Abstract
Auto-immuun gastritis vloeit voort uit de verdeling van de T-cel tolerantie voor het maag-H + /K + ATPase. De maag H + /K + ATPase verantwoordelijk voor het aanzuren van maagsap en bestaat uit een α-subeenheid (H /Ka) en een β-subeenheid (H /Kβ). Hier laten we zien dat CD4 + T-cellen uit H /Ka-deficiënte muizen (H /Ka - /-) zijn zeer pathogeen en autoimmune gastritis kan worden versterkt sublethaal bestraalde wildtype muizen door adoptieve overdracht van gefractioneerde CD4 + T-cellen uit H /Ka - /- muizen. Alle ontvangende muizen steeds het meest ernstige vorm van autoimmune gastritis ontwikkeld 8 weken na de overdracht, met hypertrofie van het maagslijmvlies, volledige uitputting van de pariëtale en zymogene cellen, en de aanwezigheid van auto-antilichamen tegen H + /K + ATPase in het serum. Verder hebben we aangetoond dat de ziekte sterk beïnvloed gewicht maag en de maag pH van ontvangende muizen. Uitputting van pariëtale cellen in dit ziektemodel vereist de aanwezigheid van zowel H /Ka- en H /Kβ omdat overdracht van H /Ka - /- CD4 + T-cellen niet tot depletie van pariëtale cellen in H /Ka - /- of H /Kβ - /- ontvanger muizen. De consistentie van de ernst van de ziekte, het gebruik van polyklonale T-cellen en een specifieke T cel respons op de maag autoantigeen maken dit een ideale ziektemodel voor de studie van vele aspecten van orgaanspecifieke auto-immuniteit, waaronder preventie en behandeling van de ziekte. Visum: Tu E, Ang DKY, Hogan TV, lezen S, Chia CPZ, Gleeson PA, et al. (2011) A Convenient Model van Serieus, hoge incidentie Auto-immuun gastritis veroorzaakt door Polyklonale Effector T-cellen en zonder verstoring van regulatoire T-cellen. PLoS ONE 6 (11): e27153. doi: 10.1371 /journal.pone.0027153 Editor: Ciriaco A. Piccirillo, McGill University Health Center, Canada Ontvangen: 21 januari 2011; Aanvaard: 11 oktober 2011; Gepubliceerd: 9 november 2011 Copyright: © 2011 Tu et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd Financiering:. Dit werk werd ondersteund door onderzoek subsidies van de National Health en Medical Research Council van Australië en de Universiteit van Melbourne. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript Competing belangen. De auteurs kan bevestigen dat Simon lezen was aan de Universiteit van Melbourne, wanneer deze studie was afgerond en dat Novo Nordisk is zijn huidige adres. De auteurs hebben verklaard geen concurrerende belangen bestaan. Auto-immuun gastritis is een uitstekend systeem voor het verlies van T-cel tolerantie voor zichzelf weefsels te onderzoeken omdat het een goed gekarakteriseerde autoimmuunziekte met een bekende doelantigeen en het muizenmodel van de ziekte heeft vele overeenkomsten met de menselijke equivalent. Pernicieuze anemie, het eindstadium van autoimmune gastritis, heeft een geschatte prevalentie van 1,9% in Western volwassenen ouder dan 60 jaar [1], waarbij de meest voorkomende oorzaak van vitamine B 12 deficiëntie bij ouderen vertegenwoordigt [2] . Autoimmuun gastritis kenmerkt infiltratie van mononucleaire cellen in de submucosa dat zich uitstrekt in het maagslijmvlies, uitputting van pariëtale cellen en zymogene en hypertrofie van het maagslijmvlies [1]. De doelwitantigeen in auto-immuun gastritis is geïdentificeerd de maag H + /K + ATPase uitgedrukt door pariëtale cellen [3] - [5]. De maag H + /K + ATPase is een membraan proton pomp verantwoordelijk voor het aanzuren van maagsap en is een heterodimeer dat uit een katalytische α subeenheid (H /Ka) en een glycoproteïne β subeenheid (H /Kβ). Eerdere studies hebben aangetoond dat zowel H /Ka- en H /Kβ gericht in autoimmune gastritis [4], [6] - [8]. Het is goed gedocumenteerd dat in zowel muizen als mensen, CD4 + T-cellen die herkennen de maag H + /K + ATPase leiden autoimmuun gastritis terwijl CD8 + T-cellen en B-cellen zijn ondoeltreffend daarbij [7] - [17]. Niettemin na de aanvang van de ziekte, auto-antilichamen tegen de H + /K + ATPase zijn vervaardigd en zijn zeer nuttig diagnostisch instrument van de ziekte hoewel ze niet pathogeen [3], [16], [18 ]. BALB /c muizen is aangetoond dat het meest gevoelig voor geïnduceerde lymfopenie autoimmune gastritis met een incidentie van 30-90% [19], [20]. De ziekte kan worden geïnduceerd door thymectomie van 3 dagen oude muizen of volwassene thymectomie gecombineerd met een enkele dosis cyclofosfamide [19], [21]. Desondanks is het moeilijk om therapeutische effecten van behandelingen aan thymectomised muizen aangezien een spectrum van ziekten ernst variëren van milde tot ernstige evalueren altijd waargenomen en incidentie varieert, worden dus grote groep maten moeten statistische significantie testen. Bovendien de operatie betrokken en postoperatieve onderhoud van de dieren is technisch veeleisend. Autoimmune gastritis kunnen ook in BALB /c muizen worden geïnduceerd door immunisatie met gezuiverde gastrisch H + /K + ATPase [5]. Echter, de ziekte is omkeerbaar na het staken van de immunisatie en heeft een lage ernst. Overdracht van BALB /c T-cellen ontdaan van regulerende T (Treg) cellen in athymische ontvangende muizen veroorzaakt ernstige autoimmuun gastritis [15]. Het is dus onmogelijk om de relatie tussen autoreactieve T-cellen en Treg cellen ontleden tijdens de ziekteontwikkeling bij deze instelling omdat Treg cellen ontbreken. Hoge frequentie van spontaan autoimmuun gastritis waargenomen in transgene muizen die een TCR specifiek voor H /Ka [8]. Echter, deze muizen geen ideale ziektemodel voor alle experimenten vormen vanwege de monoklonale aard van de pathogene T-cellen niet het polyklonale reactie die optreedt in pathofysiologische omstandigheden herhalen. Vanuit dit oogpunt hebben we een ziektemodel die zich op de overdracht van polyklonale T-cellen van H /Ka-deficiënte (H /Ka - /-) muizen in sublethaal-bestraalde wild-type muizen. Wij toonden aan dat muizen die ongefractioneerde T-cellen ontvangen van H /Ka - /- muizen allemaal bezweken aan de strengste autoimmune gastritis met pathologische veranderingen waargenomen in de gehele maag. Bovendien zijn deze pathologische veranderingen significante invloed op de fysiologie van de maag. Wij toonden het nut van dit model door aan te tonen dat de ontwikkeling van auto-immuun gastritis in dit model strikt afhankelijk van de aanwezigheid van zowel H + /K + ATPase α en β-subeenheden. Verhoogde T- en B-cel respons in H /Ka - /- muizen na immunisatie met H + /K + ATPase met het oog op een systeem die geschikt is voor het bestuderen van verschillende aspecten van autoimmuniteit, hebben we een ziektemodel waarbij de ziekte wordt veroorzaakt door pathogene polyklonale T-cellen en de ernst van de ziekte is altijd ernstig. Een T-cel respons op H /Ka is vereist voor het begin van auto- gastritis en kunnen de belangrijkste bron van maag autoreactieve epitopen [7] zijn, [8], [22]. Als T-cel tolerantie voor H /Ka was onwaarschijnlijk in H /Ka - /- muizen onderzochten we of de T-cellen die H specifiek waren + /K + ATPase en kan veroorzaken de gastritis waren aanwezig in H /Ka - /-. muizen om te bepalen of er immuunreacties werden verheven tot H + /K + ATPase in H /Ka - /- muizen ten opzichte van wildtype muizen, muizen werden twee keer geïmmuniseerd met gezuiverd maag H + /K + ATPase. Na de immunisatie werden autoantilichamen specifiek voor H + /K + ATPase gedetecteerd in de geïmmuniseerde H /Ka - /- muizen, maar niet in wildtype muizen (Figuur 1A). T celreactie op in vitro opnieuw stimuleren met CD4 + T-cellen van H /Ka - /- muizen waren hoogpathogene Om te bepalen of adoptieve overdracht van T-cellen van H /Ka - /- muizen kunnen autoimmuun gastritis zou kunnen veroorzaken, we verrijkte CD4 + T-cellen van ofwel H /Ka - /- en wildtype muizen ~85 % zuiverheid en overgebracht 5 × 10 7 van deze cellen in bestraalde sublethaal wildtype muizen. Aangezien eerder was aangetoond dat H + /K + ATPase CD4 + T-cellen werden snel verwijderd in de periferie en niet autoimmune gastritis induceren in niet-bestraalde wildtype muizen [24], alle ontvangende muizen die in deze studie werden licht bestraald met 600 rad het voortbestaan van de overgedragen T-cellen van H /Ka verbeteren - /-. muizen Acht weken na de overdracht, H muizen die ontvangen /Ka - /- CD4 + T-cellen de meest ernstige vormen van autoimmune gastritis ontwikkeld (score 5 en 6). Dit werd aangetoond door de volledige depletie van pariëtale cellen en zymogene cellen en hypertrofie van het maagslijmvlies (figuur 2A, 2B). Daarentegen muizen die wildtype CD4 ontvingen waren + T-cellen volledig vrij van gastritis (figuur 2A, 2B), waaruit bleek dat autoimmune gastritis bij muizen die H /Ka - /- CD4 + T-cellen werd niet veroorzaakt door bestraling per se Pathologische veranderingen in de maag van gastritic muizen significant beïnvloed hun maag fysiologie. Hypertrofie van het maagslijmvlies resulteerde in de uitbreiding van maag rugae (figuur 2C) en een toename van gewicht maag (figuur 2D). Anderzijds depletie van pariëtale cellen veroorzaakte een toename van pH in de maag door het ontbreken van zuursecretie (figuur 2E). Bovendien autoantilichamen specifiek voor de maag H + /K + ATPase kunnen worden gedetecteerd in alle gastritic muizen (figuur 2F). Autoantilichamen was dus hoog in alle muizen 6 weken na de overdracht (figuur 2G). Samen vormen deze resultaten tonen de aanwezigheid van sterk pathogene H + /K + ATPase-specifieke T-cellen in H /Ka - /-. Muizen Auto-immuun gastritis veroorzaakt door CD4 + T-cel-gemedieerde inflammatie Muizen met auto-immuun gastritis veroorzaakt door de overdracht van H /Ka - /- CD4 + T-cellen hadden significant meer cellen in hun maag drainerende paragastric lymfe nodes vergelijking met normale muizen en muizen die CD4 + T-cellen ontvangen van wildtype donoren. Daarentegen was er geen verschil in de grootte van de inguinale lymfeklier tussen gastritic en niet- gastritic muizen (Figuur 3A). Dit suggereerde dat de toename van de cellulariteit van paragastric lymfeklieren in gastritic muizen veroorzaakt door lokale maagontsteking en niet preferentiële overleving of uitbreiding van H /Ka - /- CD4 + T-cellen in vergelijking met wildtype CD4 + T cellen na overdracht In deze experimenten cellen van donor H /Ka -. /- en wildtype muizen kunnen worden onderscheiden van ontvangende cellen omdat ze droegen CD90 verschillende allelen. De donor bevolking in de paragastric lymfeklieren van muizen die H /Ka - /- CD4 + T-cellen hadden significant meer CD4 + T-cellen met een effector /memory fenotype (CD44 hiCD62 lo) in vergelijking met muizen die wildtype CD4 + T-cellen ontvangen. De niveaus van effector /geheugen-T-cellen waren vergelijkbaar in de niet-drainerende lymfeklier (figuur 3B). Tezamen suggereren deze resultaten dat de ontwikkeling van auto-immuun gastritis bij muizen die CD4 ontvangen + T-cellen uit H /Ka - /- muizen werd veroorzaakt door een T-cel gemedieerde ontstekingsreactie in de gastrische omgeving plaats van een algemenere reactie. de ontwikkeling van auto-immuun gastritis in dit ziektemodel was niet geassocieerd met een verlaagd niveau van regulatorische T (Treg) cellen omdat gastritic muizen bevatte gelijke hoeveelheden van Treg cellen in de lymfeknoop paragastric vergelijking met niet -gastritic (Afbeelding 4A, 4B). In feite, werden significant Treg cellen gevonden in de maag van muizen met autoimmune gastritis (Figuur 4A, 4C) H /Ka -. /- CD4 + T cellen snel geïnduceerd weefselbeschadiging in de maag de ernst van autoimmune gastritis werd geanalyseerd op verschillende tijdstippen na de overdracht van H /Ka - /- CD4 + T-cellen. Matige uitputting van pariëtale cellen en zymogene cellen, zoals aangegeven door een gastritis score van 4 [24], kan reeds na 2 weken na de overdracht en de ziekte snel verlopen met de meeste van de muizen die ernstige gastritis, zoals blijkt uit een gastritis score van 5 en 6, 4 weken na de overdracht (figuur 5). Maag gewicht kan worden gebruikt als kwantitatieve maat van autoimmune gastritis We hebben aangetoond dat muizen met autoimmuun gastritis had een groter gewicht maag dan ziektevrij muizen door de hypertrofie van het maagslijmvlies (figuur 2D). Daarom onderzochten we of gewicht maag kan worden gebruikt als kwantitatieve maat voor de ernst van autoimmune gastritis. Verder testen of gewicht maag kon onderscheid tussen verschillende gradaties van autoimmune gastritis, onderzochten we neonataal-thymectomised muizen grotere aantallen muizen met scores variabele ziekte kon worden verkregen. We vonden dat er belangrijke verschillen in het gemiddelde gewicht maag tussen elk van de eerste vijf niveaus van autoimmune gastritis (score 0-4) (figuur 6). De gemiddelde gewichten van maag gastritis scores 4, 5 en 6 waren niet significant verschillend van elkaar (figuur 6). Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat de mate van hypertrofie van het maagslijmvlies niet toeneemt naarmate de ziekte vordert de late stadia inductie van autoimmune gastritis door H /Ka- -. /- CD4 + T-cellen was afhankelijk van de aanwezigheid van H /Ka- en H /Kβ Onze hypothese dat de pathogeniciteit van CD4 + T-cellen uit H /Ka - /- muizen werd veroorzaakt door gebrek aan tolerantie voor H /Ka in afwezigheid van de maag autoantigeen. Om dit te testen, werden CD4 + T-cellen overgebracht van H /Ka - /- muizen in sublethaal-bestraalde H /Ka - /- en wildtype muizen. Het is aangetoond dat H /Ka-, in afwezigheid van H /Kβ, kan niet worden gepresenteerd door MHC-moleculen [25] (S Allen, persoonlijke communicatie). We hebben daarom overgedragen CD4 + T-cellen van H /Ka - /- muizen in sublethaal-bestraalde H /Kβ - /- muizen en vergeleken hen met H /Ka - /- en wild-type ontvangende muizen. De analyse van autoimmune aanval op het maagslijmvlies wordt ingewikkelder H /Ka - /- en H /Kβ - /- muizen door de veranderingen die optreden in het maagslijmvlies omdat een gebrek aan maagzuur in deze muizen leidt tot verhoogde niveaus van de trofische hormoon gastrine. Dit leidt tot constitutieve hypertrofie en uitputting van zymogene cellen [26]. Teneinde te beoordelen of een auto-immuunreactie valt het maagslijmvlies in deze muizen, we in plaats daarvan bepaalden de prevalentie van pariëtale cellen, die normaliter waaruit autoimmune gastritis, maar zijn er in overvloed in H /Ka - /- en H /Kβ - /- muizen, en ook de aanwezigheid van de maag autoantilichamen de maag morfologie in H /Ka -. /- muizen of H /Kβ - /- muizen werd niet beïnvloed door de overdracht van H /Ka - /- CD4 + T-cellen (Figuur 7A, 7B). In het bijzonder was er geen depletie van pariëtale cellen wijst het ontbreken van een auto-immuunreactie. Daarentegen volledige uitputting van pariëtale cellen waargenomen in wildtype ontvangende muizen die H /Ka - /- CD4 + T-cellen (Figuur 7C). Sinds magen van H /Ka - /- en H /Kβ - /- muizen verschillende bleek zowel normale als gastritic muizen, konden we niet deze muizen te beoordelen met behulp van onze standaard gastritis scoresysteem. Echter, H + /K + ATPase-specifieke auto-antilichamen, een ander kenmerk van auto-immuun gastritis, werden niet gedetecteerd in de sera van beide H /Ka - /- en H /Kβ - /- ontvangende muizen, maar werden gedetecteerd in wildtype ontvangende muizen (Figuur 7D). Deze resultaten toonden dat de aanwezigheid van zowel α en β subunits nodig was voor de uitputting van pariëtale cellen door H /Ka- - /-. CD4 + T cellen Discussie Auto-immune gastritis kan in BALB /c muizen worden geïnduceerd door verschillende middelen, waaronder neonatale thymectomie, volwassen thymectomie met cyclofosfamide [19], [21], immunisatie met gastrisch H + /K + ATPase [5] en generatie H + /K + ATPase-specifieke TCR transgene muizen [7], [8]. Echter, een immuunsysteem gedomineerd door T-cellen met een enkele specificiteit zoals waargenomen in TCR transgene muizen niet lijken normale fysiologische omstandigheden. Verder thymectomie en immunisatie niet verlenen consistente ernst van de ziekte en zijn technisch veeleisend, waardoor het lastig om deze modellen te gebruiken voor de analyse van immuuntherapie. We ontwikkelden daarom een nieuwe ziekte model dat zich op de overdracht van T-cellen van H /Ka - /-. Muizen, een polyklonale populatie die sterk gastritogenic T-cellen bevatte We hebben vastgesteld dat immunisatie van H /Ka - /- muizen met gezuiverd H + /K + ATPase induceerde een sterke T-cel respons als gevolg van het ontbreken van T-cel tolerantie voor de gastrische auto-antigeen, waarbij de aanwezigheid van H de donor cel populatie van de H /Ka - /- muizen werd verrijkt tot ~85% CD4 + T-cellen door een "negatieve selectie" procedure, omdat de belangrijkste doelstelling van dit werk was om een eenvoudig te produceren , goedkoop en gemakkelijk ziektemodel. We concluderen dat het de CD4 + T-cellen in het inoculum dat autoimmune gastritis veroorzaakt omdat is stevig door vele studies die CD4 + T-cellen en geen andere celtypen kunnen autoimmune gastritis initiëren [7 ] - [17]. Het is duidelijk dat T en B celpopulaties reactief H + /K + ATPase aanwezig zijn in het repertoire van normale muizen [5], [14] - [16], [21], [24 ], [28] - [33]. Daarom stellen we voor dat de H + /K + ATPase-specifieke T- en B-cellen van de ontvanger worden dan aangetrokken om de laesie en de ontvanger afgeleide B-cellen zijn verantwoordelijk voor de productie van autoantilichamen. eerder is aangetoond dat CD4 + T-cellen uit H /Kβ - /- muizen te induceren autoimmune gastritis in athymische BALB /c-muizen, maar niet in bestraalde wildtype muizen [24]. CD4 + T-cellen uit H /Ka - /- muizen veroorzaakte gastritis in bestraalde wildtype muizen suggereert dat deze populatie meer pathogeen dan CD4 + T-cellen uit H /Kβ - /- muizen . Deze gegevens ondersteunen een dominante rol immuunrespons tegen H /Ka in de pathogenese van auto-immuun gastritis, in overeenstemming met de bevindingen in TCR transgene muizen [7], [8]. In tegenstelling tot andere ziektemodellen dat Treg cellen gebruikt -arme polyklonale T-cellen van wildtype muizen autoimmuniteit [15] induceren, was het niet nodig om Treg cellen van H /Ka verwijderen - /- CD4 + T-celpopulatie voor het induceren van ernstige autoimmune gastritis. Bovendien werd de ontwikkeling van auto-immuun gastritis in de ontvangende muizen niet veroorzaakt door een verlaagd niveau van Treg cellen uit de donorpopulatie sinds gastritic muizen vergelijkbaar deel van Treg cellen in de lymfeknoop paragastric vergelijking met niet-gastritic controles. We hebben eerder aangetoond dat Treg cellen van H /Ka - /- muizen waren even effectief als Tregs cellen van wildtype muizen onderdrukken H /Ka-specifieke autoreactieve T-cellen [34]. Daarom is onze bevindingen hier ondersteunen eerdere werk aangeeft dat T-cel repertoires die niet hadden ondergaan perifere T-cel schrapping niet kunnen worden onderdrukt door de normale Treg cel populatie [24], [35]. Hoewel een normaal niveau van Treg cellen werd gedetecteerd in de paragastric lymfeklieren van muizen gastritic en een aanzienlijk hoger percentage van Treg cellen werd gevonden in de maag van gastritic muizen in vergelijking met normale muizen, Treg cellen niet in staat te voorkomen of te onderdrukken ziekten. Dit is consistent met de bevinding dat hoewel Treg cellen geaccumuleerd in het CZS bij experimentele allergische encefalomyelitis werd veroorzaakt [36], waren ze niet in staat de expansie en functie van myeline oligodendrocyt glycoproteïne-specifieke T-cellen te voorkomen, aangezien de lokale inflammatoire cytokine milieu rendered pathogene T-cellen resistent tegen Treg onderdrukking. de uitputting van de pariëtale cellen is een kenmerk van auto-immuun gastritis en de belangrijkste reden dat pernicieuze anemie is een levensbedreigende ziekte, omdat pariëtale cellen produceren intrinsieke factor, het gebrek aan die dodelijk is . We vonden dat depletie van pariëtale cellen in dit ziektemodel was afhankelijk van de aanwezigheid van zowel H + /K + ATPase subeenheden CD4 + T-cellen uit H /Ka - /- muizen alleen geïnduceerde pariëtale cel depletie in wildtype muizen, maar niet in de H /Ka - /- en H /Kβ - /- muizen. Pariëtale cel depletie werd niet veroorzaakt door T-cel respons richting H /Kβ sinds H /Ka - /- CD4 + T-cellen niet pariëtale cel depletie te induceren in H /Ka - /- ontvanger muizen, terwijl H /Kβ werd die in deze muizen [26]. Anderzijds, het ontbreken van pariëtale cel depletie in H /Kβ - /- ontvangende muizen die H /Ka - /- CD4 + T-cellen versterkt onze eerdere studies suggereren de behoefte aan H /Kβ zodat H /Ka te worden gepresenteerd door MHC-moleculen [22]. Samen vormen deze resultaten suggereerden dat pariëtale cel depletie in deze overdracht model ontwikkeld als gevolg van immuunresponsen op H /Ka door CD4 + T-cellen uit H /Ka - /- muizen. We merken op dat in eerder werk hebben we gevonden dat pariëtale cellen niet uitgeput in ofwel de H /Ka - /- noch H /Kβ - /- muizen na neonatale thymectomie, die de samenhang van dit nieuwe model benadrukt met resultaten van deze voorgaande, gevestigde model. ook hier aangetoond dat gewicht maag kan worden gebruikt als kwantitatieve maat van de ernst van de ziekte, aangezien hypertrofie van het maagslijmvlies werd waargenomen bij muizen met autoimmune gastritis en resulteerde in de toename van gewicht maag [37]. Er was een significante correlatie tussen gewicht maag en de ernst van autoimmune gastritis bij muizen die H /Ka - /- CD4 + T-cellen. Deze correlatie werd verder bevestigd in neonataal-thymectomised muizen met het gemiddelde gewicht maag Iedere gastritis scoren beduidend anders dan andere. Vanwege de variatie binnen de groepen zullen grote steekproefomvang nodig indien gewicht maag wordt gebruikt om ziektestrengheid schatten. Daarom kan histologisch onderzoek gecombineerd met een gewicht maag worden gezien als aanvullende maatregelen voor de beoordeling van de ernst van auto-immuun gastritis We toonden aan dat auto-immuun gastritis geïnduceerd door adoptieve overdracht van H /Ka -. /- CD4 + T-cellen vormde een uitstekende ziektemodel voor de ontleding van auto-immune reactie en het ontwerp van interventionary therapieën voor auto-immuunziekten. In dit ziektemodel werd autoimmuun gastritis veroorzaakt door gefractioneerde polyklonale T-cel populatie pathogene T-cellen specifiek voor een antigeen en consistente hoogwaardige ernst van de ziekte waargenomen in alle ontvangende muizen bevatte. Bovendien toonden we aan dat de ernst van de ziekte gemakkelijk kan worden bepaald door het gewicht maag, maag pH en histologisch onderzoek van maag sectie. Ethics statement Dit werk tracht een betere kennis van auto-immuunziekten en immunologische mechanismen die autoimmuniteit bij normale personen voorkomen verkrijgen. Aangezien het immuunsysteem is zeer complex, geïntegreerd netwerk, worden de dieren vereist om deze problemen goed te kunnen beoordelen. De meeste procedures werden klinische testen uitgevoerd op bloed- en weefselmonsters genomen uit muizen die in uitstekende behuizing omstandigheden worden gehandhaafd . Muizen werden op de voet gevolgd en vermoord als zwaar getroffen of bedroefd. Aan het einde van elk experiment werden de muizen gedood door stikken CO2 of cervicale dislocatie, die geassocieerd zijn met een minimum van nood. Alle experimenten zijn zorgvuldig ontworpen om het aantal dieren te verminderen en worden uitgevoerd in strikte naleving richtlijnen gedicteerd door de Universiteit van Animal Experimentation Ethics Committee van Melbourne; de Preventie van Wreedheid tegen Dieren Act 1986; en de NHMRC /CSIRO /AAC Australian Code of Practice voor de zorg en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden (1997). Dit werk werd goedgekeurd door de Universiteit van Melbourne Animal Ethics Committee onder projectnummer 0.706.327,3. Mice BALB /cCrSlc [38], BALB /cCrSlc.CD90.1 congenic, H /Ka - /- [26], H /Kβ - /- [ ,,,0],27] en BALB.B6- Gasa Anti-CD3-FITC (145-2C11), anti-CD90.1- FITC (HIS51), anti-CD90.2-FITC (30H-12), anti-CD62L-PE (MEL-14), anti-CD4 PerCP (RM4-5) en anti-CD8-APC (53-6,7) werden gekocht van BD Pharmingen; anti-CD44-APC (IM-7) werd gekocht van eBioscience. Intracellulaire kleuring van Foxp3 werd uitgevoerd met behulp van anti-Foxp3-APC (FJK-16S) en Foxp3 Staining Kit (eBioscience) volgens de instructies van de fabrikant. Flowcytometrie werd uitgevoerd op een Becton Dickinson FACSort flowcytometer en geanalyseerd met CellQuest Pro software of Beckman Coulter cyaan en geanalyseerd met top software. Gezuiverd varken maag H + /K + ATPase werd bereid in een 1:01 verhouding met Freund's volledig adjuvans (Life Technologies). Muizen werden subcutaan aan elke zijde van de staartbasis. H /Ka - /- en BALB /cCrSlc muizen werden tweemaal geïmmuniseerd met 30 ug van H + /K + ATPase, met een maand uit elkaar tussen de inentingen. Een week na de tweede immunisatie werden muizen gedood vanwege hun sera en inguinale lymfeknopen. H + /K + ATPase auto-antilichamen werden gedetecteerd door ELISA. Cellen van de inguinale lymfeknopen werden gebruikt in een T-celproliferatie assay. 1 × 10 5-cellen werden gekweekt gedurende 72 uur met 2 x 10 4 milt DC van BALB /cCrSlc muizen. T-cel proliferatie werd beoordeeld door incorporatie van 3H-thymidine over de laatste 16 uur van de cultuur. T-cellen werden gekweekt in drievoud met ofwel DC met antigen (50 ug /ml muis maag membraan) of DC alleen. Gastric membranen werden bereid uit muizen magen zoals eerder beschreven [5] inductie van autoimmune gastritis bij muizen CD4 + T-cellen werden verrijkt tot gt van &;. 85% zuiverheid van lymfeknopen en de milt van H /Ka - /- en BALB /cCrSlc muizen. Enkele cel suspensies werden geïncubeerd in een mix van F4 /80 en B220 hybridoma supernatanten plus anti-CD8 antilichaam (53.6.72, BioXCell). De niet-CD4 cellen werden verwijderd onder toepassing van anti-rat IgG-gecoate magnetische korrels (Dynal, Invitrogen). CD4 + (5 x 10 7) T-cellen van ofwel H /Ka - /- of BALB /cCrSlc muizen werden geïnjecteerd in sublethaal bestraald (600 rad) wildkleur congenic BALB /cCrSlc.CD90.1 muizen via de intraperitoneale route. In sommige experimenten gezuiverd H /Ka - /- werden CD4 + T-cellen geïnjecteerd in bestraalde BALB /cCrSlc, H /Ka - /- en H /Kβ - /- muizen. Alle ontvangende muizen werden bestraald met 600 rad één dag voor T-cel-overdracht. Acht weken later werden ontvangende muizen gedood en magen, lymfeknopen en sera werden geoogst. BALB /cCrSlc en BALB.B6- Gasa Maag secties werden onderzocht op de aanwezigheid van pathologische veranderingen zoals eerder beschreven [24]. Scoren werd uitgevoerd in een blind mode en elke dia werd onafhankelijk gescoord door ten minste twee personen. Om de maag pH te meten, werden de muizen gedurende de nacht vasten vóór opoffering. Magen werden opengesneden en gespoeld met 1 ml zoutoplossing, die werd verzameld en gemeten met behulp van een pH-meter. Een ELISA aan H + /K + ATPase-specifieke autoantilichamen op te sporen werd uitgevoerd onder toepassing van gezuiverd varken H + /K + ATPase zoals eerder beschreven [29]. Statistische analyse Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism 5.0 (GraphPad). De gegevens werden geanalyseerd met behulp van de Mann-Whitney U-test of een Spearman correlatie te testen en een P-waarde < 0,05 werd als significant beschouwd
Introductie
Resultaten
H + /K + ATPase was significant groter in H /Ka - /- muizen dan in wildtype muizen (Figuur 1B). Daarom, zoals eerder is aangetoond in H /Kβ - /- muizen [23], is er ook een belangrijke T- en B-celreactie op H + /K + ATPase in H /Ka - /-. muizen die niet aanwezig is in wild-type muizen
, maar eerder, de T-cel inoculum.
Materialen en methoden
congene muizen [20] zijn eerder beschreven. Beide H /Ka - /- en H /Kβ - /- muizen waren groter dan 10 maal teruggekruist met BALB /cCrSlc. H /Ka - /- muizen werden gekruist om BALB /c.CD90.1 muizen H /Ka genereren - /-. CD90.1 muizen. Alle muizen werden in een conventionele dier faciliteit in de Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, de Universiteit van Melbourne onderhouden. Alle muizen en experimenten werden goedgekeurd door de Universiteit van Melbourne Animal Experimentation Ethics Committee.
Antilichamen en flow cytometrische analyse
Bepaling van T cel responsen in muizen geïmmuniseerd met H + /K + ATPase
congene muizen werden gebruikt in de experimenten thymectomie. Neonatale thymectomie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [20].
Histologisch onderzoek van magen en meting van gastrische pH
H + /K + ATPase-specifiek enzym-linked immunosorbent assay (ELISA)
.
Jong bloed herstelt vitaliteit bij ouderen
Dat Pepto je maagzweer waarschijnlijk niet zal helpen
COVID-19:hoe de ziekte eruit ziet
Xylitol en grapefruitzaadextract zijn veelbelovend bij het voorkomen van SARS-CoV-2-infectie,
Darmbacteriën in wespen helpen pesticiden te overwinnen
Leidt hypertensie altijd tot ernstige COVID-19?
Landen met een oudere bevolking hebben hogere SARS-CoV-2-infecties en sterfgevallen,
zegt studie Meer dan een jaar in de pandemie van de coronavirusziekte 2019 (COVID-19), veroorzaakt door het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), het verschil in de ernst va
Dysbiose in de darmflora kan ernstige secundaire infectie veroorzaken bij COVID-19-patiënten
Een interessante studie onder leiding van wetenschappers in de VS heeft onlangs onthuld dat de microbiële gemeenschap in de darm direct wordt beïnvloed door het ernstige acute respiratoire syndroom co
Visslijm kan een potentiële bron van antibiotica zijn, blijkt uit onderzoek
Met de komst van multiresistente bacteriën en het gebrek aan nieuwe antibiotica, onderzoekers zijn op zoek geweest naar nieuwe moleculen die deze ziekteverwekkers kunnen bestrijden. Een team van onder