Limfangiogenezo želodčnega raka urejeno preko Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D os

Limfangiogenezo želodčnega raka urejajo z Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D osi
Abstract
Ozadje
limfangiogenezo igra pomembno vlogo pri metastazami in ponovitve raka želodca. Ni poročilo še osredotoča na modulacijo VEGF poti in limfangiogenezo raka želodca z usmerjanjem Akt /mTOR poti. Namen te študije je prikazati odnos med Akt /mTOR poti in VEGF-C /-D raka želodca.
Metode
Zbrali smo kirurško odstranjenimi adenokarcinomom želodca primerkov iz 55 privolila bolnikov. Imunohistokemija obarvanje p-Akt, p-mTOR, VEGF-C, VEGF-D so bile opravljene in dosegel dva neodvisna patologi. Rezultati so bili predstavljeni kot barvanja intenzivnosti in pozitivne stopnje barvanja celic. Izmerili smo tudi limfni gostoto plovila (LVD), ki ga D2-40 barvanjem. Različnimi odmerki p Akt zaviralca LY294002 (12,5 pM, 25 um, 50 uM) in p-mTOR inhibitor Rapamicin (25 nM, 50 nM, 100 nM) je bila dana rak celične linije želodčni SGC-7901 in vitro. Stopnja zaviranje rasti celic smo testirali z MTT pri 24 h, 48 h in 72 h, v tem zaporedju in proteinske izrazi Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR, VEGF-C in VEGF-D so bile pregledane z Western blot.
Rezultati
pozitivnih stopnjah barvanjem p-Akt, p-mTOR, VEGF-C in VEGF-D v 55 kliničnih vzorcih z rakom želodca je bila 74,54%, 85,45%, 72,73% in 58,18%. p-Akt in p-mTOR bili pozitivni korelaciji z VEGF-C in VEGF-D (p < 0,01). LVD povečala z rastočo težnjo barvanja intenzivnosti p-Akt, p-mTOR, VEGF-C in VEGF-D. LY294002 ali Rapamicin močno zatreti rast SGC-7901 celic in stopnja inhibicije bil odmerek in čas odvisen (p < 0,001). Poleg tega smo proteinski izraz p-Akt in p-mTOR pozitivni korelaciji z učinkovitostjo VEGF-C in VEGF-D (p 0.05).
Sklepe
Raven LVD v želodcu osebkov raka je bila pomembno višja od normalne želodčnega tkiva in je bil v pozitivni korelaciji z p-Akt, p-mTOR, VEGF-C in VEGF-D. Inhibicijo p-Akt in p-mTOR, in vitro, zmanjšan tumorskih celic VEGF-C in VEGF-D bistveno. Zato smo sklenili, da bi se limfangiogenezo raka želodca, povezanih s Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D osi.
Ključne besede
limfangiogenezo Rak želodca Akt /mTOR VEGF Ozadje
raka želodca, je ena izmed najpogostejše maligne novotvorbe na svetu [1-3]. Skupne strategije zdravljenja za rakom želodca vključujejo operacijo, radioterapijo, kemoterapijo in usmerjeno zdravljenje [4,5]. napake Zdravljenje vključuje metastaze in ponovitev po operaciji. Glavni metastatskim poti raka želodca so neposreden napad, žilno metastaze, limfni metastaze in enterocoelia metastaze [3]. Med tistimi, limfna metastaze je vse bolj pomemben kriterij pri presojanju prognozo želodčnega raka in limfangiogenezo je priznan kot pomemben napovedovalec za prognozo bolnikov z rakom želodca [1,2]. Poleg tega je rak želodca limfatičnega metastaza verjeli, da je prej dogodek v primerjavi z vaskularno metastaze, dogaja tudi v zgodnji fazi raka želodca [3,4]. Zato je Mednarodna zveza za boj proti raku je stopnja limfangiogenezo in znesek metastaz na bezgavke v uprizarjanju raka želodca pri ocenjevanju prognozo [2,5]. Poleg tega, tudi če so bile opravljene Lymphadenectomy in intraperitonealno kemoterapijo v bezgavkah negativno napredovanja, je prinesel tudi pozitivno vpliva na izboljšanje 5-letno preživetje raka želodca [5].
Dveh uveljavljenih načinov vstopa tumorske celice v lymprhatic sistem so vdor v obstoječih limfnih vodov in indukcija limfangiogenezo [3]. Slednje velja kot glavni poti. Poleg tega limfangiogenezo igra odločilno vlogo pri metastaz, ponovitve in prognozo pri zgodnjem raku želodca [4]. Tako študije limfangiogenezo imajo obetavno vpliva na zdravljenje. VEGF-C in VEGF-D so pozitivno povezana s trdnim tumorja limfnega metastaz, limfna gostote posoda (LVD) in globine tumorske invazije in ponovitve po predhodnih študijah [6-8]. Poleg tega je Akt /mTOR pot sodeluje tudi pri regulaciji limfangiogenezo in limfnega metastaz [9-11]. Zato je razmerje med Akt /mTOR procesi in VEGF poti je vreden, da je treba pojasniti. Da nam je znano, ni poročila še osredotoča na modulacijo VEGF poti in limfangiogenezo z usmerjanjem Akt /mTOR poti v rak želodca. V tej študiji želimo prikazati razmerje med Akt /mTOR poti in VEGF-C /-D raka želodca.
Metode
kliničnem vzorcu
Kirurški reseciranih adenokarcinomom želodca primerki so bili zbrani od 55 bolnikov z želodčno rak od aprila 2011 do novembra 2012. Vsi so prejeli nobenega radioterapijo, kemoterapijo ali imunoterapije pred operacijo. Študija je bila odobrena s etiko prve odvisnimi bolnišnici Nanchang univerze in vsi udeleženci dali pisno obveščeni soglasje.
Imunohistokemija
Vse vzorce tkiva, so bile določene z 10% formalinom, rutinsko vgrajeni v parafin, narežemo na 4-im debel kot serijskih delov, razvoskanih z ksilen rehidracijo z etanolom padec in izperemo z destilirano vodo. Antigen Preiskovalna smo izvedli s potapljanjem odseke antigensko pridobivanja pufru (0,5 M EDTA) in microwaving 20 minut. Sekcije nato obdelamo z raztopino 3% vodikovega peroksida. Vzorce smo blokirali s 5% normalno kozjim seruma in nato inkubiramo preko noči pri 4 ° C, s primarnim protitelesom: p-Akt (Ser473) (zajec, 1: 100, Cell signalnega Technology, ZDA), p-mTOR (ser2448) ( zajec, 1: 200, Abcam, ZDA), VEGF-C (kozel, 1: 400, R &D, ZDA), VEGF-D (miška, 01:50, santa Cruz, ZDA) in D2-40 (miška, 1: 100, ZSGB-BIO, Kitajska). Nato dodamo drugo protitelo, in vzorce inkubiramo 30 minut pri sobni temperaturi in nato razvil z DAB. 5% normalna kozji serum smo uporabili kot negativno kontrolo namesto primarnega protitelesa. Imunohistokemija obarvanje je dosegel dva neodvisna patologi. Rezultati so bili predstavljeni v obliki barvanja intenzivnosti (+ /++ /+++) in pozitivno stopnjo obarvanje celic.
Limfna gostoto plovila
skladu z merili, Masakau, D2-40 pozitivno obarvane (enotni endotelijske celice ali celice grozdi) je bil označen kot pozitiven microlymphatic plovila. Vaskularni bogati območje v para-neoplastični lokacije in tumorja centra so bili opredeljeni in 5 polja "vroče točke" so naključno šteti pod visoko povečavo (x 400). Povprečna smo šteli kot liberijski oddelek.
Preživetja celice
tri različne odmerke (12,5 LM 25 LM, 50 um) v Akt za aktivacijo zaviralca LY294002 (Sigma) ali mTOR aktivacijo zaviralca (25 nM, 50 nM, 100 nM ) Rapamicin (Sigma), so imeli raka celične linije želodca SGC-7901. Stopnja zaviranje rasti celic smo testirali z MTT testom na 24 ur, 48 ur in 72 ur oz.
Western blot
SGC-7901 Celice smo homogenizirali v RIPA liznega pufra (10 mM Tris-HCl, pH 7,4 , 150 mM NaCI, 600 mM NP-40, 1% Triton X-100, 10% glicerola, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorid, 1 mM natrijev fluorid, in 1 mM natrijevega ortovanadata) in čaka na ledu 2 uri. koncentracija proteinov vsakega vzorca smo določili z Bio-Rad Protein Analiza komplet za (Bio-Rad, Laboratories, Hercules, CA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Lizate, ki vsebujejo 50 ig proteina ločimo s SDS-PAGE in prenesli na nitrocelulozne membrane. Nespecifični reakcije so blokirani 4 ure s TBS-T (50 mM Tris.HCl, pH7.4, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20), ki vsebuje 5% nemastnega suhega mleka. Nato smo membrane inkubirali čez noč pri 4 ° C, s primarnim protitelesom: Akt (Mouse, 1: 2000, celična signalizacija Technology, ZDA), p-Akt (Ser473) (Rabbit, 1: 2000, celična signalizacija Technology, ZDA), mTOR ( zajec, 1: 1000, Cell signalnega Technology, ZDA), p-mTOR (ser2448) (zajec, 1: 3000, Abcam, ZDA), VEGF-C (kozel, 1: 1000, R &D, ZDA) in VEGF- R (miška, 1: 500, santa Cruz, ZDA). Potem ko izperemo s TBS-T, ki vsebujejo nemastnega suhega mleka, smo membrane inkubirali s hrenovo peroksidazo konjugirano sekundarnih protiteles. Beljakovinsko blots so bile vidne tudi s kemoluminiscenco pomočjo ECL (Amersham).
Statistična analiza
neodvisne vzorce preizkus T med dvema skupinama in enotno faktorsko analizo variance (ANOVA) za multiple primerjave so bili uporabljeni, ko se podatki v skladu z normalno porazdelitvijo in homogenosti variance. Sicer pa so bile izvedene Mann-Whitney testu med dvema skupinama in testa Kruskal-Wallis med multi-skupine. Spearman analiza je bila uporabljena za merjenje korelacijo merjenje in štetje podatkov. Statistične analize so bile izvedene s SPSS17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, ZDA). A p-vrednost < 0.05 smo imeli za statistično značilne.
Rezultati
Izražanje p-Akt, p-mTOR, VEGF-C in VEGF-D in situ
imunohistokemija stainings P-Akt, p-mTOR, VEGF-C in VEGF-D v 55 želodčnih kliničnih vzorcih z rakom, so pokazale (slika 1). Pozitivna obarvanje predstavljena predvsem v citoplazmi in nekaj jedrskih obarvajo v p-Akt in p-mTOR. Stopnje pozitivnosti p-Akt, p-mTOR, VEGF-C in VEGF-D je bilo 74.54%, 85.45%, 72.73% in 58.18% oz. Kvantifikacija barvanja intenzivnosti je prikazano v tabeli 1. Slika 1 imunohistokemija obarvanja p-Akt, p-mTOR, VEGF-C in VEGF-D v želodcu raka vzorcem (x 400). A: p-Akt, B: p-mTOR, C: VEGF-C, D: VEGF-D, E: Korelacija med p-Akt in p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D
Tabela 1. imunohistokemija obarvanje p-Akt, p-mTOR, VEGF-C in VEGF-D v želodčnih vzorcih raka
Intenzivnost (n)
Pozitivna stopnja (%)
-
+
++

p-Akt
14
29
12
74.54
p-mTOR
8
21
26
85.45
VEGF-C
15
22
18
72.73
VEGF-D
23
27
5
58.18
V korelacije p-Akt in p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D, p-mTOR in VEGF-C /VEGF-D so dodatno analizirani. p-Akt izraz je v pozitivni korelaciji s p-mTOR (p = 0,001), VEGF-C (p = 0,002) in VEGF-D (p = 0,009) (slika 1E). Poleg tega je bil tudi p-mTOR pomembno pozitivno povezana z VEGF-C (p < 0,001). In VEGF-D (p = 0,003)
limfne gostoto plovila
je D2-40 obarvanje, ki se uporablja za izračun LVD za rak želodca (slika 2A), ter se ujema normalno tkivo želodca (Slika 2B). Glede na rezultate, D2-40 obarvajo predvsem v limfni endotelija v razpršenih ali gručami distribucijo. Thin limfna žilne stene je manjkalo bazalni sloj. Najvišja LVD opazili ob robu tumorja z gosto grozda podobno morfologijo. Poleg tega je D2-40 izražen v submucosa normalnega tkiva, s šibkejšo izražanja v sluznice ali mišične plasti kot tudi. Povprečna LVD želodca raka in normalnega tkiva so bili 94.18 ± 72.965 vs 23.31 ± 21.569 Število /5 visoke polja moči, p < 0,001. Slika 2 Imunohistokemija obarvanje D2-40 za LVD (x 400). A: želodca tkivo rak, B: Matched normalno tkivo, C: Korelacija med LVD in p-Akt /p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D. . LVD = limfna gostota plovilo
LVD so v pozitivni korelaciji s p-Akt, p-mTOR, VEGF-C in VEGF-D navedbe na analizo Spearmanu (p < 0,05). LVD povečala z rastočo težnjo barvanja intenzivnosti p-Akt, p-mTOR, VEGF-C in VEGF-D (slika 2C).
Učinki LY294002 in rapamicin na SGC-7901 rast celic
SGC-7901 celice smo kultivirali s tremi različnimi odmerki LY294002 za 24 h, 48 h in 72 h. Po MTT testom, je SGC-7901 rast celic omejeni in stopnja inhibicije je pomembno povezana z LY294002 odmerku in akcijskega časa (p < 0,001) (Slika 3A). Slika 3 Zaviranje p-Akt in p-mTOR v SGC-7901 celic z LY294002 in rapamicin. A: Rast SGC-7901 celic s posredovanjem različnih časovnih točkah in odmerke LY294002, B: rast SGC-7901 celic s posredovanjem različnih časovnih točkah odmerkih rapamicina, C: Vpliv LY294002 (50 uM) in rapamicin (100 nM ) na Akt /mTOR poti in VEGF-C /-D ga Western blot.
Poleg tega so bili kultivirani z različnimi odmerki rapamicin za 24 ur, 48 ur in 72 ur, v tem zaporedju tudi celice. Stopnja inhibicije SGC-7901 je tudi značilno povezana bodisi z rapamicin odmerka ali akcijskega časa (p < 0,001) (Slika 3B). Zato bi lahko tako LY294002 in Rapamicin zavirajo rast SGC-7901 bodisi časovno odvisni ali od odmerka odvisen način.
Učinek LY294002 na Akt /mTOR poti in VEGF-C /-D
ravni beljakovin Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR, VEGF-C in VEGF-D v SGC-7901 s LY294002 (50 uM) zaviranje so obravnavali Western blot. Med njimi so bili p-Akt, p-mTOR, VEGF-C in VEGF-D postopoma zmanjšala s časom za podaljšanje ukrepa za LY294002 (slika 3C). v primerjavi s skupino brez LY294002 (0,05 p <) je bila pomembna razlika. Vendar pa ni bilo statistično značilne razlike za Akt in mTOR (p > 0,05). Z nadaljnjo izvedbo dvojne varianto analizo odnosa, je p-Akt pozitivni korelaciji s p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D (p < 0,05) in p-mTOR je pozitivno povezana z VEGF-C /VEGF-D ( p <. 0,05)
Učinek rapamicin na mTOR poti in VEGF-C /-D
raven beljakovin Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR, VEGF-C in VEGF-D v SGC -7901 z rapamicin (100 nm) inhibicije so obravnavali Western blot. Med njimi so p-mTOR, VEGF-C, VEGF-D izraz zmanjšala s časom podaljšanje akcijskega rapamicina (slika 3C). v primerjavi s skupino brez rapamicin (0,05 p <) je bila pomembna razlika. Vendar pa ni bilo statistično značilne razlike za Akt, p-Akt in mTOR (p > 0,05). Z nadaljnjo izvedbo dvojne varianto analizo odnosa, je p-mTOR pozitivni korelaciji z VEGF-C in VEGF-D (p 0.05).
Razprava
Akt /mTOR signalne poti je pomembno znotrajcelični pot, ki se odziva da citokinske signale, in se je izkazalo, da igrajo pomembno vlogo pri rasti celic, presnove in apoptoze [12,13]. Akt /mTOR poti vključuje v različnih patoloških mehanizmov kolorektalnega raka, raka želodca, raka jeter, raka dojk in raka maternice itd [12-14]. Naša predhodna študija je potrdila, da lahko p-Akt vključeni v angiogenezo želodčnega adenokarcinoma in aktiviranje Akt prispeva k angiogenezo preko VEGF-A up-ureditev [15]. V tej študiji so bile pozitivne stopnje obarvanja p-Akt in p-mTOR v 55 primerov raka želodca 74,54% in 85,45% oz. Poleg tega je bil p-Akt pozitivni korelaciji z p-mTOR (p < 0,01). Ta rezultat je v skladu s prejšnjimi študijami in potrdila pomembno vlogo Akt /mTOR poti na raka želodca. Predlagana je tudi klinična prognozo raka želodca, da je povezana s Akt potjo in VEGF poti. Na primer, Murakami et al.
Predlagal, da je prognoza bolnikov z rakom želodca brez p-Akt izražanja vedno bolje kot p-Akt pozitivnih in stopnja preživetja za 5-letno 68% in 35% za bolnike s T3 ali fazi T4 tumorji, oziroma [16]. Poleg tega je bil Akt kodira gen PI3CA
zgornjem delu oskrbne verige beljakovin PI3K povezana s preživetjem brez bolezni [17]. Poleg tega, Wang et al.
Je pokazala, da so bile VEGF-C, VEGF-D in LVD raka želodca, povezanih z velikostjo tumorja in celokupnega preživetja glede na študijo, v 123 primerih [18,19]. Korelacija med VEGF-C /LVD in prognozo na diferenciacije tumorja, stopnjo T, bezgavk metastaz in daljni metastaze so bile potrjene tudi [20]. Druga študija je nadalje predlagal uporabo kombinacije VEGF-C /-D in CA199 napovedati, limfni metastaze plovil [21].
Glede na to, da Akt /mTOR poti in VEGF-C /D igrajo ključno vlogo pri limfni metastaz in prognozo je cilj naše študije je raziskati odnos med dvema poti in še naprej spodbujati mehanizem limfangiogenezo in metastaz. Glede na rezultate barvanjem v situ
, p-Akt in p-mTOR bili pozitivni korelaciji z VEGF-C, VEGF-D (p < 0,01). V smislu LVD so bili proučeni D2-40 raven želodčne karcinoma in normalnih tkiv ob istem času. LVD pri raku želodca je bila štirikrat višja od normalnega tkiva. Poleg tega je bila LVD močno povezana s skupino p-Akt, p-mTOR, VEGF-C in VEGF-D (p 0.05). Predvsem LVD kot VEGF-C /D je bila očitno manjša pri bolnikih z negativno izražanje p-Akt in p-mTOR kot pozitivnimi. Predlagala je, da sta Akt /mTOR poti in VEGF pot vključeni v limfangiogenezo in limfni metastaz plovila raka želodca. Podobne rezultate so potrdile tudi druge študije. Yu et al.
Predlagal, da so p-mTOR zelo skladno z bezgavkah metastaze in je lahko neodvisen napovedovalec limfne metastaz in prognozo raka želodca [22]. Poleg tega Onogawa et al.
Je pokazala, da je bila VEGF-C visoko povezana z limfno metastazami po študiji pri 140 primerih zgodnjega raka želodca [23]. VEGF-C, kot tudi VEGF-D je štela tudi kot napovedovalec limfnega metastaz pri bolnikih z zgodnjim rakom želodca [24]. V raziskavi smo dodatno potrdili odnos Akt /mTOR, VEGF-C /-D in liberijski oddelek za rak želodca in situ
.
LY294002, kot Akt zaviralec aktivacije, je potrjena z učinkom proti tumorjem in spodbuja apoptozo raka želodca in vitro
in vivo
[25]. Rapamicin poznana kot inhibitor aktivacijskim mTOR klinično uporablja za njegovo antitumorski učinek in imunomodulacijo [26]. Rezultati naše raziskave še dodatno potrdili, da bi LY294002 in Rapamicin učinkovito zavirajo rast SGC-7901 celic. Poleg tega LY294002 na 50 um) in Rapamicin pri 100 nm je najbolj učinkovito stopnjo inhibicije (52,53 ± 3,19)% in (48,72 ± 3,06)% na 24 ur. Ko se podaljšujejo do 72 h, je bila stopnja inhibicije (68,76 ± 1,00)% in (68,50 ± 3,77)% oz. Nato smo opazili vpliv inhibicije fosforilacije Akt, in mTOR na limfne dejavnikov, VEGF-C in VEGF-D. Visoka koncentracija LY294002 (50 um) in rapamicin (100 nm) so bili uporabljeni za intervencijske študije. Glede na rezultate, Rapamicin zatreti izražanje p-mTOR in LY294002 učinkovito inhibira ekspresijo p-Akt kot tudi p-mTOR. Treba je opozoriti, da bi oba zaviralci učinkovito zavira izražanje VEGF-C /-D. Poleg tega navzdol ureditev p-Akt /p-mTOR pokazali visoko skladnost s tisto VEGF-C /-D. Zato je bila predlagana Akt /mTOR pot, ki se tesno povezana z VEGF-C /-D. Podobne rezultate smo tudi že poročali v drugih modelih tumorjev. Na primer, Zhang et al.
Zmanjšala receptor insulina z kratek Ostra RNA v celičnih linijah raka, LCC6 in T47D. Širjenje celic, angiogenezo, limfangiogenezo in metastaze smo zaviral tudi zaradi navzdol-regulacijo p-Akt in inaktivaciji VEGF-D [27]. Poleg tega lahko inhibicijo mTOR zavirajo ekspresijo VEGF-C in učinkovito zmanjša limfangiogeneze v pankreatične modelu raka miške [11]. V drugi študiji so VEGF-D razgradi z Honokiol da zavira limfangiogeneze za ksenotransplantata pljučnega raka [28]. IL-6 lahko tudi urediti VEGF-C na ravni mRNA preko Akt /mTOR signalne poti, ki učinkovito zmanjšal na limfangiogeneze in metastaze v ustni skvamoznega karcinoma [29].
Zaključek
raven LVD v želodčnih vzorcih raka je znatno višja od normalne želodčnega tkiva in pozitivni korelaciji z imunohistokemični obarvanjem p-Akt, p-mTOR, VEGF-C in VEGF-D. Z inhibicijo p-Akt in p-mTOR in vitro, VEGF-C in VEGF-D so bile tudi bistveno zmanjšalo. Zato predlagamo, da bi se limfangiogenezo raka želodca učinkovito modulirane skozi Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D osi.
Pojasnilih
Hongxia Chen, Runnian Guan, Yupeng Lei in Jianyong Chen prispevali tudi za to delo .
Kratica
LVD:
gostote plovila limfna
deklaracij
Potrditev
študija je bila podprta s sredstvi iz National Science Foundation Grants Kitajske ( Ne 81160307); Jiangxi Science & Tehnologija Steber programa in Fundacija znanosti za mlade Štipendisti v provinci Jiangxi (št 2007GQY1167); . Voyage Projekt Jiangxi Province znanost in tehnologijo združenja
Konkurenca interesov
Avtorji izjavi, da nimajo konkurenčnih interesov prispevkov
avtorjev
Študija koncepte in oblikovanje:. XZhou, HC; zajem podatkov: HC, RG, HC; Analiza podatkov: il, JC; Rokopis Priprava: QG, RD, XZhang; Rokopis revizija: XQ, HL, CC. Vsi avtorji so dovolj sodelovali v raziskavi in ​​odobril končno verzijo.

• Bursectomy in non-bursectomy D2 želodca zaradi napredovalega raka želodca, začetne izkušnje iz enega zavoda v China
• Clinicopathological pomen jedrske faktorja (eritroidnih-2) -povezana faktor 2 (Nrf2) izraz želodčnega cancer