinnen ikke øker som sykdommen utvikler seg til de sene stadier

Induksjon av autoimmun gastritt av H /Ka ^{-. /- CD4 + T-celler var avhengig av tilstedeværelse av H /Ka og H /Kβ}

hypotese at patogenitet CD4 ^{+ T-celler fra H /Ka - /- mus ble forårsaket av mangel på toleranse til H /Ka i fravær av denne gastrisk autoantigen. For å teste dette, ble CD4 + T-celler overført fra H /Ka - /- mus til sublethally-bestrålt H /Ka - /- og villtype mus. Det har blitt vist at H /Ka, i fravær av H /Kβ, kan ikke bli presentert av MHC-molekyler [25] (S Allen, personlig kommunikasjon). Vi overført derfor CD4 + T celler fra H /Ka - /- mus til sublethally-bestrålt H /Kβ - /- mus og sammenlignet dem med H /Ka - /- og villtype mottaker mus. Analysen av autoimmunt angrep på mageslimhinnen er komplisert i H /Ka - /- og H /Kβ - /- mus ved de endringer som skjer i den gastriske slimhinne, siden mangel på mavesyre hos disse musene resulterer i forhøyede nivåer av trofiske hormonet gastrin. Dette fører til konstitutiv hypertrofi og uttømming av zymogenic celler [26],. Derfor, for å vurdere om en autoimmun reaksjon angriper gastrisk mucosa hos disse musene, vi i stedet bestemmes forekomsten av parietal-celler, som normalt er utarmet i autoimmun gastritt, men finnes i overflod i H /Ka - /- og H /Kβ - /- mus, og også tilstedeværelsen av mage autoantistoffer}

magen morfologi i H /Ka ^{-. /- mus eller H /Kβ - /- mus ble ikke påvirket av overføring av H /Ka - /- CD4 + T-celler (Figur 7A, 7B). Spesielt var det ingen reduksjon av parietal-celler som indikerer mangel på en autoimmun respons. I kontrast, ble fullstendig utarming av parietalceller sett i villtype mottaker mus som fikk H /Ka - /- CD4 + T-celler (figur 7C). Siden mager av H /Ka - /- og H /Kβ - /- mus dukket opp forskjellige både normale og gastritic mus, kan vi ikke vurdere disse musene bruker vår standard gastritt scoring system. Men H + /K + ATPase-spesifikke autoantistoffer, et annet kjennetegn på autoimmun gastritt, ikke ble detektert i sera fra både H /Ka - /- og H /Kβ - /- mottaker mus, men ble oppdaget i hvete mottaker mus (figur 7D). Disse resultatene viser at tilstedeværelsen av både a- og p-underenhetene var nødvendig for uttømming av parietal-celler ved H /Ka - /-. CD4 + T-celler}

diskusjon

autoimmun gastritt kan induseres i BALB /c-mus på flere måter, blant annet neonatal tymektomi, voksen tymektomi med cyklofosfamid [19], [21], immunisering med gastrisk H ^{+ /K + ATPase [5] og generering av H + /K + ATPase-spesifikke TCR-transgene mus [7], [8]. Imidlertid, et immunsystem som domineres av T-celler med en enkelt spesifisitet, som observert i TCR-transgene mus ikke ligner normale fysiologiske betingelser. Videre gjør tymektomi og immunisering ikke gi konsekvent sykdomsgrad, og de er teknisk krevende, hvilket gjør det upraktisk å benytte disse modellene for analyse av immunterapier. Vi har derfor utviklet en ny sykdom modell som støttet seg på overføring av T-celler fra H /Ka - /-. Mus, en polyklonale befolkning som inneholdt svært gastritogenic T-celler}

Vi fant at immunisering av H /Ka ^{- /- mus med renset H + /K + ATPase-induserte en sterk T-celle-respons som følge av den manglende T-celletoleranse til den gastriske autoantigenet, noe som indikerte tilstedeværelse av H + /K + ATPase-spesifikke T-celler i H /Ka - /- mus. Vi viste videre at overføring av CD4 + T-cellepopulasjoner fra H /Ka - /- mus indusert skade på mage vev av mottaker mus snart etter overføring. Autoimmun gastritt indusert ved overføring av H /Ka - /- CD4 + T-celler var konsistent alvorlig: alle former for resipientmus utviklet den mest alvorlig sykdom åtte uker etter overføringen, og deres mage fysiologi ble signifikant påvirket som vist ved økningen i magen vekt og pH. Denne modellen er fordelaktig fordi alvorlighetsgraden og insidens av sykdom tilnærminger som observeres i TCR-transgene mus, men er forårsaket av en polyklonal repertoar, er det teknisk enkelt å etablere, den ikke er avhengig av forstyrrelse av den normale celle Treg repertoar.}

donorcellepopulasjon fra H /Ka ^{- /- mus ble anriket til -85% CD4 + T-celler ved en "negativ seleksjon" prosedyre fordi store Målet med dette arbeidet var å produsere en enkel , billig og praktisk sykdomsmodell. Vi konkluderer med at det er CD4 + T-celler i den inokulum som forårsaket autoimmun gastritt siden det har blitt fastslått ved mange studier som CD4 + T-celler og ikke på andre celletyper er i stand til å initiere autoimmun gastritt [7 ] - [17]. Det er klart at T- og B-cellepopulasjoner som reagerer med H + /K + ATPase er til stede i repertoaret av normale mus [5], [14] - [16], [21], [24 ], [28] - [33]. Derfor foreslår vi at H + /K + ATPase-spesifikke T- og B-celler fra mottakeren blir deretter rekruttert til lesjonen og mottaker-avledet B-celler er ansvarlig for produksjonen av autoantistoffer.}

Det er tidligere blitt dokumentert at CD4 ^{+ T-celler fra H /Kβ - /- mus induserer autoimmun gastritt i atymiske BALB /c-mus, men ikke i bestrålte villtype-mus [24]. CD4 + T-celler fra H /Ka - /- mus forårsaket gastritt i bestrålte villtype mus som tyder på at denne gruppen er mer sykdomsfremkallende enn CD4 + T-celler fra H /Kβ - /- mus . Disse data understøtter et mer dominerende rolle for immunrespons mot H /Ka i patogenesen av autoimmun gastritt, i samsvar med funn i TCR-transgene mus [7], [8].}

I motsetning til andre sykdomsmodeller som benyttes treg celle -depleted polyklonale T-celler fra villtype-mus for å indusere autoimmunitet [15], var det ikke nødvendig å fjerne treg celler fra H /Ka ^{- /- CD4 + -T-cellepopulasjonen for induksjon av alvorlig autoimmun gastritt. Videre utvikling av autoimmun gastritt i mottaker mus var ikke forårsaket av et redusert nivå av treg celler fra donor populasjonen siden gastritic mus inneholdt tilsvarende andel av treg celler i paragastric lymfeknute sammenlignet med ikke-gastritic kontroller. Vi har tidligere vist at treg celler fra H /Ka - /- mus var like effektive som Tregs celler fra villtype-mus i å undertrykke H /Ka-spesifikke autoreaktive T-celler [34]. Derfor våre funn her støtter tidligere arbeid som indikerer at T-celle-repertoarer som ikke hadde gjennomgått perifere T-celle sletting er i stand til å bli undertrykket av den normale Treg cellepopulasjon [24], [35].}

Selv om et normalt nivå av treg-celler ble detektert i paragastric lymfeknuten av gastritic mus, og en betydelig høyere prosentandel av treg-celler ble funnet i magesekken av gastritic mus sammenlignet med normale mus, treg-celler var ikke i stand til å hindre eller undertrykke sykdom. Dette er konsistent med det funn at selv om Treg celler samlet opp i CNS ved eksperimentell allergisk encefalomyelitt ble utløst [36], de var ikke i stand til å hindre utvidelse og funksjon av myelin oligodendrocytt glykoprotein-spesifikke T-celler, siden den lokale inflammatoriske cytokin miljøet gjengitt patogene T-celler som er resistente mot treg undertrykkelse.

Nedbryting av parietalceller er et kjennetegn på autoimmun gastritt og den viktigste grunnen til at pernisiøs anemi er en livstruende sykdom fordi parietalceller produserer intrinsic factor, som er dødelig mangel . Vi fant at uttømming av parietal-celler i denne sykdomsmodell var avhengig av tilstedeværelsen av både H ^{+ /K + ATPase-underenheter som CD4 + T-celler fra H /Ka - /- mus bare indusert parietalcellen uttømming i villtype mus, men ikke i H /Ka - /- og H /Kβ - /- mus. Parietalcellen uttømming var ikke forårsaket av T-cellerespons mot H /Kβ siden H /Ka - /- CD4 + T-celler ikke induserer parietalcellen uttømming i H /Ka - /- mottaker mus mens H /Kβ ble uttrykt i disse mus [26]. På den annen side, fravær av parietal-celleutarming i H /Kβ - /- mottaker mus som mottok H /Ka - /- CD4 + T-celler forsterket våre tidligere undersøkelser, som viser behovet for H /Kβ for at H /Ka å bli presentert ved MHC-molekyler [22]. Sammen viser disse resultater antydet at parietal-celleutarming i denne overføringen modell utviklet som en konsekvens av immunresponser overfor H /Ka av CD4 + T-celler fra H /Ka - /- mus. Vi merker oss at i tidligere arbeid har vi funnet at parietalceller ikke utarmet i enten H /Ka - /- eller H /Kβ - /- mus etter neonatal tymektomi, som fremhever den konsekvens av denne nye modellen med resultatene fra tidligere, veletablert modell.}

Vi har også demonstrert her at mage vekt kan anvendes som et kvantitativt mål på sykdomsalvorligheten ettersom hypertrofi av mageslimhinnen ble observert i mus med autoimmun gastritt og resulterte i økningen i magen vekt [37]. Det var en signifikant korrelasjon mellom mage vekt og alvorligheten av autoimmun gastritt i mus som mottok H /Ka ^{- /- CD4 + T-celler. Denne sammenhengen ble ytterligere bekreftet i neonatally-thymectomised mus, med gjennomsnitts magen vekt i hver gastritt scorer være vesentlig annerledes enn en annen. Imidlertid, på grunn av variasjoner innenfor gruppene, stort prøvestørrelsen vil være nødvendig hvis mage vekt som skal brukes til å anslå sykdommens alvorlighetsgrad. Derfor kan histologisk undersøkelse kombinert med magen vekt sees som komplementære tiltak for å vurdere alvorlighetsgraden av autoimmun gastritt}

Vi viste at autoimmun gastritt indusert av adoptiv overføring av H /Ka ^{-. /- CD4 + T-celler medførte en utmerket sykdomsmodell for disseksjon av autoimmune responsen og utformingen av interventionary terapier for autoimmune sykdommer. I denne sykdomsmodell, ble autoimmun gastritt forårsaket av en ufraksjonert polyklonale T-cellepopulasjon som inneholdt patogene T-celler som er spesifikke for et enkelt antigen, og konsistent høy grad av sykdommens alvorlighetsgrad er observert i alle resipientmus. Videre viste vi at sykdommens alvorlighetsgrad kan lett bestemmes av magen vekt, mage pH og histologisk undersøkelse av magen delen.}

Materialer og metoder

Etikk uttalelse

Dette arbeidet søker for å oppnå et mer detaljert kjennskap til autoimmune sykdommer og de immunologiske mekanismer som hindrer autoimmunitet hos normale individer. Som immunsystemet er en svært kompleks, integrert nettverk, er dyr som kreves for å kunne vurdere disse spørsmålene.

De fleste prosedyrer var kliniske tester utført på blod- og vevsprøver tatt fra mus som opprettholdes i gode boforhold . Musene ble overvåket nøye og drept hvis alvorlig rammet eller distressed. Ved avslutning av hvert forsøk ble musene drept av CO2 kvelning eller halshugging, som er forbundet med et minimum av nød.

Alle forsøkene er nøye planlagt for å redusere dyrenumre og utføres i streng overholdelse av retningslinjene diktert ved University of Melbourne forsøk med dyr Etikkutvalget; Prevention of Cruelty å Animals Act 1986; og NHMRC /CSIRO /AAC Australian Code of Practice for omsorg og bruk av dyr til vitenskapelige formål (1997).

Dette arbeidet ble godkjent av University of Melbourne dyreetikk komiteen etter prosjektnummer 0706327,3.

Mus

BALB /cCrSlc [38], BALB /cCrSlc.CD90.1 congenic, H /Ka ^{- /- [26], H /Kβ - /- [ ,,,0],27] og BALB.B6- GASA
congenic mus [20] har blitt beskrevet tidligere. Både H /Ka - /- og H /Kβ - /- mus hadde blitt backcrossed større enn 10 ganger til BALB /cCrSlc. H /Ka - /- mus ble krysset til BALB /c.CD90.1 mus til å generere H /Ka - /-. CD90.1 mus. Alle mus ble opprettholdt i en konvensjonell dyr anlegget på Bio21 Molecular Science og bioteknologi institutt, Universitetet i Melbourne. Alle mus og eksperimenter ble godkjent av University of Melbourne forsøk med dyr etikkomiteen.}

Antistoffer og flowcytometrisk analyse

Anti-CD3-FITC (145-2C11), anti-CD90.1- FITC (HIS51), anti-CD90.2-FITC (30H-12), anti-CD62L-PE (MEL-14), anti-CD4-PerCP (RM4-5), og anti-CD8-APC (53 til 6,7) ble kjøpt fra BD Pharmingen; anti-CD44-APC (IM-7) ble kjøpt fra eBioscience. Intracellulær farging av foxp3 ble utført ved hjelp av anti-foxp3-APC (FJK-16S) og foxp3 Farging Kit (eBioscience) i henhold til produsentens anvisninger. Flowcytometri ble utført på en Becton Dickinson FACSort flowcytometer og analysert ved hjelp av Cellquest Pro programvare eller Beckman Coulter cyan og analysert ved hjelp av Summit programvare.

Analyse av T-celle responser i mus immunisert med H + /K + ATPase

Renset gris mage H ^{+ /K + ATPase ble utarbeidet i en 1:01 ratio med Freund fullstendige adjuvans (Life Technologies). Mus ble injisert subkutant på hver side av halebasen. H /Ka - /- og BALB /cCrSlc mus ble immunisert to ganger med 30 mikrogram H + /K + ATPase, med en måneds mellomrom mellom vaksinasjoner. En uke etter den andre immuniseringen ble musene avlivet for deres sera og inguinal lymfeknuter. H + /K + ATPase-spesifikke antistoffer ble detektert ved ELISA. Celler fra de inguinale lymfeknuter ble anvendt i en T-celle proliferasjonsanalyse. 1 × 10 5 celler ble dyrket i 72 timer med 2 × 10 4 milten DC fra BALB /cCrSlc mus. T-celleformering ble undersøkt ved inkorporering av 3H-tymidin i løpet av de siste 16 timene av kulturen. T-celler ble dyrket i triplikat med enten like med antigen (50 ug /ml mus gastrisk membran) eller med like alene. Gastric membraner ble preparert fra mus mager som tidligere beskrevet [5]}

Induksjon av autoimmune gastritt hos mus

CD4 ^{+ T-celler ble beriket til >. 85% renhet fra lymfeknuter og milt av H /Ka - /- og BALB /cCrSlc mus. Enkeltcellesuspensjoner ble inkubert i en blanding av F4 /80 og B220 hybridomsupernatanter pluss anti-CD8 antistoff (53.6.72, BioXCell). Den ikke-CD4-celler ble fjernet ved anvendelse av anti-rotte-IgG-belagte magnetiske kuler (Dynal, Invitrogen). CD4 + (5 x 10 7) T-celler fra enten H /Ka - /- eller BALB /cCrSlc mus ble injisert i sublethally bestrålt (600 rad) hvete congenic BALB /cCrSlc.CD90.1 mus via intraperitoneal ruten. I noen eksperimenter, ble renset H /Ka - /- ble CD4 + T-celler injisert i bestrålte BALB /cCrSlc, H /Ka - /- og H /Kβ - /- mus. Alle resipientmus ble bestrålt ved 600 rad en dag før T-celleoverføring. Åtte uker senere, ble mottaker mus drept og mager, lymfeknuter og sera ble høstet.}

BALB /cCrSlc og BALB.B6- GASA
congenic mus ble brukt i tymektomi eksperimenter. Neonatal tymektomi ble utført som tidligere beskrevet [20].

Histologisk undersøkelse av magen og måling av pH i magesekken

Mage seksjoner ble undersøkt for forekomst av patologiske forandringer som tidligere beskrevet [24]. Scoring ble utført i en blind mote og hvert lysbilde ble uavhengig scoret av minst to personer. For å måle den mage pH ble musene sultet over natten før ofring. Magene ble kuttet opp og skylt i 1 ml saltvann som ble oppsamlet og målt med et pH-meter.

H + /K + ATPase-spesifikke enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA)

En ELISA for å påvise H ^{+ /K + ATPase-spesifikke antistoffer ble utført ved anvendelse av renset gris H + /K + ATPase som tidligere beskrevet [29].}

Statistisk analyse

Statistisk analyse ble utført med GraphPad Prism 5.0 (GraphPad). Data ble analysert med Mann-Whitney U-test eller Spearman korrelasjon test og en P-verdi < 0,05 ble betraktet som signifikant
.

• PLoS ONE: Gene Expression Profilering i mageslimhinnen fra Helicobacter pylori-infisert og ikke-infiserte pasienter som gjennomgår Kronisk overfladisk gastritt
• PLoS ONE: Nøyaktighet og grenseverdier for Pepsinogens I, II og Gastrin 17 for diagnostisering av Gastric fundic Atrofi: Influence of Gastritt