PLoS ONE: En Praktisk Model of Svær, høj forekomst Autoimmune Gastritis Forårsaget af Polyklonale effektor T-celler og uden forstyrrelse af Regulatory T-celler

Abstrakt

Autoimmune gastritis resultater fra fordelingen af ​​T-celle tolerance over for gastrisk H ^{+ /K + ATPase. Den gastriske H + /K + ATPase er ansvarlig for forsuring af mavesyre og består af en α subunit (H /Ka) og en β underenhed (H /Kβ). Her viser vi, at CD4 + T-celler fra H /Ka-deficiente mus (H /Ka - /-) er stærkt patogene og autoimmun gastritis kan induceres i subletalt bestrålet vildtype mus ved adoptiv overførsel af ufraktioneret CD4 + T-celler fra H /Ka - /- mus. Alle modtagende mus konsekvent udviklede den mest alvorlige form for autoimmun gastritis 8 uger efter overdragelsen, og byder på hypertrofi af maveslimhinden, komplet udtømning af parietale og zymogenisk celler, og tilstedeværelse af autoantistoffer til H + /K + ATPase i serummet. Desuden vi demonstreret, at sygdommen påvirkes væsentligt mave vægt og mave pH modtagende mus. Udtømning af parietalcellerne i denne sygdomsmodel krævede tilstedeværelse af både H /Ka og H /Kβ siden overførsel af H /Ka - /- CD4 + T-celler resulterede ikke i udtømning af parietalcellerne i H /Ka - /- eller H /Kβ - /- modtagende mus. Konsistensen af ​​sygdommens sværhedsgrad, brug af polyklonale T-celler og en specifik T-celle respons på den gastriske autoantigen gør dette til en ideel sygdomsmodel for studiet af mange aspekter af organspecifik autoimmunitet herunder forebyggelse og behandling af sygdommen.}

Henvisning: Tu E, Ang DKY, Hogan TV, Læs S, Chia CPZ, Gleeson PA, et al. (2011) En Praktisk Model of Svær, høj forekomst Autoimmune Gastritis Forårsaget af Polyklonale effektor T-celler og uden forstyrrelse af Regulatory T-celler. PLoS ONE 6 (11): e27153. doi: 10,1371 /journal.pone.0027153

Redaktør: Ciriaco A. Piccirillo, McGill University Health Center, Canada

Modtaget: Januar 21, 2011; Accepteret: 11 oktober 2011; Udgivet: 9 November, 2011

Copyright: © 2011 Tu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra National Health og Medical Research Council of Australia og University of Melbourne. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne kan bekræfte, at Simon Læs var på The University of Melbourne, når denne undersøgelse var afsluttet, og at Novo Nordisk er hans nuværende adresse. Forfatterne har erklæret der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Autoimmun gastritis er et fremragende system til at undersøge tabet af T-celle tolerance over for selv-væv, da det er et godt karakteriseret autoimmun sygdom med et kendt mål-antigenet og musemodel for sygdommen har mange ligheder med den humane ækvivalent. Perniciøs anæmi, slutstadiet af autoimmun gastritis, har en anslået prævalens på 1,9% i den vestlige voksne befolkning over 60 år [1], som repræsenterer den hyppigste årsag til vitamin B _{12 mangel hos ældre [2] . Autoimmun gastritis indeholder infiltration af mononukleære celler i submucosa som strækker sig ind maveslimhinden, udtømningen af ​​gastrisk parietale og zymogenisk celler og hypertrofi af maveslimhinden [1].}

målantigen i autoimmun gastritis er blevet identificeret som det gastriske H ^{+ /K + ATPase udtrykkes af gastriske parietalceller [3] - [5]. Den gastriske H + /K + ATPase er en membran protonpumpe ansvarlig for forsuring af mavesaft, og det er en heterodimer der består af en katalytisk α subunit (H /Ka) og et glycoprotein β underenhed (H /Kβ). Tidligere undersøgelser har vist, at både H /Ka og H /Kβ målrettes i autoimmun gastritis [4], [6] - [8]. Det er veldokumenteret, at i både mus og mennesker, CD4 + -T-celler, som genkender det gastriske H + /K + ATPase indlede autoimmun gastritis mens CD8 + T-celler og B-celler er ineffektiv dermed [7] - [17]. Ikke desto mindre, efter indledningen af ​​den sygdom, autoantistoffer til H + /K + ATPase er produceret og er et meget nyttigt diagnostisk værktøj af sygdommen, selv om de ikke er sygdomsfremkaldende [3], [16], [18 ].}

BALB /c-mus har vist sig at være den mest modtagelige for lymfopeni-induceret autoimmun gastritis med en forekomst på 30-90% [19], [20]. Sygdommen kan induceres ved thymektomi på 3 dage gamle mus eller voksen thymektomi kombineret med en enkelt dosis cyclophosphamid [19], [21]. På trods af dette, er det vanskeligt at vurdere terapeutiske virkninger af behandlinger givet til thymectomised mus, da et spektrum af sygdommens sværhedsgrad fra mild til svær altid overholdes, og forekomsten er variabel, er således store gruppe størrelser nødvendigt for at afprøve statistisk signifikans. Endvidere kirurgi involveret og postoperativ vedligeholdelse af dyr er teknisk krævende. Autoimmun gastritis kan også induceres i BALB /c-mus ved immunisering med oprenset gastrisk H ^{+ /K + ATPase [5]. Men sygdommen er reversibel efter ophør af immunisering og har en lav sværhedsgrad. Overførsel af BALB /c T-celler forarmet af regulatoriske T (Treg) celler i athymiske modtagende mus forårsager alvorlig autoimmun gastritis [15]. Det er derfor umuligt at dissekere forholdet mellem autoreaktive T-celler og Treg celler under sygdommen udvikling i denne indstilling, da Treg-celler er fraværende.}

Høj forekomst af spontan autoimmun gastritis er observeret i transgene mus, der udtrykker en TCR specifik for H /Ka [8]. Men disse mus ikke repræsenterer en ideel sygdom model for alle eksperimenter, fordi det monoklonale karakter af de patogene T-celler ikke rekapitulere den polyklonale reaktion, der forekommer i patofysiologiske forhold.

Ud fra dette perspektiv, har vi udviklet en sygdom model der har påberåbt sig overførsel af polyklonale T-celler fra H /Ka-mangel (H /Ka ^{- /-) mus i subletalt-bestrålede vildtype mus. Vi viste, at mus, der modtog ufraktionerede T-celler fra H /Ka - /- mus alle bukket til den strengeste autoimmun gastritis med patologiske ændringer, der observeres i hele mave. Desuden er disse patologiske ændringer væsentligt påvirket fysiologi maven. Vi viste nytten af ​​denne model ved at vise, at udviklingen af ​​autoimmun gastritis i denne model var strengt afhængig af tilstedeværelsen af ​​både H + /K + ATPase a- og p-subunits.}

Resultater

Forhøjet T og B-celle respons i H /Ka ^{- /- mus efter immunisering med H + /K + ATPase}

for at have et system der er egnet til undersøgelse af forskellige aspekter af autoimmunitet, vi etableret en sygdomsmodel, hvor sygdommen er forårsaget af patogene polyklonale T-celler og sygdommens sværhedsgrad er konsekvent alvorlige. En T-celle respons på H /Ka er nødvendig for indtræden af ​​autoimmun gastritis og kan være den dominerende kilde til gastriske autoreaktive epitoper [7], [8], [22]. Som T-celle tolerance over for H /Ka var usandsynlig i H /Ka ^{- /- mus, undersøgte vi, hvis T-celler, der var specifikke for H + /K + ATPase og kan medføre gastritis var til stede i H /Ka - /-. mus}

for at afgøre, om der var forhøjet immunrespons til H ^{+ /K + ATPase i H /Ka - /- mus i forhold til vildtypemus blev mus immuniseret to gange med oprenset gastrisk H + /K + ATPase. Efter immuniseringen, påvistes autoantistoffer specifikke for H + /K + ATPase i immuniserede H /Ka - /- mus, men ikke i vildtypemus (figur 1A). T-celle respons på in vitro
restimulering med H + /K + ATPase var også signifikant større i H /Ka - /- mus end i vildtype mus (Figur 1B). Derfor, som er tidligere påvist i H /Kβ - /- mus [23], er der også en betydelig T- og B-celle respons på H + /K + ATPase i H /Ka - /-. mus, der ikke er til stede i vildtype mus}

CD4 ^{+ T-celler fra H /Ka - /- mus højpatogen}

For at afgøre, om adoptiv overførsel af T-celler fra H /Ka ^{- /- mus ville kunne forårsage autoimmun gastritis, vi beriget CD4 + T-celler fra enten H /Ka - /- eller vildtypemus til -85 % renhed og overført 5 × 10 7 af disse celler til subletalt bestrålede vildtypemus. Da det tidligere blev påvist, at H + /K + ATPase-specifikke CD4 + T-celler blev hurtigt slettet i periferien og ude af stand til at fremkalde autoimmun gastritis hos ikke-bestrålede vildtype mus [24], alle recipientmus anvendt i dette studie blev let bestrålet ved 600 rad at øge overlevelsen af ​​overførte T-celler fra H /Ka - /-. mus}

Otte uger efter overførslen mus, der modtog H /Ka ^{- /- CD4 + T-celler alle udviklet de mest alvorlige former for autoimmun gastritis (score 5 og 6). Dette blev demonstreret ved den fuldstændige udtømning af parietalcellerne og zymogenisk celler og hypertrofi af maveslimhinden (figur 2A, 2B). I modsætning hertil mus, der modtog vildtype CD4 + T-celler var helt fri for gastritis (figur 2A, 2B), hvilket indikerede, at autoimmun gastritis i mus, der modtog H /Ka - /- CD4 + T-celler blev ikke forårsaget af bestråling per se
, men snarere, at T-celle inokulum.}

patologiske forandringer i maven af ​​gastritic mus væsentligt påvirket deres mave fysiologi. Hypertrofi af maveslimhinden resulterede i udvidelsen af ​​maven rugae (Figur 2C) og en stigning i maven vægt (Figur 2D). For det andet, udtømning af parietalcellerne forårsagede en stigning i maven pH på grund af manglen på syresekretion (Figur 2E). Desuden autoantistoffer specifikke for det gastriske H ^{+ /K + ATPase kunne påvises i alle gastritic mus (figur 2F). Autoantistoffer nået et højt niveau i alle mus 6 uger efter overdragelsen (figur 2G). Tilsammen udgør disse resultater viste tilstedeværelsen af ​​højpatogen H + /K + ATPase-specifikke T-celler i H /Ka - /-. Mus}

autoimmun gastritis var forårsaget af CD4 ^{+ T-cellemedieret inflammation}

Mus med autoimmun gastritis induceret ved overførsel af H /Ka ^{- /- CD4 + T-celler havde signifikant flere celler i maven drænende lymfeknuder paragastric knudepunkter sammenlignet med normale mus og mus, der modtog CD4 + T-celler fra vildtype donorer. I modsætning hertil var der ingen forskel i størrelsen af ​​den inguinale lymfeknude mellem gastritic og ikke-gastritic mus (Figur 3A). Dette antydede, at stigningen i cellularitet af paragastric lymfeknuder i gastritic mus var forårsaget af lokal gastrisk inflammation og ikke af præferentiel overlevelse eller udvidelse af H /Ka - /- CD4 + T-celler sammenlignet med vildtype CD4 + T-celler efter overførsel}

i disse forsøg celler fra donor H /Ka ^{-. /- eller vildtypemus kunne differentieres fra recipientceller fordi de bar forskellige CD90 alleler. Donoren befolkning i paragastric lymfeknude af mus, der fik H /Ka - /- CD4 + T-celler havde signifikant flere CD4 + T-celler med en effektor /memory fænotype (CD44 hiCD62 lo) i sammenligning med mus, der modtog vildtype CD4 + T-celler. Men niveauet af effektor /memory-T-celler var ens i den ikke-drænende lymfeknude (figur 3B). Tilsammen tyder disse resultater på, at udviklingen af ​​autoimmun gastritis hos mus, der modtog CD4 + T-celler fra H /Ka - /- mus var forårsaget af en T-cellemedieret inflammatorisk respons i det gastriske miljø snarere end en mere generaliseret respons.}

udviklingen af ​​autoimmun gastritis i denne sygdom model var ikke forbundet med en reduceret niveau af regulatoriske T (treg) celler da gastritic mus indeholdt tilsvarende fordeling af treg celler i paragastric lymfeknude sammenlignet med ikke -gastritic kontroller (figur 4A, 4B). Faktisk var signifikant flere Treg celler findes i maven af ​​mus med autoimmun gastritis (figur 4A, 4C)

H /Ka ^{-. /- CD4 + T-celler hurtigt induceret vævsbeskadigelse i maven}

sværhedsgraden af ​​autoimmun gastritis blev analyseret på forskellige tidspunkter efter overdragelsen af ​​H /Ka ^{- /- CD4 + T-celler. Moderat udtømning af parietalcellerne og zymogenisk celler, som angivet ved en gastritis score på 4 [24], kunne observeres så tidligt som 2 uger efter overførslen og sygdommen skred hurtigt med de fleste af musene viser svære gastritis, som vist ved en gastritis score på 5 og 6, 4 uger efter overførslen (figur 5).}

mave vægt kan anvendes som et kvantitativt mål for autoimmun gastritis

Vi har vist, at mus med autoimmun gastritis havde en større mave vægt end sygdomsfrie mus på grund af hypertrofi af maveslimhinden (figur 2D). Derfor undersøgte vi, hvis maven vægt kunne anvendes som et kvantitativt mål for sværhedsgraden af ​​autoimmun gastritis. For yderligere test, hvis maven vægt kunne skelne mellem forskellige sværhedsgrader af autoimmun gastritis, vi undersøgte neonatally-thymectomised mus som kunne opnås større antal mus med variabel scoringer sygdom. Vi fandt, at der var signifikante forskelle i den gennemsnitlige mave vægt mellem hver af de første fem niveauer af autoimmun gastritis (score 0-4) (figur 6). Imidlertid er de gennemsnitlige mave vægtene af gastritis scorer 4, 5 og 6 var ikke signifikant forskellige fra hinanden (figur 6). Dette skyldes sandsynligvis den kendsgerning, at graden af ​​hypertrofi af maveslimhinden ikke stiger som sygdommen skrider frem til de sene stadier

Induktion af autoimmun gastritis ved H /Ka ^{-. /- CD4 + T-celler var afhængig af tilstedeværelsen af ​​H /Ka og H /Kβ}

Vi antaget, at patogeniciteten af ​​CD4 ^{+ T-celler fra H /Ka - /- mus var forårsaget af den manglende tolerance over for H /Ka i mangel af denne gastrisk autoantigen. For at teste dette, blev CD4 + T-celler overført fra H /Ka - /- mus til subletalt-bestrålet H /Ka - /- og vildtypemus. Det er blevet påvist, at H /Ka, i mangel af H /Kβ, kan ikke fremlægge MHC molekyler [25] (S Allen, personlig kommunikation). Vi har derfor overført CD4 + T celler fra H /Ka - /- mus i subletalt-bestrålede H /Kβ - /- mus og sammenlignet dem med H /Ka - /- og vildtype recipientmus. Analysen af ​​autoimmune angreb på maveslimhinden er kompliceret i H /Ka - /- og H /Kβ - /- mus ved de ændringer, der sker i maveslimhinden Da fraværet af mavesyre i disse mus resulterer i forhøjede niveauer af det trofiske hormonet gastrin. Dette fører til konstitutiv hypertrofi og udtømning af zymogenisk celler [26],. Derfor, for at vurdere, om en autoimmun reaktion angriber maveslimhinden i disse mus, vi i stedet bestemmes forekomsten af ​​parietalcellerne, som normalt forarmet i autoimmun gastritis, men findes i overflod i H /Ka - /- og H /Kβ - /- mus og også tilstedeværelsen af ​​gastrisk autoantistoffer}

maven morfologi i H /Ka ^{-. /- mus eller H /Kβ - /- mus blev ikke påvirket ved overførsel af H /Ka - /- CD4 + T-celler (Figur 7A, 7B). Især var der ingen nedbrydning af parietalcellerne indikerer fraværet af en autoimmun reaktion. I modsætning hertil blev fuldstændig udtømning af parietalcellerne set i vildtype modtagende mus, der modtog H /Ka - /- CD4 + T-celler (Figur 7C). Da maver af H /Ka - /- og H /Kβ - /- mus syntes anderledes for både normale og gastritic mus, kunne vi ikke vurdere disse mus ved hjælp af vores standard gastritis pointsystem. Men H + /K + ATPase-specifikke autoantistoffer, en anden kendetegnende for autoimmun gastritis, ikke er påvist i sera fra både H /Ka - /- og H /Kβ - /- modtagende mus, men blev påvist i vildtype modtagende mus (figur 7D). Disse resultater viste, at tilstedeværelsen af ​​både a- og p-underenheder var nødvendig for udtømningen af ​​parietalcellerne af H /Ka - /-. CD4 + T-celler}

Diskussion

Autoimmun gastritis kan induceres i BALB /c mus af flere midler, herunder neonatal tymektomi, voksen thymektomi med cyclophosphamid [19], [21], immunisering med gastrisk H ^{+ /K + ATPase [5], og generation af H + /K + ATPase-specifikke TCR transgene mus [7], [8]. Men en immunsystem domineret af T-celler med en enkelt specificitet som observeret i TCR transgene mus ikke ligne normale fysiologiske betingelser. Desuden giver thymektomi og immunisering ikke giver konsekvent sygdommens sværhedsgrad og de er teknisk krævende, hvilket gør det besværligt at bruge disse modeller til analyse af immunterapier. Vi har derfor udviklet en ny sygdom model, der har påberåbt sig overførslen af ​​T-celler fra H /Ka - /-. Mus, et polyklonale befolkning, der indeholdt meget gastritogenic T-celler}

Vi fandt, at immunisering af H /Ka ^{- /- mus med oprenset H + /K + ATPase inducerede en kraftig T-celle-respons som følge af manglen på T-celle-tolerance over for gastrisk autoantigen, som indikerede tilstedeværelsen af ​​H + /K + ATPase-specifikke T-celler i H /Ka - /- mus. Vi endvidere påvist, at overførsel af CD4 + T-celle populationer fra H /Ka - /- mus induceret skade på mave væv af modtagende mus snart efter overførsel. Autoimmun gastritis induceret ved overførsel af H /Ka - /- CD4 + T-celler var konsekvent alvorlig: alle de modtagende mus udviklede den mest alvorlige sygdom otte uger efter overførsel og deres mave fysiologi blev væsentligt påvirket som angivet af stigningen i maven vægt og pH. Denne model er fordelagtig, fordi alvoren og forekomsten af ​​sygdomstilstande tilgange, observeret i TCR transgene mus endnu er forårsaget af et polyklonalt repertoire, er teknisk enkel at fastslå, at det ikke påberåbe sig forstyrrelse af den normale Treg cellerepertoire.}

donoren cellepopulationen fra H /Ka ^{- /- mus blev beriget til -85% CD4 + T-celler ved en "negativ selektion" procedure, fordi det store formål med dette arbejde var at producere en simpel , billig og bekvem sygdomsmodel. Vi konkluderer, at det er CD4 + T celler i podestof, der forårsagede autoimmun gastritis eftersom den er blevet fast etableret ved mange undersøgelser, der CD4 + T-celler og ikke andre celletyper kan initiere autoimmun gastritis [7 ] - [17]. Det er klart, at T- og B-celle-populationer reaktive til H + /K + ATPase er til stede i repertoire af normale mus [5], [14] - [16], [21], [24 ], [28] - [33]. Derfor foreslår vi, at H + /K + ATPase-specifikke T og B-celler fra modtageren derefter rekrutteret til læsionen og de modtagende-afledte B-celler er ansvarlige for produktionen af ​​autoantistoffer.}

Det er tidligere blevet dokumenteret, at CD4 ^{+ T-celler fra H /Kβ - /- mus inducerer autoimmun gastritis i athymiske BALB /c-mus, men ikke i bestrålede vildtypemus [24]. CD4 + T-celler fra H /Ka - /- mus forårsagede gastritis i bestrålede vildtype mus tyder på, at denne population er mere sygdomsfremkaldende end CD4 + T-celler fra H /Kβ - /- mus . Disse data understøtter en mere dominerende rolle for immunrespons mod H /Ka i patogenesen af ​​autoimmun gastritis, i overensstemmelse med resultater i TCR transgene mus [7], [8].}

I modsætning til andre sygdomsmodeller, der udnyttede treg celle -depleted polyklonale T-celler fra vildtypemus for at inducere autoimmunitet [15], var det ikke nødvendigt at fjerne Treg celler blandt H /Ka ^{- /- CD4 + T-celle population til induktion af alvorlig autoimmun gastritis. Desuden blev udviklingen af ​​autoimmun gastritis i modtagerlandene mus ikke er forårsaget af et reduceret niveau af Treg celler fra donor befolkning siden gastritic mus indeholdt lignende andel af Treg celler i paragastric lymfeknude sammenlignet med ikke-gastritic kontroller. Vi har tidligere vist, at Treg celler fra H /Ka - /- mus var så effektiv som tregs celler fra vildtypemus til undertrykkelse H /Ka-specifikke autoreaktive T-celler [34]. Derfor er vores resultater her støtter tidligere arbejde indikerer, at T-celle repertoirer, der ikke havde gennemgået perifert T-celle sletning ikke er i stand til at blive undertrykt af den normale treg cellepopulationen [24], [35].}

Selvom et normalt niveau af treg celler blev påvist i paragastric lymfeknude af gastritic mus, og en signifikant højere procentdel af treg celler blev fundet i maven af ​​gastritic mus sammenlignet med normale mus, treg-celler var ikke i stand til at forebygge eller undertrykke sygdom. Dette er i overensstemmelse med den konklusion, at selvom Treg celler akkumuleret i CNS, når eksperimentel allergisk encephalomyelitis blev udløst [36], var de ikke i stand til at forhindre ekspansion og funktion af myelin oligodendrocyt glycoprotein-specifikke T-celler, da den lokale inflammatoriske cytokin miljø afsmeltet patogene T-celler er resistente over for treg undertrykkelse.

Udtømning af parietalcellerne er kendetegnende for autoimmun gastritis og den vigtigste grund til, at perniciøs anæmi er en livstruende sygdom, fordi parietalcellerne producerer intrinsic faktor, manglen på, som er dødelig . Vi fandt, at udtømning af parietalcellerne i denne sygdomsmodel var afhængig af tilstedeværelsen af ​​både H ^{+ /K + ATPase underenheder som CD4 + T-celler fra H /Ka - /- mus kun induceret parietalcellens udtynding i vildtype mus, men ikke i H /Ka - /- og H /Kβ - /- mus. Parietalcellens udtømning blev ikke forårsaget af T-celle respons mod H /Kβ siden H /Ka - /- CD4 + T-celler inducerede ikke parietalcellens udtynding i H /Ka - /- modtagende mus mens H /Kβ blev udtrykt i disse mus [26]. På den anden side, fraværet af parietalcellerne depletion i H /Kβ - /- modtagende mus, der modtog H /Ka - /- CD4 + T-celler forstærkede vores tidligere undersøgelser tyder behovet for H /Kβ for at H /Ka skal præsenteres af MHC molekyler [22]. Samlet set viser disse resultater antydede, at parietale celle depletion i denne overførsel model udviklet som følge af immunresponser på H /Ka af CD4 + T-celler fra H /Ka - /- mus. Vi bemærker, at vi i tidligere arbejde har fundet, at parietalcellerne ikke udtømt i enten H /Ka - /- eller H /Kβ - /- mus efter neonatal tymektomi, som fremhæver sammenhængen i denne nye model med resultater fra denne tidligere, veletablerede model.}

Vi har også demonstreret her, at maven vægt kan anvendes som et kvantitativt mål for sygdommens sværhedsgrad siden hypertrofi af maveslimhinden blev observeret i mus med autoimmun gastritis og resulterede i stigningen i maven vægt [37]. Der var en signifikant korrelation mellem maven vægt og alvorligheden af ​​autoimmun gastritis hos mus, der modtog H /Ka ^{- /- CD4 + T-celler. Denne sammenhæng blev yderligere bekræftet i neonatally-thymectomised mus, med den gennemsnitlige mave vægt i hver gastritis score er væsentligt anderledes til en anden. Men på grund af variationen inden for grupperne, vil store prøvestørrelse være påkrævet, hvis maven vægt skal anvendes til at estimere sygdommens sværhedsgrad. Derfor kan histologisk undersøgelse kombineret med mave vægt ses som supplerende foranstaltninger til vurdering af sværhedsgraden af ​​autoimmun gastritis}

Vi viste, at autoimmun gastritis fremkaldt af adoptiv overførsel af H /Ka ^{-. /- CD4 + T-celler repræsenterede en fremragende sygdomsmodel for dissektion af autoimmune respons og udformningen af ​​intervenerende terapier for autoimmune sygdomme. I denne sygdomsmodel, blev autoimmun gastritis forårsaget af en ufraktioneret polyklonal T-celle population, som indeholdt patogene T-celler specifikke for et enkelt antigen, og konsekvent høj kvalitet sygdomssværhedsgrad observeres i alle recipientmus. Desuden viste vi, at sygdommens sværhedsgrad let kunne bestemmes af maven vægt, mave pH og histologisk undersøgelse af mave sektion.}

Materialer og metoder

Etik erklæring

Dette arbejde søger at få en mere detaljeret viden om autoimmun sygdom og de immunologiske mekanismer, der forhindrer autoimmunitet i normale individer. Som immunsystemet er en meget kompleks, integreret netværk, der dyr kræves til korrekt at vurdere disse spørgsmål.

De fleste procedurer var kliniske tests udføres på blod og vævsprøver taget fra mus, der vedligeholdes i fremragende boligforhold . Musene blev overvåget nøje, og hvis hårdt ramt eller nødstedte dræbt. Ved afslutningen af ​​hvert forsøg blev mus dræbt af CO2 kvælning eller cervikal dislokation, som er forbundet med et minimum af nød.

Alle eksperimenter er nøje planlagt for at reducere antallet af dyr og udføres i nøje overensstemmelse med retningslinjer dikteret af University of Melbournes dyreforsøg etiske komité; Forebyggelse af dyremishandling Act 1986; og NHMRC /CSIRO /AAC australske kodeks for pleje og anvendelse af dyr til videnskabelige formål (1997).

Dette arbejde blev godkendt af University of Melbourne Animal Ethics Committee under projektnummer 0.706.327,3.

Mus

BALB /cCrSlc [38], BALB /cCrSlc.CD90.1 kongene, H /Ka ^{- /- [26], H /Kβ - /- [ ,,,0],27] og BALB.B6- Gasa
kongene mus [20] er blevet beskrevet tidligere. Både H /Ka - /- og H /Kβ - /- mus var blevet tilbagekrydses større end 10 gange til BALB /cCrSlc. H /Ka - /- mus blev krydset til BALB /c.CD90.1 mus til at generere H /Ka - /-. CD90.1 mus. Alle mus blev opretholdt i en konventionel dyr facilitet på Bio21 Molekylær Videnskab og bioteknologi Institute, University of Melbourne. Alle mus og eksperimenter blev godkendt af University of Melbourne dyreforsøg etiske komité.}

Antistoffer og flow-cytometri

Anti-CD3-FITC (145-2C11), anti-CD90.1- FITC (HIS51), anti-CD90.2-FITC (30H-12), anti-CD62L-PE (MEL-14), anti-CD4 PerCP (RM4-5), og anti-CD8-APC (53-6.7) blev købt fra BD Pharmingen; anti-CD44-APC (IM-7) blev købt fra eBioscience. Intracellulær farvning af Foxp3 blev udført ved anvendelse af anti-Foxp3-APC (FJK-16S) og Foxp3 Farvning Kit (eBioscience) ifølge producentens anvisninger. Flowcytometri blev udført på et Becton Dickinson FACSort flowcytometer og analyseret under anvendelse CellQuest Pro software eller Beckman Coulter cyan og analyseret under anvendelse Summit software.

Assay af T celle responser i mus immuniseret med H + /K + ATPase

Renset gris gastrisk H ^{+ /K + ATPase blev fremstillet ved en 1:01 forhold med Freunds komplette adjuvans (Life Technologies). Mus blev injiceret subkutant i hver side af haleroden. H /Ka - /- og BALB /cCrSlc mus blev immuniseret to gange med 30 ug af H + /K + ATPase, med en måneds mellemrum mellem immuniseringerne. En uge efter den anden immunisering blev musene aflivet for deres sera og inguinale lymfeknuder. H + /K + ATPase-specifikke autoantistoffer blev påvist ved ELISA. Celler fra de inguinale lymfeknuder blev anvendt i en T-celle proliferation assay. 1 × 10 5 celler dyrket i 72 timer med 2 x 10 4 milt DC fra BALB /cCrSlc mus. T-celleproliferation blev bedømt ved inkorporering af 3H-thymidin i løbet af de sidste 16 timers dyrkning. T-celler blev dyrket i tre eksemplarer med enten DC med antigen (50 ug /ml muse gastrisk membran) eller med DC alene. Gastric membraner blev fremstillet ud fra mus maver som beskrevet tidligere [5]}

Induktion af autoimmun gastritis hos mus

CD4 ^{+ T-celler blev beriget til >. 85% renhed fra lymfeknuder og milt af H /Ka - /- og BALB /cCrSlc mus. Enkeltcellesuspensioner blev inkuberet i en blanding af F4 /80 og B220 hybridomsupernatanter plus anti-CD8 antistof (53.6.72, BioXCell). De ikke-CD4 celler blev fjernet under anvendelse af anti-rotte IgG-coatede magnetiske perler (Dynal, Invitrogen). CD4 + (5 × 10 7) T-celler fra enten H /Ka - /- eller BALB /cCrSlc mus blev injiceret i subletalt bestrålede (600 rad) vildtype kongene BALB /cCrSlc.CD90.1 mus via intraperitoneal vej. I nogle forsøg oprenset H /Ka - /- blev CD4 + T-celler injiceret i bestrålede BALB /cCrSlc, H /Ka - /- og H /Kβ - /- mus. Alle modtagende mus blev bestrålet ved 600 rads en dag før T-celle overførsel. Otte uger senere blev modtagende mus dræbt og maver, lymfeknuder og sera blev høstet.}

BALB /cCrSlc og BALB.B6- Gasa
kongene mus blev anvendt i thymektomi eksperimenter. Neonatal tymektomi blev udført som tidligere beskrevet [20].

Histologisk undersøgelse af maver og måling af gastrisk pH

Mave snit blev undersøgt for tilstedeværelsen af ​​patologiske ændringer som beskrevet tidligere [24]. Scoring blev udført i en blind måde og hvert objektglas blev uafhængigt scoret af mindst to personer. For at måle maven pH blev mus sultet natten før aflivning. Maver blev skåret åben og skylles i 1 ml saltvand, som blev indsamlet og målt ved en pH-meter.

H + /K + ATPase-specifikt enzym bundet antistof (ELISA)

En ELISA til påvisning H ^{+ /K + ATPase-specifikke autoantistoffer blev udført ved anvendelse af oprenset gris H + /K + ATPase som tidligere beskrevet [29].}

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført under anvendelse af GraphPad Prism 5.0 (GraphPad). Data blev analyseret ved anvendelse af Mann-Whitney U-test eller Spearman korrelation test og en P-værdi < 0,05 blev betragtet som signifikant
.

• PLoS ONE: Gene Expression Profilering i maveslimhinden fra Helicobacter pylori-Inficerede og Ikke-inficerede patienter, der gennemgår kronisk Overfladiske Gastritis
• PLoS ONE: Nøjagtighed og afskæringsværdier for Pepsinogens I, II og Gastrin 17 for Diagnose af gastrisk fundiske Atrofi: Indflydelse af Gastritis