PLoS ONE: Ein praktikables Modell ernst, hohe Inzidenz Autoimmun- Gastritis verursacht durch polyklonalen Effektor-T-Zellen und ohne Perturbation von regulatorischen T-Zellen

Abstrakt

Autoimmun- Gastritis resultiert aus dem Abbau von T-Zell-Toleranz gegenüber dem Magen-H ^{+ /K + ATPase. Die Magen-H + /K + ATPase ist verantwortlich für die Versauerung von Magensaft und besteht aus einer α-Untereinheit (H /K &agr;) und einer β-Untereinheit (H /K β). Hier zeigen wir, dass CD4 + T-Zellen von H /K α-defizienten Mäusen (H /K &agr; - /-) sind hochpathogene und Autoimmungastritis kann in subletal bestrahlte Wildtyp-Mäusen durch adoptiven Transfer von unfraktioniertem CD4 induziert werden + T-Zellen von H /K &agr; - /- Mäusen. Alle Empfängermäuse, die schwerste Form der Autoimmungastritis 8 Wochen nach dem Transfer konsequent weiterentwickelt, mit Hypertrophie der Magenschleimhaut, vollständige Verarmung der parietalen und zymogenic Zellen und das Vorhandensein von Antikörpern gegen H + /K + ATPase in Serum. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Krankheit deutlich Magen Gewicht und Magen-pH von Empfängermäuse betroffen. Depletion von Belegzellen in diesem Krankheitsmodell erforderlich, um die Anwesenheit von sowohl H /K &agr; und H /K β, da der Transfer von H /K &agr; - /- CD4 + T-Zellen nicht zu einer Verarmung der Belegzellen in H zur Folge haben /K &agr; - /- oder H /K β - /- Empfängermäuse. Die Konsistenz der Schwere der Erkrankung, die Verwendung von polyklonalen T-Zellen und eine spezifische T-Zellantwort auf das Autoantigen Magen dies eine ideale Krankheitsmodell machen für die Untersuchung zahlreicher Aspekte der organspezifischen Autoimmunerkrankungen einschließlich Prävention und Behandlung der Krankheit.}

Citation: Tu E, Ang DKY, Hogan TV, lesen S, Chia CPZ, Gleeson PA, et al. (2011) Eine bequeme Modell ernst, hohe Inzidenz Autoimmun- Gastritis von polyklonalen Effektor-T-Zellen verursacht und ohne Perturbation von regulatorischen T-Zellen. PLoS ONE 6 (11): e27153. doi: 10.1371 /journal.pone.0027153

Editor: Ciriaco A. Piccirillo, McGill University Health Center, Kanada

Empfangen: 21. Januar 2011; Akzeptiert: 11. Oktober 2011; Veröffentlicht: 9. November 2011

© 2011 Tu et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium von der National Health and Medical Research Council of Australia und der University of Melbourne unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:. Die Autoren bestätigen können, dass Simon Read an der University of Melbourne war, als diese Studie war Novo abgeschlossen und dass Nordisk ist seine aktuelle Adresse. Die Autoren haben erklärt, keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Einführung

Autoimmun- Gastritis ist ein ausgezeichnetes System den Verlust von T-Zell-Toleranz gegenüber Selbst Gewebe zu untersuchen, da es sich um eine gut charakterisierte Autoimmunerkrankung ist mit ein bekanntes Zielantigen und das Maus-Modell der Krankheit hat viele Ähnlichkeiten mit dem humanen äquivalent. Perniziöse Anämie, die im Endstadium der Autoimmun- Gastritis, hat eine geschätzte Prävalenz von 1,9% in West erwachsenen Bevölkerung im Alter von 60 Jahren [1], die die häufigste Ursache für Vitamin B für _{12-Mangel bei älteren Patienten [2] . Autoimmungastritis kennzeichnet Infiltration von mononukleären Zellen in der Submukosa, die in die Magenschleimhaut erstreckt, die Depletion von Magen parietalen und zymogenen Zellen und Hypertrophie der Magenschleimhaut [1].}

Das Zielantigen in Autoimmungastritis identifiziert worden ist wie der Magen-H ^{+ /K + ATPase von Magen-Belegzellen exprimiert [3] - [5]. Die Magen-H + /K + ATPase ist eine Membran Protonenpumpe, die für die Ansäuerung von Magensaft und es ist ein Heterodimer, die β-Untereinheit (H einer katalytischen α-Untereinheit (H /K α) und einem Glycoprotein besteht /K β). Frühere Studien haben gezeigt, daß sowohl H /K α und H /K &bgr; werden in Autoimmungastritis gezielte [4], [6] - [8]. Es ist gut dokumentiert, dass in beiden Mäusen und Menschen, CD4 + T-Zellen, die die Magen-H + /K + ATPase initiieren Autoimmun- Gastritis, während CD8 + T-Zellen und B-Zellen erkennen sind unwirksam dabei [7] - [17]. Dennoch nach Beginn der Krankheit, Autoantikörper gegen das H + /K + ATPase hergestellt und sind ein sehr nützliches Diagnosewerkzeug der Krankheit obwohl sie nicht pathogen sind, [3], [16], [18 ].}

BALB /c-Mäuse, die am anfälligsten für Lymphopenie induzierte Autoimmungastritis mit einer Häufigkeit von 30-90% [19], [20] gezeigt werden, wurden. Die Krankheit kann durch thymectomy von 3 Tage alten Mäusen oder erwachsenen thymectomy kombiniert mit einer einzigen Dosis von Cyclophosphamid [19], [21] ausgelöst werden. Trotz dieser, ist es schwierig, therapeutische Wirkung von Behandlungen zu thymectomised Mäuse von leichter bis schwerer, da ein Spektrum von der Schwere der Erkrankung zu beurteilen gegeben wird immer beobachtet und Häufigkeit ist variabel, so dass große Gruppengrößen sind erforderlich, statistische Signifikanz zu testen. Darüber hinaus ging es um die Operation und die postoperative Pflege von Tieren ist technisch anspruchsvoll. Autoimmungastritis können auch in BALB /c Mäusen durch Immunisierung mit gereinigtem Magen H ^{+ /K + ATPase [5] induziert werden. Jedoch ist die Erkrankung reversibel nach Beendigung der Immunisierung und hat eine niedrige Härte. Übertragung von Balb /c-T-Zellen verarmt regulatorischer T (Treg-Zellen) in athymische Empfängermäusen verursacht schwere Autoimmun Gastritis [15]. Es ist daher unmöglich, die Beziehung zwischen der autoreaktiven T-Zellen und Treg-Zellen während der Krankheitsentwicklung in dieser Einstellung, da Treg-Zellen fehlen zu sezieren.}

Hohe Häufigkeit von spontanen Autoimmungastritis ist in transgenen Mäusen beobachtet einen TCR spezifisch für exprimierenden H /K α [8]. Allerdings sind diese Mäuse keine ideale Krankheitsmodell für alle Experimente darstellen, da der monoklonale Natur der pathogenen T-Zellen nicht das polyklonale Antwort rekapitulieren, die in pathophysiologischen Bedingungen auftritt.

Aus dieser Perspektive entwickelten wir ein Krankheitsmodell die stützte sich auf die Übertragung von polyklonalen T-Zellen von H /K &agr;-defizienten (H /K &agr; ^{- /-) Mäuse in subletal bestrahlten Wildtyp-Mäusen. Wir haben gezeigt, dass Mäuse, die unfraktioniertes T-Zellen von H /K &agr; erhalten - /- Mäuse alle zu den schwersten Autoimmun- Gastritis mit pathologischen Veränderungen während des gesamten Magen beobachtet erlegen. Darüber hinaus beeinflusst diese pathologischen Veränderungen signifikant die Physiologie des Magens. Wir haben gezeigt, die Nützlichkeit dieses Modells durch die zeigen, dass die Entwicklung von Autoimmun Gastritis in diesem Modell auf die Anwesenheit der beiden H + /K streng abhängig war + ATPase α und β-Untereinheiten.}

Ergebnisse

Erhöhte T- und B-Zell-Antwort in H /K &agr; ^{- /- Mäusen nach Immunisierung mit H + /K + ATPase}

um ein System zu haben, das geeignet ist für die Untersuchung der verschiedenen Aspekte der Autoimmunität, haben wir ein Krankheitsmodell, bei dem die Krankheit durch pathogene polyklonalen T-Zellen verursacht wird, und der schwere der Erkrankung ist durchweg streng. Ein T-Zellantwort auf H /K α ist für die Entstehung von Autoimmungastritis erforderlich und kann die dominante Quelle von Magenautoreaktiver Epitope [7], [8], [22] sein. Als T-Zell-Toleranz gegenüber H /K α unwahrscheinlich war, in H /K α aufzutreten ^{- /- Mäuse, untersuchten wir, ob T-Zellen, die spezifisch für H waren + /K + ATPase und in der Lage das zu verursachen Gastritis waren in H /K &agr; - /-. Mäuse}

um festzustellen, ob es wurden erhöhte Immunantwort auf H ^{+ /K + ATPase in H /K &agr; - /- Mäuse relativ zu Wildtyp-Mäuse, Mäuse wurden zweimal mit gereinigtem Magen-H + /K + ATPase immunisiert. - /- Mäusen nicht aber in Wildtyp-Mäusen (1A) nach der Immunisierung, Autoantikörper, spezifisch für H + /K + ATPase wurden in dem immunisierten H /K &agr; erkannt. T-Zellantwort auf in vitro Restimulation mit
H + /K + ATPase war ebenfalls signifikant höher in H /K &agr; - /- Mäusen als in Wildtyp-Mäusen (1B). Daher ist, wie zuvor in H /K &bgr; gezeigt worden - /- -Mäusen [23], gibt es auch eine signifikante T und B-Zellantwort auf H + /K + ATPase in H /K &agr; - /-. Mäuse, die nicht in Wildtyp-Mäusen ist}

CD4 ^{+ T-Zellen von H /K &agr; - /- Mäuse waren hoch pathogene}

Um festzustellen, ob adoptiven Transfer von T-Zellen von H /K &agr; ^{- /- Mäuse Autoimmungastritis verursachen könnte, wir CD4 + T-Zellen von entweder H /K &agr; angereichert - /- oder Wildtyp-Mäusen zu ~ 85 % Reinheit und transferiert 5 x 10 7 dieser Zellen in subletal bestrahlte Wildtyp-Mäusen. Da es wurde zuvor gezeigt, daß H + /K + ATPase-spezifischen CD4 + T-Zellen wurden in der Peripherie schnell gelöscht und nicht in der Lage Autoimmungastritis in nicht bestrahlten Wildtyp-Mäusen zu induzieren [24], wobei alle Empfängermäuse in dieser Studie verwendet wurden leicht bei 600 rads bestrahlt, um das Überleben der übertragenen T-Zellen von H /K &agr; zu verbessern - /-. Mäuse}

Acht Wochen nach dem Transfer, Mäuse, die H /K &agr; erhalten ^{- /- CD4 + T-Zellen alle schwersten Formen von Autoimmun Gastritis entwickelt (Score 5 und 6). Dies wurde durch die vollständige Abreicherung von Parietalzellen und zymogenen Zellen und Hypertrophie der Magenschleimhaut (2A, 2B) gezeigt. Im Gegensatz dazu Mäuse, die Wildtyp-CD4 erhielt + waren T-Zellen vollständig frei von Gastritis (2A, 2B), die ergab, dass Autoimmun Gastritis bei Mäusen H /K &agr; Empfang - /- CD4 + T-Zellen nicht verursacht durch Bestrahlung per se
, sondern Inokulum die T-Zelle.}

Pathologische Veränderungen im Magen von gastritischen Mäusen signifikant beeinflusst den Magen Physiologie. Hypertrophie der Magenschleimhaut führte zur Erweiterung des Magens Rugae (2C) und eine Erhöhung der Magen Gewicht (2D). Zweitens Abreicherung von Parietalzellen verursachte einen Anstieg im Magen pH aufgrund des Fehlens der Säuresekretion (Figur 2E). Darüber hinaus Autoantikörper spezifisch für die Magen-H ^{+ /K + ATPase konnte in allen gastritischen Mäusen (2F) nachgewiesen werden. Autoantikörper ein hohes Niveau erreicht in allen Mäusen 6 Wochen nach der Übertragung (2G). Zusammen zeigten diese Ergebnisse das Vorhandensein von hochpathogenen H + /K + ATPase-spezifischen T-Zellen in H /K &agr; - /-. Mäuse}

Autoimmun- Gastritis durch CD4 verursacht wurde ^{+ T-Zell-vermittelten Entzündung}

Mäuse mit Autoimmun Gastritis induziert durch die Übertragung von H /K &agr; ^{- /- CD4 + T-Zellen hatten deutlich mehr Zellen in ihrem Magen-Entleerung paragastric Lymphe verglichen Knoten zu normalen Mäusen und Mäusen, die CD4 + T-Zellen von Wildtyp- Spendern. Im Gegensatz dazu gab es keinen Unterschied in der Größe der inguinalen Lymphknoten zwischen gastritischen und nicht-gastritischen Mäuse (3A). Dies legte nahe, dass die Zunahme in der Zellularität von paragastric Lymphknoten in gastritischen Mäusen durch lokale Magenentzündung verursacht wurde und nicht durch Vorzugs Überleben oder Expansion von H /K &agr; - /- CD4 + T-Zellen im Vergleich zu Wildtyp-CD4 + T-Zellen nach der Übertragung}

Bei diesen Experimenten wurden Zellen vom Spender H /K &agr; ^{-. /- oder Wildtyp-Mäusen konnte von Empfängerzellen unterschieden werden, weil sie unterschiedliche CD90-Allele trugen. Die Spenderpopulation im paragastric Lymphknoten von Mäusen, die H /K &agr; erhalten - /- CD4 + T-Zellen hatten deutlich mehr CD4 + T-Zellen mit einem Effektor /Memory-Phänotyp (CD44 hiCD62 lo) im Vergleich zu Mäusen, die Wildtyp-CD4 erhielt + T-Zellen. Allerdings waren die Mengen an Effektorzellen /Gedächtnis-T-Zellen ähnlich in dem nicht-drainierenden Lymphknoten (3B). Zusammen legen diese Ergebnisse nahe, dass die Entwicklung von Autoimmungastritis in Mäusen, die CD4 empfangen + T-Zellen von H /K &agr; - /- Mäusen durch eine T-Zell-vermittelten Entzündungsreaktion in der Magenumgebung verursacht wurde und nicht als generalisierte Reaktion.}

die Entwicklung von Autoimmungastritis in diesem Krankheitsmodell wurde nicht mit einem reduzierten Niveau von regulatorischen T (Treg-Zellen), da gastritischen Mäuse enthielten ähnliche Anteile von Treg-Zellen im paragastric Lymphknoten im Vergleich zu nicht assoziiert -gastritic Kontrollen (4A, 4B). . /- - CD4 ^{+ T-Zellen schnell induzierte Gewebeschädigung In der Tat waren deutlich mehr Treg-Zellen im Magen von Mäusen, die mit Autoimmungastritis (4A, 4C)}

H /K &agr; ^{gefunden im Magen}

die Schwere der Autoimmungastritis wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Übertragung der H /K &agr; ^{analysiert - /- CD4 + T-Zellen. Moderate Abreicherung von Parietalzellen und zymogenen Zellen, wie durch eine Gastritis Score von 4 [24] angegeben ist, werden konnten bereits 2 Wochen nach der Übertragung beobachtet, und die Krankheit fortgeschritten schnell mit den meisten der Mäuse schweren Gastritis zeigt, wie durch eine gezeigten Gastritis Score von 5 und 6, 4 Wochen nach dem Transfer (Abbildung 5).}

Magen Gewicht kann als quantitatives Maß für Autoimmungastritis
verwendet werden

Wir haben, dass Mäuse, die mit Autoimmun Gastritis gezeigt hatte ein größeres Gewicht als Magen krankheitsfreie Mäuse aufgrund der Hypertrophie der Magenschleimhaut (2D). Daher untersuchten wir, ob Magen Gewicht als quantitatives Maß für die Schwere der Autoimmungastritis verwendet werden könnten. Zur weiteren Test, wenn Magen Gewicht zwischen verschiedenen Schwierigkeitsgraden von Autoimmungastritis unterscheiden konnte, untersuchten wir neonatal-thymectomised Mäuse als eine größere Anzahl von Mäusen, die mit variabler Krankheit Scores erhalten werden konnte. Wir fanden, dass es signifikante Unterschiede in den mittleren Magen Gewicht zwischen jedem der ersten fünf Stufen der Autoimmungastritis (Score 0-4) (Bild 6). Jedoch waren die mittleren Gewichte der Magen Gastritis Scores 4, 5 und 6 nicht signifikant voneinander verschieden (Figur 6). Dies ist wahrscheinlich aufgrund der Tatsache, dass der Grad der Hypertrophie der Magenschleimhaut nicht erhöht, wie sich die Krankheit auf den späten Stadien fortschreitet

Induktion von Autoimmungastritis durch H /K &agr; ^{-. /- CD4 + T-Zellen abhängig war von der Anwesenheit von H /K α und H /K β}

Hypothese aufgestellt, wir, dass die Pathogenität von CD4 ^{+ T-Zellen von H /K &agr; - /- Mäusen wurde durch die mangelnde Toleranz gegenüber H /K &agr; in Abwesenheit dieser Magenautoantigen. Um dies zu testen, CD4 + T-Zellen wurden von H /K &agr; übertragen - /- Mäuse in subletal bestrahlten H /K &agr; - /- und Wildtyp-Mäusen. Es wurde gezeigt, daß H /K &agr; in Abwesenheit von H /K β, kann nicht durch MHC-Moleküle [25] (S Allen, persönliche Mitteilung) vorgelegt. Wir haben daher übertragen CD4 + T-Zellen von H /K &agr; - /- Mäuse in subletal bestrahlten H /K β - /- Mäuse und verglichen sie mit H /K &agr; - /- und Wildtyp Empfängermäuse. /- - Die Analyse von Autoimmunangriff auf die Magenschleimhaut ist in H /K &agr; kompliziert und H /K &bgr; - /- Mäuse von den Veränderungen, die in der Magenschleimhaut, da ein Mangel an Magensäure in diesen Mäusen vorkommen Ergebnisse in erhöhten Mengen des trophischen Hormon Gastrin. Dies führt zu einer konstitutiven Hypertrophie und die Erschöpfung der zymogenic Zellen [26]. Daher wird, um zu beurteilen, ob eine Autoimmunantwort die Magenschleimhaut in diesen Mäusen angreift, sondern wir die Prävalenz der parietalen Zellen bestimmt, die in Autoimmungastritis normalerweise aufgebraucht sind, sind jedoch im Überfluss in H /K &agr; gefunden - /- und H /K β - /- Mäuse, und auch das Vorhandensein von Magen-Autoantikörper}

der Magen-Morphologie in H /K &agr; ^{-. /- Mäuse oder H /K β - /- Mäuse wurde nicht durch die Übertragung von H /K α betroffen - /- CD4 + T-Zellen (7A, 7B). Insbesondere gab es keine Abreicherung von Parietalzellen Angabe der Mangel an einer Autoimmunantwort. Im Gegensatz dazu wurde eine vollständige Verarmung der parietalen Zellen in Wildtyp- Empfängermäuse gesehen, die H /K &agr; erhalten - /- CD4 + T-Zellen (7C). Da Mägen von H /K &agr; - /- und H /K β - /- Mäuse zu verschiedenen erschien sowohl normale als auch gastritischen Mäuse, konnten wir nicht diese Mäuse mit unserem Standard-Gastritis Scoring-System zu bewerten. Jedoch H + /K + ATPase-spezifische Autoantikörper, ein weiteres Merkmal der Autoimmungastritis, wurden in den Seren von sowohl H /K &agr; nicht erkannt - /- und H /K &bgr; - /- Empfängermäuse, wurden aber in Wildtyp- Empfängermäuse (Abbildung 7D) nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Anwesenheit der beiden α und β-Untereinheiten wurde zur Abreicherung von Parietalzellen erforderlich durch H /K &agr; - /-. CD4 + T-Zellen}

Diskussion

Autoimmungastritis kann in BALB /c-Mäusen durch verschiedene Mittel, einschließlich neonataler thymectomy, adult thymectomy mit Cyclophosphamid [19], [21], die Immunisierung mit Magen H ^{+ /K + ATPase [5] und induziert werden Erzeugung von H + /K + ATPase-spezifischen TCR-transgenen Mäusen [7], [8]. ein Immunsystem dominiert von T-Zellen mit einer einzigen Spezifität jedoch, wie in TCR-transgenen Mäusen beobachtet nicht normalen physiologischen Bedingungen ähneln. Weiterhin thymectomy und Immunisierungs haben kein konsistent Schwere der Erkrankung, und sie sind technisch anspruchsvoll, was es unbequem macht diese Modelle für die Analyse von Immuntherapien zu verwenden. Wir entwickelten deshalb ein neues Krankheitsmodell, das auf den Transfer von T-Zellen von H /K &agr; verlassen - /-. Mäuse, um einen polyklonalen Population, die stark gastritogenic T-Zellen enthalten}

Wir fanden, dass die Immunisierung von H /K &agr; ^{- /- Mäuse mit gereinigtem H + /K + induzierte ATPase eine kräftige T-Zell-Antwort als Ergebnis des Fehlens von T-Zell-Toleranz gegenüber dem Magen-Autoantigen, das die Anwesenheit von H angegeben + /K + ATPase-spezifischen T-Zellen in H /K &agr; - /- Mäusen. Wir haben gezeigt, weiter, dass der Transfer von CD4 + T-Zellpopulationen von H /K &agr; - /- Mäuse Schäden an den Magen Gewebe der Empfängermäuse bald nach dem Transfer induziert. Autoimmungastritis, induziert durch den Transfer von H /K &agr; - /- CD4 + T-Zellen war durchweg schwer: alle Empfängermäuse die schwerste Krankheit acht Wochen nach Transfer und ihre Magenphysiologie entwickelt wurde deutlich, wie angegeben betroffen die Zunahme der Magen Gewicht und pH-Wert. Dieses Modell ist von Vorteil, da die Schwere und Häufigkeit von Krankheiten Ansätze, die noch in TCR-transgenen Mäusen beobachtet von einem polyklonalen Repertoire verursacht wird, ist es technisch einfach herzustellen, ist es nicht auf der normalen Treg-Zell-Repertoire Störung beruht.}

die Bevölkerung Spenderzelle aus dem H /K &agr; ^{- /- Mäuse auf ~ 85% CD4 angereichert wurde + T-Zellen durch eine "negative Selektion" Verfahren, weil das Hauptziel dieser Arbeit eine einfach herzustellen war , billige und bequeme Krankheitsmodell. Wir schließen daraus, dass es die CD4 ist + T-Zellen in dem Inokulum, die Autoimmungastritis verursacht, da es durch viele Studien etabliert wurde, dass CD4 + T-Zellen und nicht die anderen Zelltypen in der Lage, Autoimmungastritis zu initiieren [7 ] - [17]. Es ist klar, dass T- und B-Zell-Populationen reaktiv auf die H + /K + ATPase im Repertoire von normalen Mäusen vorhanden sind [5], [14] - [16], [21], [24 ], [28] - [33]. Daher schlagen wir vor, dass die H + /K + ATPase-spezifische T- und B-Zellen aus dem Empfänger dann auf die Läsion rekrutiert werden und die Empfänger-derived B-Zellen sind verantwortlich für die Produktion von Autoantikörpern.}

zuvor dokumentiert wurde, dass CD4 ^{+ T-Zellen von H /K &bgr; - /- Mäusen in athymischen BALB /c-Mäuse Autoimmungastritis induzieren, aber nicht in Wildtyp-bestrahlten Mäusen [24]. CD4 + T-Zellen von H /K &agr; - /- Mäuse Gastritis in bestrahlten Wildtyp-Mäusen verursacht was darauf hindeutet, dass diese Population mehr pathogen als CD4 + T-Zellen von H /K β - /- Mäuse . Diese Daten stützen eine dominierende Rolle für die Immunantwort gegen H /K &agr; in der Pathogenese von Autoimmungastritis, im Einklang mit den Ergebnissen in TCR-transgenen Mäusen [7], [8].}

Im Gegensatz zu anderen Krankheitsmodellen, die Treg Zelle verwendet -abgereicherte polyklonalen T-Zellen von Mäusen, Wildtyp-Autoimmunität zu induzieren [15], war es nicht notwendig, Treg-Zellen aus H /K &agr; ^{zu entfernen - /- CD4 + T-Zellpopulation für die Induktion einer schweren Autoimmun Gastritis. Darüber hinaus wurde die Entwicklung von Autoimmun Gastritis in den Empfängermäusen nicht durch einen reduzierten Gehalt an Treg-Zellen aus dem Spenderpopulation verursacht, da gastritischen Mäuse ähnlich hoher Anteil von Treg-Zellen in der paragastric Lymphknoten enthalten im Vergleich zu nicht-gastritischen Kontrollen. Wir haben zuvor gezeigt, dass Treg-Zellen von H /K &agr; - /- Mäuse waren so wirksam wie Treg-Zellen von Wildtyp-Mäusen bei der Unterdrückung von H /K α spezifische autoreaktiven T-Zellen [34]. Daher sind unsere Ergebnisse unterstützen hier bisherigen Arbeit darauf hinweist, dass T-Zell-Repertoires, die nicht peripheren T-Zell-Deletion sind nicht in der Lage unterzogen hatten durch die normale Treg Zellpopulation unterdrückt werden [24], [35].}

Obwohl ein normales Niveau von Treg-Zellen wurde in der paragastric Lymphknoten von gastritischen Mäuse und ein deutlich höherer Prozentsatz der Treg-Zellen nachgewiesen wurde, in den Magen von gastritischen Mäusen im Vergleich zu normalen Mäusen, Treg-Zellen waren nicht in der Lage, zu verhindern oder zu unterdrücken Krankheit. Dies steht im Einklang mit der Erkenntnis, dass, obwohl Treg-Zellen im ZNS akkumuliert, wenn experimentelle allergische Enzephalomyelitis ausgelöst wurde [36], sie nicht in der Lage waren die Expansion und die Funktion des Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-spezifische T-Zellen zu verhindern, da die lokale inflammatorische Zytokin milieu gerenderte pathogenen T-Zellen resistent gegen Treg-Unterdrückung.

Depletion von Belegzellen ist ein Markenzeichen von Autoimmungastritis und der Hauptgrund, dass Perniziosa eine lebensbedrohliche Krankheit ist, weil Belegzellen Intrinsic-Faktor produzieren, deren Fehlen ist tödlich . Wir fanden heraus, dass Erschöpfung der Belegzellen in diesem Krankheitsmodell auf das Vorhandensein beider H abhängig war ^{+ /K + ATPase-Untereinheiten als CD4 + T-Zellen von H /K &agr; - /- Mäuse nur parietalen Zell-Depletion in Wildtyp- Mäusen induziert, aber nicht in H /K &agr; - /- und H /K β - /- Mäusen. Parietal Zell-Depletion wurde nicht von T-Zell-Antwort in Richtung H /K β da H /K &agr; verursacht - /- CD4 + T-Zellen induzieren nicht parietalen Zell-Depletion in H /K &agr; - /- Empfängermäuse während H /K &bgr; wurde in diesen Mäusen exprimiert [26]. Auf der anderen Seite, das Fehlen von parietalen Verarmungs Zelle in H /K β - /- Empfängermäuse, die H /K &agr; erhalten - /- CD4 + T-Zellen, unsere früheren Studien weisen auf die Notwendigkeit für H verstärkt /K &bgr; für H /K α, um durch MHC-Moleküle [22] dargestellt werden. Zusammen vorgeschlagen diese Ergebnisse, dass Parietalzellen Verarmungs in diesem Übertragungsmodell als eine Folge von Immunantworten auf H /K &agr; von CD4 entwickelt + T-Zellen von H /K &agr; - /- Mäusen. Wir nehmen zur Kenntnis, dass in früheren Arbeit, die wir, dass die Belegzellen erschöpft sind nicht gefunden haben entweder die H /K &agr; - /- noch H /K β - /- Mäusen nach neonatalen Thymektomie, die die Konsistenz dieses neuen Modells unterstreicht mit den Ergebnissen aus dieser früheren, gut etabliertes Modell.}

Wir haben auch hier, dass Magen Gewicht nachgewiesen kann, da Hypertrophie der Magenschleimhaut als quantitatives Maß für die Schwere der Erkrankung verwendet werden, wurde bei Mäusen mit Autoimmun Gastritis beobachtet und führte in der Erhöhung der Magengewicht [37]. Es gab eine signifikante Korrelation zwischen Magen Gewicht und der Schwere der Autoimmungastritis in Mäusen, die H /K &agr; erhalten ^{- /- CD4 + T-Zellen. Dieser Zusammenhang wurde bestätigt, weiter in neonatal-thymectomised Mäuse, wobei die mittlere Magen Gewicht in jeder Gastritis zum anderen signifikant unterschiedlich sein konnte. Jedoch aufgrund der Variation innerhalb der Gruppen werden große Probenmenge erforderlich, wenn Magengewicht verwendet werden soll, der Schwere der Erkrankung abzuschätzen. Daher kann eine histologische Untersuchung in Kombination mit Magen Gewicht als ergänzende Maßnahmen angesehen werden, um die Schwere der Autoimmungastritis Beurteilung}

Wir haben gezeigt, dass Autoimmun Gastritis induziert durch adoptiven Transfer von H /K &agr; ^{-. /- CD4 + T-Zellen repräsentiert eine ausgezeichnete Krankheitsmodell für die Dissektion von Autoimmunantwort und die Gestaltung von intervenierender Therapie für Autoimmunerkrankungen. In diesem Krankheitsmodell wurde Autoimmun- Gastritis durch eine unfraktioniertem polyklonalen T-Zellpopulation verursacht, die pathogenen T-Zellen, die spezifisch für ein einziges Antigen enthielt, und gleich bleibend hohe Grad der Schwere der Erkrankung wird in allen Empfängermäusen beobachtet. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Schwere der Krankheit leicht durch Magen Gewicht, Magen-pH und histologische Untersuchung von Magen-Abschnitt ermittelt werden konnte.}

Materialien und Methoden

Aussage
Ethik

Diese Arbeit sucht eine genauere Kenntnis von Autoimmunerkrankungen und die immunologischen Mechanismen zu erhalten, die Autoimmunität bei normalen Personen zu verhindern. Da das Immunsystem ein hochkomplexes, integriertes Netzwerk ist, werden die Tiere erforderlich ist, um diese Probleme zu bewerten.

Die meisten Verfahren wurden klinische Tests an Proben Blut und Gewebe von Mäusen entnommen worden waren, die in sehr gutem Wohnbedingungen gehalten werden, . Die Mäuse wurden streng überwacht und getötet, wenn schwerwiegend beeinträchtigt oder beunruhigt. Am Ende jedes Experiments wurden die Mäuse durch CO 2 Ersticken oder Genickbruch getötet, die mit einem Minimum an Not verbunden sind.

sind alle Experimente sorgfältig geplant Tierzahlen zu reduzieren und sind in die strikte Einhaltung von Richtlinien durchgeführt diktiert von der University of Animal Experimentation Ethikkommission Melbourne; die Verhinderung von Tierquälerei Act 1986; und die NHMRC /CSIRO /AAC Australian Code of Practice für die Pflege und Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke (1997).

Diese Arbeit wurde von der University of Melbourne Tierethikkommission unter der Projektnummer 0.706.327,3 genehmigt wurde.

Mäuse

BALB /cCrSlc [38], BALB /cCrSlc.CD90.1 congenic, H /K &agr; ^{- /- [26], H /K β - /- [ ,,,0],27] und BALB.B6- Gasa
kongenen Mäusen [20] wurden zuvor beschrieben. Beide H /K &agr; - /- und H /K &bgr; - /- Mäusen hatten mehr als 10-mal BALB /cCrSlc rückgekreuzt worden. H /K &agr; - /- Mäuse zu BALB /c.CD90.1 Mäusen gekreuzt wurden H /K &agr; zu erzeugen - /-. CD90.1 Mäusen. Alle Mäuse wurden in einem konventionellen Tierhaltung an der Bio21 Molecular Science und Biotechnologie Institute, The University of Melbourne gehalten. Alle Mäuse und Experimente wurden von der University of Melbourne Tierversuche Ethikkommission genehmigt.}

Antikörper und Zytometrie Analyse
fließen

Anti-CD3-FITC (145-2C11), Anti-CD90.1- FITC (HIS51), anti-CD90.2-FITC (30H-12), Anti-CD62L-PE (MEL-14), anti-CD4 PerCP (RM4-5) und anti-CD8-APC (53-6,7) wurden von BD Pharmingen gekauft; anti-CD44-APC (IM-7) wurde von eBioscience gekauft. Die intrazelluläre Färbung von Foxp3 wurde anti-Foxp3-APC unter Verwendung von (FJK-16S) und Foxp3 Färbekit (eBioscience) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Durchflusszytometrie auf einem Becton Dickinson FACSort durchgeführt wurde Durchflusszytometer und analysiert Cellquest Pro Software oder Beckman Coulter CyAn mit und analysiert Summit Software.

Test der T-Zell-Antworten in Mäusen, die mit H + /K + ATPase

Gereinigtes Schwein Magen-H ^{+ /K + ATPase wurde in einem Verhältnis 01.01 Uhr mit Freund-Adjuvans (Life Technologies) hergestellt. Die Mäuse wurden subkutan an jeder Seite der Schwanzbasis injiziert. H /K &agr; - /- und BALB /cCrSlc Mäuse wurden zweimal mit 30 &mgr; g H immunisiert + /K + ATPase, mit Abstand von einem Monat zwischen den Immunisierungen. Eine Woche nach der zweiten Immunisierung wurden die Mäuse für ihre Seren und inguinalen Lymphknoten geopfert. H + /K + ATPase-spezifische Autoantikörper wurden mittels ELISA nachgewiesen. Zellen aus den inguinalen Lymphknoten wurden in einem T-Zellproliferationstest verwendet. 1 x 10 5-Zellen wurden für 72 Stunden kultiviert mit 2 x 10 4 splenic DC aus BALB /cCrSlc Mäusen. T-Zellproliferation wurde durch Einbau von 3 H-Thymidin während der letzten 16 Stunden der Kultur untersucht. T-Zellen wurden in dreifacher Ausführung mit entweder DC mit Antigen (50 &mgr; g /ml Maus Magenmembran) oder DC allein. Magen-Membranen wurden aus der Maus Mägen hergestellt, wie zuvor beschrieben [5]}

Induktion von Autoimmungastritis in Mäusen

CD4 ^{+ T-Zellen wurden angereichert auf >. 85% Reinheit aus Lymphknoten und Milzen von H /K &agr; - /- und BALB /cCrSlc Mäusen. Einzelzellsuspensionen wurden in einer Mischung aus F4 /80 und B220 Hybridomüberstände plus anti-CD8-Antikörper (53.6.72, BioXCell) inkubiert. Die nicht-CD4-Zellen wurden unter Verwendung von IgG-beschichteten magnetischen Kügelchen (Dynal, Invitrogen) anti-Ratte entfernt. CD4 + (5 x 10 7) T-Zellen von entweder H /K &agr; - /- oder BALB /cCrSlc Mäuse in subletal bestrahlt (600 Rad) injiziert wurden Wildtyp- congenic BALB /cCrSlc.CD90.1 Mäuse über die intraperitoneale Route. In einigen Experimenten gereinigt H /K &agr; - /- CD4 + T-Zellen wurden in bestrahlte BALB /cCrSlc, H /K &agr; injiziert - /- und H /K β - /- Mäusen. Alle Empfängermäuse wurden bei 600 rads einen Tag vor der T-Zell-Transfer bestrahlt. Acht Wochen später Empfängermäuse wurden getötet und Mägen, Lymphknoten und Seren geerntet wurden.}

BALB /cCrSlc und BALB.B6- Gasa
congenic Mäuse wurden in den thymectomy Experimenten verwendet. Neonatal thymectomy wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben [20].

Die histologische Untersuchung der Mägen und die Messung der Magen-pH

Stomach Schnitte wurden auf das Vorhandensein von pathologischen Veränderungen untersucht, wie zuvor beschrieben [24]. Scoring wurde in einem Blindversuch und jede Folie wurde unabhängig Tor von mindestens zwei Personen durchgeführt werden. Um den Magen-pH zu messen, wurden die Mäuse über Nacht vor der Tötung verhungert. Die Mägen wurden aufgeschnitten und in 1 ml Salzlösung gespült, die von einem pH-Meter gesammelt und gemessen wurde.

H + /K + ATPase-spezifische Enzym Linked Immuno Assay (ELISA)

Ein ELISA-H ^{+ /K + ATPase-spezifische Autoantikörper zu erkennen, wurde unter Verwendung von gereinigtem Schweine H durchgeführt + /K + ATPase, wie zuvor beschrieben [29].}

Die statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde durchgeführt, GraphPad Prism 5.0 (GraphPad) verwendet wird. Die Daten wurden unter Verwendung der analysierten Mann-Whitney-U-Test oder Spearman Korrelationstest und einen P-Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen
.

• PLoS ONE: Gene Expression Profiling in der Magenschleimhaut von Helicobacter pylori-infizierten und nicht infizierten Patienten, chronische Oberflächliche Gastritis
• PLoS ONE: Genauigkeit und Cut-off-Werte von Pepsinogene I, II und 17 Gastrin zur Diagnose von Magen-Fundus Atrophie: Einfluss von Gastritis