Résumé
Résultats de la gastrite auto-immune de la rupture de la tolérance des lymphocytes T à l'H gastrique + /K + ATPase. H gastrique + /K + ATPase est responsable de l'acidification du suc gastrique et se compose d'une sous-unité α (H /Ka) et une sous-unité β (H /Kβ). Ici, nous montrons que CD4 + T cellules de souris H /Ka-déficient (H /Koc - /-) sont hautement pathogène et auto-immunes gastrite peut être induite dans sublétale irradiée souris de type sauvage par transfert adoptif de non fractionnées CD4 + cellules de H /Koc T - /- souris. Toutes les souris receveuses constamment développé la forme la plus sévère de la gastrite autoimmune 8 semaines après le transfert, avec une hypertrophie de la muqueuse gastrique, l'épuisement complet des cellules pariétales et zymogènes, et la présence d'autoanticorps à H + /K + ATPase dans le sérum. De plus, nous avons démontré que la maladie a affecté de façon significative le poids de l'estomac et de l'estomac pH des souris receveuses. Appauvrissement des cellules pariétales dans ce modèle de maladie exigeait la présence des deux H /Koc et H /Kβ depuis le transfert de H /Koc - /- CD4 + cellules T n'a pas entraîné l'épuisement des cellules pariétales dans H /souris receveuses - Koc - /- ou H /Kβ - /. La consistance de la gravité de la maladie, l'utilisation de cellules polyclonales T et une réponse des lymphocytes T spécifiques à l'autoantigène gastrique font un modèle de maladie idéal pour l'étude de nombreux aspects de l'auto-immunité spécifique d'organe, y compris la prévention et le traitement de la maladie. Citation: Tu E, Ang DKY, Hogan TV, Lire S, Chia CPZ, Gleeson PA, et al. (2011) Un modèle pratique de grave, la forte incidence autoimmune gastrite causée par polyclonaux T effecteurs cellules et sans Perturbation des T régulatrices des cellules. PLoS ONE 6 (11): e27153. doi: 10.1371 /journal.pone.0027153 Editeur: Ciriaco A. Piccirillo, Centre universitaire de santé McGill, Canada | Reçu le 21 Janvier 2011; Accepté le 11 Octobre 2011; Publié: 9 Novembre 2011 Droit d'auteur: © 2011 Tu et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités Financement:. Ce travail a été soutenue par des subventions de recherche du Conseil de recherches médicales de l'Australie et de la Santé nationale et l'Université de Melbourne. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit Intérêts concurrents:. Les auteurs peuvent confirmer que Simon Read était à l'Université de Melbourne où cette étude a été complété et que Novo Nordisk est son adresse actuelle. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent. gastrite autoimmune est un excellent système pour enquêter sur la perte de tolérance des lymphocytes T à l'auto-tissus, car il est une maladie auto-immune bien caractérisée avec un antigène cible connue et le modèle de souris de la maladie a de nombreuses similitudes avec l'équivalent humain. L'anémie pernicieuse, le stade de la gastrite auto-immune de la fin, a une prévalence estimée à 1,9% de la population occidentale adulte âgé de plus de 60 ans [1], qui représente la principale cause de la vitamine B 12 carence chez les personnes âgées [2] . gastrite autoimmune comprend l'infiltration de cellules mononucléaires dans la sous-muqueuse qui se prolonge dans la muqueuse gastrique, l'épuisement des pariétales gastriques et les cellules zymogènes et une hypertrophie de la muqueuse gastrique [1]. L'antigène cible dans gastrite auto-immune a été identifiée comme gastrique H + /K + ATPase exprimé par les cellules pariétales gastriques [3] - [5]. Stomacaux H + /K + ATPase est une pompe responsable de l'acidification du suc gastrique de protons de la membrane et il est un hétérodimère constitué d'une sous-unité catalytique α (H /Ka) et une glycoprotéine β-unité (H /Kβ). Des études antérieures ont démontré que les deux H /Ka et H /Kβ sont ciblés dans gastrite auto-immune [4], [6] - [8]. Il est bien documenté que, chez les souris et l'homme, CD4 + cellules T qui reconnaissent l'estomac H + /K + ATPase initié gastrite auto-immune tandis CD8 + cellules T et les cellules B sont inefficaces, ce faisant, [7] - [17]. Néanmoins, après le début de la maladie, autoanticorps à la H + /K + ATPase sont produites et sont un outil de diagnostic très utile de la maladie même si elles ne sont pas pathogènes [3], [16], [18 ]. souris BALB /c ont été montré pour être les plus sensibles à la lymphopénie induite-gastrite auto-immune avec une incidence de 30-90% [19], [20]. La maladie peut être induite par la thymectomie de souris âgées de trois jours ou thymectomie adulte combinés avec une dose unique de cyclophosphamide [19], [21]. En dépit de cela, il est difficile d'évaluer les effets thérapeutiques des traitements administrés à des souris thymectomised depuis un spectre de gravité de la maladie de légère à grave est toujours observée et la fréquence est variable, donc de grandes tailles de groupe sont nécessaires pour tester la signification statistique. En outre, l'opération en cause et la maintenance post-opératoire des animaux est techniquement exigeant. gastrite auto-immune peut également être induite en souris BALB /c par immunisation avec purifié gastrique H + /K + ATPase [5]. Cependant, la maladie est réversible après l'arrêt de la vaccination et a une faible gravité. Transfert des cellules T BALB /c appauvri des cellules régulatrices T (Treg) dans des souris receveuses athymiques provoque une gastrite auto-immune sévère [15]. Il est donc impossible de disséquer la relation entre les cellules T autoréactives et les cellules Treg au cours du développement de la maladie dans ce cadre puisque les cellules Treg sont absents L'incidence élevée de la gastrite auto-immune spontanée est observée chez les souris transgéniques exprimant un TCR spécifique pour H /Ka [8]. Cependant, ces souris ne représentent pas un modèle de maladie idéal pour toutes les expériences parce que la nature monoclonale des cellules T pathogènes ne récapituler pas la réponse polyclonale qui se produit dans des conditions physiopathologiques. Dans cette perspective, nous avons développé un modèle de maladie qui reposait sur le transfert des cellules polyclonaux T de /Ka-déficient (H /Koc - /-) H souris à des souris de type sauvage sublétale irradiées. Nous avons démontré que les souris qui ont reçu des cellules T non fractionnées de H /Koc - /- souris tous succombé à la gastrite auto-immune la plus sévère avec les changements pathologiques observés dans l'ensemble estomac. En outre, ces changements pathologiques affectés de manière significative la physiologie de l'estomac. Nous avons démontré l'utilité de ce modèle en montrant que le développement de la gastrite auto-immune dans ce modèle était strictement dépendante de la présence des deux H + /K + ATPase a et ß sous-unités. T élevée et la réponse des cellules B dans H /Koc - /- souris après immunisation avec H + /K + ATPase afin de disposer d'un système qui est adapté à l'étude des différents aspects de l'auto-immunité, nous avons établi un modèle de maladie dans lequel la maladie est provoquée par des cellules T polyclonales pathogènes et de la sévérité de la maladie est toujours grave. Une réponse des lymphocytes T à H /Ka est nécessaire pour l'apparition de la gastrite auto-immune, et peut-être la principale source d'épitopes autoréactifs gastriques [7], [8], [22]. Comme tolérance des lymphocytes T à H /Koc était peu probable dans H /Koc - /- souris, nous avons étudié si les cellules T qui étaient spécifiques à H + /K + ATPase et capable de provoquer la gastrite étaient présents dans H /Koc - /-. pour déterminer s'il ont été élevées réponses immunitaires à H + /K + ATPase dans H /Koc - /- souris par rapport à des souris de type sauvage, les souris ont été immunisées deux fois avec purifié gastrique H + /K + ATPase. Après la vaccination, les auto-anticorps spécifiques H + /K + ATPase ont été détectés dans le rapport H /Ka immunisé - /- souris, mais pas chez les souris de type sauvage (figure 1A). réponse des lymphocytes T à in vitro CD4 + cellules de H /Koc T - /- souris ont été Pour déterminer si transfert adoptif de lymphocytes T de H /Koc - /- souris seraient capables de provoquer une gastrite auto-immune, nous avons enrichi CD4 + T cellules provenant soit H /Koc - /- souris ou de type sauvage à ~85 % de pureté et transféré 5 × 10 7 de ces cellules dans des souris irradiées de type sauvage stressées. Étant donné qu'il a été démontré précédemment que H + /K + ATPase spécifique de CD4 + cellules T ont été rapidement supprimée dans la périphérie et incapable d'induire une gastrite auto-immune chez les non-irradiés de souris de type sauvage [24], le tout souris receveuses utilisées dans cette étude ont été légèrement irradiées à 600 rads pour améliorer la survie des cellules T transférées de H /Koc - /-. Huit semaines après le transfert, les souris qui ont reçu H /Koc - /- cellules CD4 + T tous développés les formes les plus sévères de gastrite auto-immune (score 5 et 6). Ceci a été démontré par l'épuisement complet des cellules pariétales et les cellules zymogènes, et une hypertrophie de la muqueuse gastrique (figure 2A, 2B). En revanche, les souris qui ont reçu de type sauvage CD4 + cellules T étaient totalement exempts de gastrite (figure 2A, 2B), ce qui indique que la gastrite auto-immune chez des souris recevant H /Ka - /- CD4 + cellules T n'a pas été provoquée par l'irradiation en soi les changements pathologiques dans l'estomac de souris gastritique affectés de manière significative leur physiologie de l'estomac. L'hypertrophie de la muqueuse gastrique, conduit à l'élargissement de rugosités de l'estomac (figure 2C) et une augmentation du poids de l'estomac (figure 2D). En second lieu, l'épuisement des cellules pariétales a provoqué une augmentation de pH de l'estomac en raison de l'absence de sécrétion d'acide (figure 2E). De plus, des auto-anticorps spécifiques à l'estomac H + /K + ATPase n'a pu être détectée dans toutes les souris gastritique (figure 2F). Autoanticorps ont atteint des niveaux élevés chez toutes les souris 6 semaines après le transfert (figure 2G). Ensemble, ces résultats ont démontré la présence de hautement pathogène H + /K cellules T + ATPase spécifiques dans H /Koc - /-. gastrite autoimmune a été causé par CD4 + T à médiation cellulaire inflammation Souris avec gastrite auto-immune induite par le transfert de H /Koc - /- CD4 + cellules T avait beaucoup plus de cellules dans leur lymphe paragastric estomac drainant nœuds par rapport à des souris normales et des souris qui ont reçu CD4 cellules + T provenant de donneurs de type sauvage. En revanche, il n'y avait pas de différence dans la taille du ganglion lymphatique inguinal entre les souris gastritique et non gastritique (figure 3A). Ceci suggère que l'augmentation de la cellularité des ganglions lymphatiques paragastric chez la souris gastritique a été causée par une inflammation gastrique locale et non par la survie préférentielle ou l'expansion de H /Ka - /- CD4 + lymphocytes T par rapport au type sauvage de CD4 + T après le transfert Dans ces expériences, les cellules du donneur H /Koc -. /- ou les souris de type sauvage peuvent être différenciées des cellules réceptrices parce qu'ils portaient des allèles différents de CD90. La population des donateurs dans les ganglions lymphatiques paragastric des souris qui ont reçu H /Koc - /- CD4 + T cellules était significativement plus CD4 + cellules T avec un phénotype effecteur /mémoire (CD44 hiCD62 lo) par rapport à des souris qui ont reçu CD4 les cellules de type sauvage + T. Cependant, les taux de cellules effectrices /T mémoires ont été similaires dans les ganglions lymphatiques drainant non (figure 3B). Ensemble, ces résultats suggèrent que le développement de la gastrite auto-immune chez des souris qui ont reçu des CD4 + Lymphocytes T H /Ka - /- souris a été provoquée par une réponse inflammatoire à médiation cellulaire T dans le milieu gastrique plutôt qu'un réponse plus généralisée. le développement de la gastrite auto-immune dans ce modèle de la maladie n'a pas été associée à une réduction du niveau de T régulatrices (Treg) cellules puisque les souris gastritique contenait des proportions similaires de cellules Treg dans le ganglion lymphatique paragastric par rapport aux non contrôles -gastritic (figure 4A, 4B). En fait, beaucoup plus Treg ont été trouvées dans l'estomac de souris avec une gastrite auto-immune (figure 4A, 4C) H /Ka -. /- CD4 + des lymphocytes T induite par des lésions tissulaires rapidement dans l'estomac la sévérité de la gastrite auto-immune a été analysée à différents points de temps après le transfert de H /Koc - /- CD4 cellules + T. épuisement modérée des cellules pariétales et cellules zymogènes, comme indiqué par un score de gastrite de 4 [24], a pu être observé aussi tôt que 2 semaines après le transfert et la maladie a progressé rapidement avec la plupart des souris montrant une gastrite sévère, comme le montre une le score de gastrite 5 et 6, 4 semaines après le transfert (Figure 5). poids de l'estomac peut être utilisé comme une mesure quantitative de la gastrite auto-immune Nous avons démontré que les souris avec la gastrite auto-immune avait un poids de l'estomac plus que les souris exemptes de maladies dues à l'hypertrophie de la muqueuse gastrique (figure 2D). Par conséquent, nous avons étudié si le poids de l'estomac peut être utilisé en tant que mesure quantitative de la gravité de la gastrite auto-immune. Pour plus d'essai si le poids de l'estomac pourrait différencier les différentes sévérités de gastrite auto-immune, nous avons examiné des souris neonatally-thymectomised comme un plus grand nombre de souris avec des scores de maladie variables pourraient être obtenus. Nous avons constaté qu'il y avait des différences significatives dans le poids moyen de l'estomac entre chacun des cinq premiers niveaux de gastrite auto-immune (score 0-4) (figure 6). Cependant, les poids moyens des gastrites scores 4, 5 et 6 estomac ne sont pas significativement différents les uns des autres (figure 6). Cela est probablement dû au fait que le degré de l'hypertrophie de la muqueuse gastrique n'augmente pas que la maladie progresse à la fin des étapes Induction de la gastrite auto-immune par H /Koc -. /- CD4 + cellules T était dépendante de la présence de H /H Koc et /Kβ Nous avons supposé que la pathogénicité de CD4 + Lymphocytes T H /Ka - /- souris ont été causés par le manque de tolérance à H /Koc en l'absence de cet auto-antigène gastrique. Pour tester cela, CD4 cellules + T ont été transférés de H /Koc - /- souris en sublétale irradiées H /Koc - des souris et de type sauvage - /. Il a été démontré que H /Ka, en l'absence de H /Kβ, ne peuvent être présentés par des molécules du CMH [25] (S Allen, communication personnelle). Nous avons transféré donc CD4 + T cellules de H /Koc - /- souris en sublétale irradiées H /Kβ - /- souris et les a comparés avec H /Koc - /- et de type sauvage des souris receveuses. L'analyse de l'attaque auto-immune sur la muqueuse gastrique est compliquée en H /Ka - /- et H /Kβ - /- souris par les changements qui se produisent dans la muqueuse gastrique étant donné que l'absence d'acide gastrique chez ces souris se traduit par des niveaux élevés de l'hormone gastrine. trophique Cela conduit à une hypertrophie constitutive et l'épuisement des cellules zymogènes [26],. Par conséquent, afin d'évaluer si une réponse auto-immune attaque la muqueuse gastrique chez ces souris, nous avons plutôt déterminé la prévalence des cellules pariétales, qui sont normalement appauvris en gastrite auto-immune, mais on trouve en abondance dans H /Koc - /- et H /Kβ - /- souris, et aussi la présence d'autoanticorps gastriques la morphologie de l'estomac dans H /Koc -. /- souris ou H /Kβ - /- souris n'a pas été affectée par le transfert de H /Koc - /- CD4 + cellules T (Figure 7A, 7B). En particulier, il n'y avait pas de déplétion des cellules pariétales indiquant l'absence d'une réponse auto-immune. En revanche, l'épuisement complet des cellules pariétales a été observée chez les souris receveuses de type sauvage qui ont reçu H /Koc - /- CD4 + cellules T (Figure 7C). Depuis les estomacs de H /Koc - /- et H /Kβ - /- souris sont apparues différentes à des souris normales et gastritique, nous ne pouvions pas évaluer ces souris en utilisant notre système gastrite de notation standard. Cependant, H + /K autoanticorps + ATPase spécifiques, une autre caractéristique de la gastrite auto-immune, ne sont pas détectés dans les sérums des deux H /Koc - /- et H /Kβ - /- les souris receveuses, mais ont été détectés chez les souris receveuses de type sauvage (Figure 7D). Ces résultats ont démontré que la présence de deux sous-unités a et ß a été nécessaire pour l'épuisement des cellules pariétales par H /Koc - /-. Cellules CD4 + T Discussion gastrite autoimmune peut être induite chez la souris BALB /c par plusieurs moyens, y compris la thymectomie néonatale, thymectomie adulte avec cyclophosphamide [19], [21], l'immunisation avec gastrique H + /K + ATPase [5] et génération de H + /K souris transgéniques + ATPase spécifiques du TCR [7], [8]. Toutefois, le système immunitaire est dominé par les cellules T avec une seule spécificité observée chez des souris transgéniques RCT ne ressemble pas à des conditions physiologiques normales. En outre, l'immunisation et la thymectomie ne confèrent pas de gravité de la maladie, et ils sont compatibles techniquement difficile, ce qui rend peu commode à utiliser ces modèles pour l'analyse des immunothérapies. Nous avons donc développé un nouveau modèle de la maladie qui reposait sur le transfert de cellules T de H /Koc - /-. Souris, un de population polyclonale qui contenait des cellules T hautement gastritogenic Nous avons constaté que la vaccination de H /Koc - /- souris avec purifié H + /K + ATPase a induit une réponse des cellules T vigoureuse à la suite du manque de tolérance des lymphocytes T à l'autoantigène gastrique, ce qui indique la présence de H + /K la population de cellules du donneur de la H /Koc - /- souris a été enrichi à ~85% CD4 + cellules T par une procédure "de sélection négative" parce que le principal objectif de ce travail était de produire un simple, , modèle de la maladie bon marché et pratique. Nous en concluons qu'il est CD4 + cellules T dans l'inoculum qui a provoqué une gastrite auto-immune, car il a été bien établi par de nombreuses études que les cellules CD4 + cellules T et pas d'autres types de cellules sont capables d'initier la gastrite auto-immune [7 ] - [17]. Il est clair que les populations de lymphocytes T et B réactifs à la H + /K + ATPase sont présents dans le répertoire de souris normales [5], [14] - [16], [21], [24 ], [28] - [33]. Par conséquent, nous suggérons que le H + /K + ATPase spécifiques des cellules T et B du receveur sont ensuite recrutés pour la lésion et les cellules réceptrices dérivées B sont responsables de la production d'autoanticorps. Il a été précédemment démontré que les cellules de H /Kβ CD4 + T - /- souris induisent la gastrite auto-immune chez les souris BALB /c athymiques mais pas chez les souris de type sauvage irradiées [24]. CD4 + cellules de H /Ka T - /- souris ont provoqué la gastrite chez les souris de type sauvage irradiées suggère que cette population est plus pathogène que CD4 + cellules T de H /Kβ - /- souris . Ces données appuient un rôle plus dominant pour la réponse immunitaire contre H /Koc dans la pathogénie de la gastrite auto-immune, compatible avec les résultats chez les souris transgéniques TCR [7], [8]. Contrairement à d'autres modèles de maladies qui ont utilisé la cellule Treg cellules polyclonaux T appauvri provenant de souris de type sauvage pour induire l'auto-immunité [15], il n'a pas été nécessaire pour éliminer les cellules Treg de H /Koc - /- CD4 + population de cellules T pour l'induction d'une grave gastrite auto-immune. En outre, le développement de la gastrite auto-immune chez les souris receveuses n'a pas été causé par un niveau réduit de cellules Treg de la population des donneurs puisque les souris gastritique contenait la même proportion de cellules Treg dans le ganglion lymphatique paragastric par rapport aux témoins non-gastritique. Nous avons déjà démontré que les cellules Treg de H /Koc - /- souris étaient aussi efficaces que les cellules Treg de souris de type sauvage dans la suppression de H /cellules T autoréactives Ka-spécifiques [34]. Par conséquent, nos résultats ici soutiennent les travaux antérieurs indiquant que les répertoires de cellules T qui n'a pas subi périphérique suppression des cellules T ne peuvent pas être supprimées par la population de cellules Treg normale [24], [35]. Bien qu'un niveau normal cellules Treg a été détectée dans les ganglions lymphatiques de souris paragastric gastritique, et un pourcentage significativement plus élevé de cellules Treg a été trouvé dans l'estomac de souris gastritique par rapport à des souris normales, les cellules Treg ne sont pas en mesure de prévenir ou réprimer la maladie. Ceci est cohérent avec la conclusion que, bien que les cellules Treg accumulées dans le SNC quand encéphalomyélite allergique expérimentale a été déclenchée [36], ils n'étaient pas en mesure d'empêcher l'expansion et la fonction des cellules T spécifiques de la glycoprotéine myéline oligodendrocytes, depuis le milieu de la cytokine inflammatoire locale rendu les cellules T pathogènes résistantes à la suppression Treg. déplétion des cellules pariétales est une caractéristique de gastrite auto-immune et la principale raison que l'anémie pernicieuse est une maladie potentiellement mortelle, car les cellules pariétales produisent le facteur intrinsèque, dont l'absence est fatale . Nous avons constaté que l'épuisement des cellules pariétales dans ce modèle de maladie était dépendante de la présence des deux H + /K + ATPase sous-unités de CD4 + cellules T H /Ka - /- souris la déplétion des cellules pariétales seulement induite chez des souris de type sauvage mais pas chez M /Ka - /- et H /Kβ - /- souris. déplétion des cellules pariétales n'a pas été causé par la réponse des lymphocytes T vers H /Kβ depuis H /Ka - /- CD4 + cellules T n'a pas induit la déplétion des cellules pariétal H /Koc - /- bénéficiaires souris tout en H /Kβ a été exprimée dans ces souris [26]. D'autre part, l'absence de pariétal déplétion des cellules en H /Kβ - souris receveuses ayant reçu H /Ka - - //- CD4 + cellules T renforcé nos études antérieures suggèrent la nécessité H /Kβ pour H /Ka qui sera présenté par des molécules du CMH [22]. Ensemble, ces résultats suggèrent que la déplétion des cellules pariétales dans ce modèle de transfert conçu comme une conséquence de la réponse immunitaire à H /Ka de CD4 + cellules T H /Ka - /- souris. Nous notons que dans les travaux antérieurs, nous avons constaté que les cellules pariétales ne sont pas épuisées soit dans le H /Koc - /- ni H /Kβ - /- souris après thymectomie néonatale, qui met en évidence la cohérence de ce nouveau modèle avec les résultats de cette précédente, le modèle bien établi. Nous avons également démontré ici que le poids de l'estomac peut être utilisé en tant que mesure quantitative de la gravité de la maladie étant donné que l'hypertrophie de la muqueuse gastrique a été observé chez des souris souffrant de gastrite auto-immune et a donné lieu dans l'augmentation du poids de l'estomac [37]. Il y avait une corrélation significative entre le poids de l'estomac et de la gravité de la gastrite auto-immune chez les souris qui ont reçu H /Koc - cellules CD4 + T - /. Cette corrélation a été confirmée chez la souris neonatally-thymectomised, le poids moyen de l'estomac dans chaque gastrite score étant sensiblement différent à l'autre. Cependant, en raison de la variation à l'intérieur des groupes, la grande taille de l'échantillon est nécessaire si le poids de l'estomac doit être utilisée pour estimer la gravité de la maladie. Par conséquent, l'examen histologique combiné avec le poids de l'estomac peut être considéré comme des mesures complémentaires pour évaluer la gravité de la gastrite auto-immune Nous avons montré que la gastrite auto-immune induite par transfert adoptif de H /Koc -. /- CD4 + cellules T représentent un modèle de la maladie excellente pour la dissection de la réponse auto-immune et la conception des thérapies pour des maladies auto-immunes interventionnistes. Dans ce modèle de la maladie, gastrite auto-immune a été provoquée par une population de cellules T non fractionnée polyclonal contenant des cellules T pathogènes spécifiques d'un antigène unique et cohérent gravité de la maladie de haut grade est observée chez toutes les souris receveuses. De plus, nous avons montré que la sévérité de la maladie pourrait être facilement déterminé par le poids de l'estomac, de l'estomac pH et l'examen histologique de la section de l'estomac. Éthique déclaration Ce travail cherche pour obtenir une connaissance plus détaillée de la maladie auto-immune et les mécanismes immunologiques qui empêchent l'auto-immunité chez les individus normaux. Comme le système immunitaire est un réseau très complexe, intégrée, les animaux sont nécessaires pour évaluer correctement ces questions. La majorité des procédures étaient des essais cliniques effectués sur des échantillons de sang et de tissus prélevés chez des souris qui sont maintenues dans d'excellentes conditions de logement . Les souris ont été étroitement surveillés et tués si sévèrement touchés ou en détresse. A la fin de chaque expérience, les souris ont été tuées par asphyxie au CO2 ou la dislocation cervicale, qui sont associés à un minimum de détresse. Toutes les expériences sont soigneusement planifiées afin de réduire le nombre d'animaux et sont réalisées dans le strict respect des directives dictées par l'Université du Comité d'éthique de l'expérimentation animale de Melbourne; la prévention de la cruauté envers les animaux Loi de 1986; et le Code NHMRC /CSIRO /AAC australien de pratiques pour le soin et l'utilisation des animaux à des fins scientifiques (1997). Ce travail a été approuvé par l'Université du Comité d'éthique animale Melbourne sous le numéro de projet 0.706.327,3. Souris BALB /cCrSlc [38], BALB /cCrSlc.CD90.1 congenic, H /Koc - /- [26], H /Kβ - /- [ ,,,0],27] et BALB.B6- souris congéniques de Gasa [20] ont été décrits précédemment. Les deux H /Koc - /- et H /Kβ - /- souris avait été rétrocroisés supérieure à 10 fois à BALB /cCrSlc. H /Koc - /- souris ont été croisées avec des souris BALB /c.CD90.1 pour générer H /Koc - /-. CD90.1 souris. Toutes les souris ont été maintenues dans une animalerie conventionnelle à la science et de l'Institut de biotechnologie moléculaire Bio21, l'Université de Melbourne. Toutes les souris et les expériences ont été approuvées par l'Université du Comité d'éthique de l'expérimentation animale Melbourne. Anti-CD3-FITC (145-2C11), anti-CD90.1- FITC (HIS51), anti-CD90.2-FITC (30H-12), anti-CD62L-PE (MEL-14), anti-CD4 PerCP (RM4-5) et anti-CD8-APC (53 à 6,7), ont été achetés auprès de BD Pharmingen; anti-CD44-APC (IM-7) a été acheté chez eBioscience. la coloration intracellulaire de Foxp3 a été réalisée en utilisant l'anti-Foxp3 APC (FJK-16S) et Foxp3 kit de coloration (eBioscience) selon les instructions du fabricant. La cytométrie en flux a été réalisée sur un Becton Dickinson FACSort cytomètre de flux et analysées en utilisant CellQuest logiciel Pro ou Beckman Coulter Cyan et analysées en utilisant le logiciel Summit. pig purifié gastrique H + /K + ATPase a été préparé dans un rapport 1:01 avec de l'adjuvant complet de Freund (Life Technologies). Les souris ont reçu une injection sous-cutanée au niveau de chaque côté de la base de la queue. /- - H /Koc et BALB /cCrSlc souris ont été immunisées deux fois avec 30 ug de H + /K + ATPase, avec un mois d'intervalle entre les immunisations. Une semaine après la deuxième immunisation, les souris ont été sacrifiées et leurs sérums ganglions inguinaux. H + /K autoanticorps + ATPase spécifiques ont été détectés par ELISA. Les cellules des ganglions lymphatiques inguinaux ont été utilisés dans un test T de la prolifération cellulaire. 1 × 10 5 cellules ont été cultivées pendant 72 heures avec 2 x 10 4 splénique DC à partir de souris BALB /cCrSlc. Prolifération des cellules T a été évaluée par incorporation de 3 H-thymidine au cours des 16 dernières heures de culture. Les cellules T ont été cultivées en triple avec du courant continu avec l'antigène (50 pg de membrane gastrique /ml de la souris) ou avec DC seul. membranes gastriques ont été préparés à partir d'estomacs de souris comme décrit précédemment [5] Induction de la gastrite auto-immune chez les souris CD4 + cellules T ont été enrichies à >. 85% de pureté à partir des ganglions lymphatiques et rate de H /Koc - /- et les souris BALB /cCrSlc. Des suspensions de cellules uniques ont été mises en incubation dans un mélange de F4 /80 et B220 surnageants d'hybridome ainsi que l'anticorps anti-CD8 (53.6.72, BioXCell). Les cellules non-CD4 ont été éliminés en utilisant anti-rat de billes magnétiques recouvertes d'IgG (Dynal, Invitrogen). CD4 + (5 x 10 7) des cellules provenant soit H /Koc T - /- ou des souris BALB /cCrSlc ont été injectées dans sublétale irradiées (600 rads) congenic BALB type sauvage /cCrSlc.CD90.1 souris par voie intrapéritonéale. Dans certaines expériences, H purifié /Koc - /- cellules CD4 + T ont été injectés dans irradiée BALB /cCrSlc, H /Koc - /- et H /Kβ - /- souris. Toutes les souris receveuses ont été irradiées à 600 rads un jour avant le transfert des cellules T. Huit semaines plus tard, les souris receveuses ont été tués et les estomacs, les ganglions lymphatiques et les sérums ont été récoltés. BALB /cCrSlc et BALB.B6- souris congéniques de Gasa ont été utilisés dans les expériences de Thymectomie. thymectomie néonatale a été réalisée comme décrit précédemment [20]. L'examen histologique des estomacs et mesure du pH gastrique sections de l'estomac ont été examinés pour la présence de changements pathologiques comme décrit précédemment [24]. La notation a été réalisée de façon aveugle et chaque diapositive a été marqué de façon indépendante par au moins deux personnes. Afin de mesurer le pH de l'estomac, les souris ont été privés de nourriture pendant la nuit avant le sacrifice. Estomacs ont été coupées ouvert et rincés dans 1 ml de solution saline qui a été recueilli et mesuré par un pH-mètre. Un test ELISA pour détecter H + /K autoanticorps + ATPase spécifiques a été réalisée à l'aide de porc purifiée H + /K + ATPase comme décrit précédemment [29]. L'analyse statistique L'analyse statistique a été réalisée en utilisant GraphPad Prism 5.0 (GraphPad). Les données ont été analysées en utilisant le test U de Mann-Whitney ou un test de corrélation de Spearman et une valeur de P < 0,05 a été considérée comme significative
Introduction
.
Résultats
souris
restimulation avec H + /K + ATPase a également été significativement plus importante dans H /Koc - /- souris que chez les souris de type sauvage (figure 1B). Par conséquent, comme cela a déjà été démontré dans H /Kβ souris - /- [23], il y a aussi une réponse des lymphocytes T et B significative à H + /K + ATPase dans H /Koc - /-. des souris qui ne sont pas présents chez les souris de type sauvage
hautement pathogène
souris
, mais plutôt, l'inoculum de cellules T.
Souris
Matériels et méthodes
Anticorps et cytométrie de flux analyse
Dosage des réponses des lymphocytes T chez les souris immunisées avec H + /K + ATPase
H + /K enzyme + ATPase spécifique dosage immunoenzymatique (ELISA)
.
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Pancréatite
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