Lymfangiogenese bij maagkanker geregeld via Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D axis

lymfevatontwikkeling bij maagkanker geregeld via Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D as
Abstracte achtergrond
lymfevatontwikkeling speelt een belangrijke rol in metastase en herhaling van maagkanker. Er is geen verslag nog gericht op het bijsturen van VEGF route en lymfangiogenese van maagkanker door zich te richten Akt /mTOR-route. Dit onderzoek heeft tot doel de relatie tussen Akt /mTOR route en VEGF-C /D bij maagkanker te demonstreren.
Methods
We verzamelden chirurgisch weggesneden adenocarcinoom monsters van 55 patiënten ingestemd. Immunohistochemie kleuring van p-Akt, p-mTOR, VEGF-C, VEGF-D werden uitgevoerd en gescoord door twee onafhankelijke pathologen. De resultaten werden gepresenteerd als kleurintensiteit en positieve kleuring cel tarief. We hebben ook gemeten lymfatische vaartuig dichtheid (LVD) door D2-40 kleuring. Verschillende doseringen van p-Akt remmer LY294002 (12,5 uM, 25 pM, 50 pM) en p-mTOR remmer Rapamycine (25 nM, 50 nM, 100 nM) werden aan maagkanker cellijn SGC-7901 in vitro. De mate van remming van de celgroei werd getest door MTT in 24 uur, 48 uur en 72 uur, respectievelijk eiwitexpressies van Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR, VEGF-C en VEGF-D werd onderzocht met Western blot.
Resultaten
De positieve kleuring tarieven van p-Akt, p-mTOR, VEGF-C en VEGF-D in 55 maagkanker klinische monsters waren 74,54%, 85,45%, 72,73% en 58,18%. p-Akt en p-mTOR waren positief gecorreleerd met VEGF-C en VEGF-D (p < 0,01). Het LVD verhoogde incrementeel neiging kleurintensiteit van p-Akt, p-mTOR, VEGF-C en VEGF-D. LY294002 of Rapamycine aanzienlijk onderdrukte SGC-7901 celgroei en de remming bedroeg de dosis en tijdsafhankelijke (p < 0,001). Bovendien zijn de eiwitexpressie van p-Akt en p-mTOR positief gecorreleerd met die van VEGF-C en VEGF-D (p < 0,05).
Conclusies
Het niveau van LVD in maagkanker monsters werd significant hoger dan die van normaal maagweefsel en is positief gecorreleerd met p-Akt, p-mTOR, VEGF-C en VEGF-D. Remming van p-Akt en p-mTOR in vitro verminderde tumorcel VEGF-C en VEGF-D aanzienlijk. Derhalve concludeerden wij dat lymfangiogenese van maagkanker kan worden gerelateerd aan Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D as.
Sleutelwoorden
lymfevaten maagkanker Akt /mTOR VEGF Achtergrond
Maagkanker is een van de meest voorkomende kwaadaardige gezwellen in de wereld [1-3]. Gemeenschappelijke behandelingsstrategieën voor maagkanker omvatten chirurgie, radiotherapie, chemotherapie en doelgerichte therapie [4,5]. Mislukte behandelingen omvatten metastase en herhaling na de operatie. De belangrijkste routes van uitgezaaide maagkanker directe invasie, vasculaire metastase, lymfatische metastase en enterocoelia metastase [3]. Onder degenen, lymfatische metastase is een steeds belangrijker criterium bij de beoordeling van de prognose van maagcarcinoom en lymfevatontwikkeling wordt erkend als een belangrijke voorspeller voor de prognose van patiënten met maagkanker [1,2]. Bovendien is de maagkanker lymfatische uitzaaiing verondersteld om een ​​eerdere gebeurtenis in vergelijking met vasculaire metastase, gebeurt ook in vroeg stadium maagkanker [3,4]. Daarom is de Internationale Unie tegen kanker nam de lymfangiogenese koers en de metastase bedrag van de lymfeklieren in de enscenering van maagkanker bij de evaluatie van de prognose [2,5]. Trouwens, zelfs als lymphadenectomy en intraperitoneale chemotherapie werden uitgevoerd tijdens de lymfeklier negatieve progressie, het bracht ook het positieve effect op de verbetering van de 5-jaarsoverleving van maagkanker [5]. Ondernemingen De twee gevestigde manieren van tumorcellen binnenkomst in de lymprhatic systeem zijn invasie van de bestaande lymfevaten en inductie van lymfevaten [3]. Dit laatste wordt beschouwd als de belangrijkste manier. Daarnaast lymfevatontwikkeling speelt een beslissende rol in metastase, herhaling en de prognose in het begin van maagkanker [4]. Aldus studies van lymfangiogenese een veelbelovende effect op de behandeling. VEGF-C en VEGF-D waren positief gerelateerd aan vaste tumoren lymfatische metastase, lymfatische vaartuig dichtheid (LVD) en de diepte van tumorinvasie en herhaling op basis van eerdere studies [6-8]. Bovendien is Akt /mTOR-route ook betrokken bij de regulatie van lymfangiogenese en lymfatische metastase [9-11]. Daarom is de relatie tussen de Akt /mTOR route en VEGF trajecten is het waard om te worden toegelicht. Voor zover wij weten, is er geen melding nog gericht op het bijsturen van VEGF pathway en lymfangiogenese doelwit Akt /mTOR route bij maagkanker. In deze studie willen we de relatie tussen de Akt /mTOR route en VEGF-C /D bij maagkanker te demonstreren.
Methods
klinisch monster
Chirurgische resectie adenocarcinoom monsters werden verzameld van 55 patiënten met maag- kanker van april 2011 tot november 2012. Ieder van hen kreeg geen radiotherapie, chemotherapie of immunotherapie voor de operatie. De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Eerste Affiliated Hospital van Nanchang University en alle deelnemers gaven schriftelijk informed consent.
Immunohistochemie Leer Alle weefselmonsters werden gefixeerd met 10% formaline, routinematig ingebed in paraffine, in 4-um cut dik als seriecoupes, was ontdaan met xyleen, rehydratie met ethanol gradiënt en gewassen met gedestilleerd water. Antigeenterugtrekking werd uitgevoerd door onderdompeling secties antigene retrieval buffer (0,5 M EDTA) en de magnetron gedurende 20 min. Secties werden vervolgens behandeld met 3% waterstofperoxideoplossing. De monsters werden geblokkeerd met 5% normaal geit serum en vervolgens gedurende de nacht geïncubeerd bij 4 ° C met het primaire antilichaam: p-Akt (Ser473) (konijn, 1: 100, Cell Signaling Technology, USA), p-mTOR (ser2448) ( konijn, 1: 200, Abcam, USA), VEGF-C (Goat, 1: 400, R & D, USA), VEGF-D (Mouse, 01:50, Santa Cruz, USA) en D2-40 (Mouse, 1: 100, ZSGB-BIO, China). Vervolgens werd tweede antilichaam toegevoegd en de monsters werden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd en vervolgens ontwikkeld met DAB. 5% normaal geit serum werd gebruikt als een negatieve controle in plaats van het primaire antilichaam. Immunohistochemie kleuring werd gescoord door twee onafhankelijke pathologen. De resultaten werden gepresenteerd in de vorm van de kleurintensiteit (+ /++ /+++) en positieve kleuring cel tarief.
Lymfatische vaatdichtheid
Volgens Masakau criteria, D2-40 positieve kleuring (single endotheliale cel of cel clusters) werd gekenmerkt als positief microlymphatic schip. Het vasculaire-rijk gebied in para-neoplastische locatie en tumor centrum werden gedefinieerd en 5 velden van "hot spots" werden willekeurig geteld onder hoge vergrotingsfactor (× 400). De gemiddelde werd geteld als de LVD.
Cell survival
Drie verschillende doseringen (12,5 uM, 25 uM, 50 uM) van Akt activering remmer LY294002 (Sigma) of mTOR activering remmer (25 nm, 50 nM, 100 nM ) Rapamycine (Sigma) werden gegeven aan maagkanker cellijn SGC-7901. De mate van remming van de celgroei werd getest door MTT assay op 24 uur, 48 uur en 72 uur, respectievelijk.
Western blot
SGC-7901 cellen werden gehomogeniseerd in RIPA lysisbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4 , 150 mM NaCl, 600 mM NP-40, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride, 1 mM natriumfluoride, en 1 mM natriumorthovanadaat) en plaats op ijs gedurende 2 uur. Eiwitconcentratie van elk monster werd bepaald door Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad, Laboratories, Hercules, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Lysaten bevattende 50 ug eiwit werden gescheiden door SDS-PAGE en overgebracht naar nitrocellulose membranen. Niet-specifieke reacties werden geblokkeerd gedurende 4 uur met TBS-T (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) met 5% vetvrije droge melk. Daarna werden membranen gedurende de nacht geïncubeerd bij 4 ° C met primair antilichaam: Akt (muis, 1: 2000, Cell Signaling Technology, USA), p-Akt (Ser473) (konijn, 1: 2000, Cell Signaling Technology, USA), mTOR ( konijn, 1: 1000, Cell Signaling Technology, USA), p-mTOR (ser2448) (konijn, 1: 3000, Abcam, USA), VEGF-C (Goat, 1: 1000, R & D, USA) en VEGF D (muis, 1: 500, Santa Cruz, USA). Na het wassen met TBS-T met niet-vette droge melk, werden de membranen geïncubeerd met mierikswortel peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen. Het eiwit vlekken werden zichtbaar gemaakt door chemiluminescentie met behulp van ECL (Amersham).
Statistische analyse
Independent samples T-test tussen de twee groepen en enkele factor variantie-analyse (ANOVA) voor meerdere vergelijkingen werden gebruikt wanneer de gegevens in overeenstemming met de normale verdeling en homogeniteit van variantie. Anders, Mann-Whitney-test tussen twee groepen en Kruskal-Wallis-test tussen meerdere groepen werden uitgevoerd. Spearman analyse werd gebruikt om de correlatie van metingen meten en data te tellen. Statistische analyses werden uitgevoerd door SPSS17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Een p-waarde van < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
Expressie van p-Akt, p-mTOR, VEGF-C en VEGF-D in situ
immunohistochemie kleuringen van p-Akt, p-mTOR, VEGF-C en VEGF-D in 55 maagkanker klinische monsters kregen (figuur 1). De positieve kleuring gepresenteerd meestal in cytoplasma en enkele nucleaire gekleurd met p-Akt en p-mTOR. De positiviteit van p-Akt, p-mTOR, VEGF-C en VEGF-D waren 74,54%, 85,45%, 72,73% en 58,18% respectievelijk. De kwantificering van kleurintensiteit werd getoond in tabel 1. Figuur 1 Immunohistochemie kleuring van p-Akt, p-mTOR, VEGF-C en VEGF-D bij maagkanker monster (x 400). A: p-Akt, B: p-mTOR, C: VEGF-C, D: VEGF-D, E: De correlatie tussen p-Akt en p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D
Tabel 1. immunohistochemie kleuring van p-Akt, p-mTOR, VEGF-C en VEGF-D in maagkanker monsters
Intensity (n)
Positief tarief (%)
-
+
++

p-Akt
14
29
12
74.54
p-mTOR
8
21
26
85.45
VEGF-C
15
22
18
72.73
VEGF-D
23
27
5
58.18
De correlaties van p-Akt en p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D, p-mTOR en VEGF-C /VEGF-D werden verder geanalyseerd. p-Akt expressie positief gecorreleerd aan p-mTOR (p = 0,001), VEGF-C (p = 0,002) en VEGF-D (p = 0,009) (figuur 1E). Daarnaast p-mTOR was significant positief gerelateerd aan VEGF-C (p < 0,001). En VEGF-D (p = 0,003)
Lymfatische vaatdichtheid
D2-40 kleuring werd gebruikt om de LVD berekenen maagkanker (Figuur 2A) en gekoppeld normaal maagweefsel (figuur 2B). Volgens de resultaten, vooral D2-40 gekleurd lymfatisch endotheel in verspreide of geclusterd distributie. Dunne lymfatische vaatwand ontbrak basale laag. De hoogste LVD werd waargenomen bij de rand van de tumor met een dichte cluster morfologie. Bovendien werd D2-40 uitgedrukt in de submucosa van normaal weefsel, met een zwakkere expressie in de mucosa of spierlaag ook. De gemiddelde LVD van maagcarcinoom en normaal weefsel was 94,18 ± 72,965 versus 23.31 ± 21,569 nummer /5 high power velden, p < 0.001. Figuur 2 Immunohistochemie kleuring van D2-40 voor LVD (× 400). A: Maagkanker weefsel B: Matched normaal weefsel, C: De correlatie tussen LVD en p-Akt /p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D. . LVD = lymfatische vaatdichtheid
LVD waren positief gecorreleerd met de p-Akt, p-mTOR, VEGF-C en VEGF-D-expressie per Spearman-analyse (p < 0,05). LVD vermeerderd met de incrementele neiging kleurintensiteit van p-Akt, p-mTOR, VEGF-C en VEGF-D (figuur 2C).
Effecten van LY294002 en rapamycine op SGC-7901 celgroei
SGC-7901 cellen werden gekweekt met drie verschillende doseringen van LY294002 voor 24 uur, 48 uur en 72 uur. Volgens MTT-test, werd SGC-7901 celgroei afgeremd en de remming snelheid was significant gecorreleerd met LY294002 dosering en actie tijd (p < 0,001) (figuur 3A). Figuur 3 Remming van p-Akt en p-mTOR in SGC-7901 cellen door LY294002 en rapamycine. A: SGC-7901 celgroei met tussenkomst van verschillende tijdstippen en doseringen van LY294002, B: SGC-7901 celgroei met tussenkomst van verschillende tijdstippen en doseringen van rapamycine, C: Effect van LY294002 (50 uM) en Rapamycine (100 nM ) op Akt /mTOR route en VEGF-C /D door Western blot.
Daarnaast cellen werden ook gekweekt met verschillende doseringen van rapamycine gedurende 24 uur, 48 uur en 72 uur, respectievelijk. De remming tarief van SGC-7901 was ook significant gecorreleerd met ofwel Rapamycine dosering of actie tijd (p < 0,001) (Figuur 3B). Daarom kan zowel LY294002 en Rapamycine de groei van SGC-7901
inhiberen of tijdsafhankelijke of dosisafhankelijke wijze. Effect van LY294002 op Akt /mTOR route en VEGF-C /D
eiwitgehalte akt, p-akt, mTOR, p-mTOR, VEGF-C en VEGF-D in SGC-7901 met LY294002 (50 uM) remming onderzocht met Western blot. Onder hen, werden p-Akt, p-mTOR, VEGF-C en VEGF-D geleidelijk af met de verlengde werkingsduur van LY294002 (Figuur 3C). Er was een significant verschil in vergelijking met de groep zonder LY294002 (p < 0,05). Er was echter geen statistisch verschil Akt en mTOR (p > 0,05). Door het verder uitvoeren van een dubbele variant relatie analyse werd p-Akt positief gecorreleerd met p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D (p < 0,05) en p-mTOR werd ook positief gerelateerd aan VEGF-C /VEGF-D ( p. < 0,05)
Effect van rapamycine op de mTOR-route en VEGF-C /D
Het eiwit niveau van Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR, VEGF-C en VEGF-D in SGC -7901 met Rapamycine (100 nm) remming werden onderzocht door Western blot. Onder hen, p-mTOR, VEGF-C en VEGF-D-expressie werden verlaagd met het verlengde werkingsduur van rapamycine (Figuur 3C). Er was een significant verschil in vergelijking met de groep zonder Rapamycine (p < 0,05). Er was echter geen statistisch verschil Akt, p-Akt en mTOR (p > 0,05). Door het verder uitvoeren van een dubbele variant relatie analyse werd p-mTOR positief gecorreleerd met VEGF-C en VEGF-D (p < 0,05).
Discussie
Akt /mTOR signaleringsroute is een belangrijke intracellulaire signaalweg die reageert signalen cytokine, en bleek een belangrijke rol in celgroei, metabolisme en apoptose [12,13] spelen. Akt /mTOR route bestaat in verschillende pathologische mechanismen van colorectale kanker, maagkanker, leverkanker, borstkanker en baarmoederkanker etc. [12-14]. Onze eerdere studie bevestigde dat p-Akt betrokken bij angiogenese van maagdarmkanker en Akt activatie kunnen bijdragen aan angiogenese via VEGF-A opwaartse regulatie [15]. In deze studie, de positieve kleuring tarieven van p-Akt en p-mTOR in 55 gevallen van maagkanker respectievelijk 74,54% en 85,45%. Daarnaast werd p-Akt positief gecorreleerd met p-mTOR (p < 0,01). Dit resultaat was in overeenstemming met eerdere studies en bevestigde de belangrijke rol van Akt /mTOR route bij maagkanker. De klinische prognose maagkanker wordt voorgesteld geassocieerd met Akt pathway en VEGF pathway. Bijvoorbeeld, Murakami et al.
Gesuggereerd dat de prognose van maagkanker patiënten zonder p-Akt expressie was altijd beter dan de p-Akt positieve, en de 5-jaarsoverleving was 68% en 35% voor patiënten met T3 of T4 stadium tumoren, respectievelijk [16]. Daarnaast Akt coderende gen PI3CA
stroomopwaartse eiwit PI3K werd geassocieerd met ziektevrije overleving [17]. Bovendien, Wang et al.
Aan dat VEGF-C, VEGF-D en LVD maagkanker waren gerelateerd aan tumorgrootte en overleving volgens een studie in 123 gevallen [18,19]. Het verband tussen VEGF-C /LVD en prognose tumordifferentiatie, T-stadium, lymfeknoop metastase en metastasen werden bevestigd [20]. Een andere studie suggereerde verder met de combinatie van VEGF-C /D en CA 19-9 aan lymfevaten metastase [21] voorspellen.
Aangezien Akt /mTOR route en VEGF-C /-D een belangrijke rol in lymfatische metastase en prognose spelen , onze studie is bedoeld om de relatie tussen twee wegen te verkennen en de verdere bevordering van het mechanisme van lymfangiogenese en metastase. Volgens de resultaten van kleuring in situ
, p-Akt en p-mTOR waren positief gecorreleerd met VEGF-C en VEGF-D (p < 0,01). Qua LVD, D2-40 niveau van maagcarcinoom en normale weefsels werden onderzocht op hetzelfde moment. LVD bij maagkanker vier keer hoger dan dat van normaal weefsel. Daarnaast werd LVD significant gecorreleerd met p-Akt, p-mTOR, VEGF-C en VEGF-D (p < 0,05). Met name LVD en VEGF-C /D was duidelijk lager bij patiënten met een negatieve expressie van p-Akt en p-mTOR dan positieve. Gesuggereerd dat zowel Akt /mTOR route en VEGF pathway betrokken bij lymfangiogenese en lymfevaten uitzaaiingen bij maagkanker. Soortgelijke resultaten werden ook bevestigd door andere studies. Yu et al.
Gesuggereerd dat p-mTOR waren zeer consistent met lymfeklier en een onafhankelijke voorspeller van lymfatische metastase en prognose van maagkanker [22] kan zijn. Trouwens, Onogawa et al.
Gaf aan dat VEGF-C was sterk gecorreleerd met lymfatische metastase, volgens een studie uitgevoerd in 140 gevallen van vroege maagkanker [23]. VEGF-C en VEGF-D werd ook beschouwd als een voorspeller van lymfatische metastasen bij patiënten met vroege maagkanker [24]. In de studie werd verder bevestigd de verhouding van Akt /mTOR, VEGF-C /D en LVD bij maagkanker in situ
.
LY294002, als Akt activering remmer, wordt bevestigd door het antitumoreffect en bevorderde de apoptose van maagkanker in vitro Kopen en in vivo
[25]. Rapamycine bekend als mTOR activering remmer wordt klinisch gebruikt voor de anti-tumor effect en immunomodulatie [26]. De resultaten van onze studie verder vastgesteld dat LY294002 en Rapamycine efficiënt de groei van SGC-7901 cellen kunnen remmen. Bovendien LY294002 bij 50 uM) en rapamycine bij 100 nM hadden de meest effectieve remming percentage (52,53 ± 3,19)% en (48,72 ± 3,06)% bij 24 uur. Bij het verlengen tot 72 uur, de remming prijzen waren respectievelijk (68,76 ± 1,00)% en (68,50 ± 3,77)%. Vervolgens zagen we de invloed van fosforylatie remming van Akt en mTOR op lymfatische factoren, VEGF-C en VEGF-D. Hoge concentratie van LY294002 (50 uM) en Rapamycine (100 nM) werden gebruikt voor de interventie studie. Volgens de resultaten, Rapamycine onderdrukt de expressie van p-mTOR en LY294002 efficiënt de expressie van p-Akt en p-mTOR geremd. Opgemerkt wordt dat beide remmers doeltreffend de expressie van VEGF-C /D kan remmen. Daarnaast neerwaartse regulatie van p-Akt /p-mTOR toonde een hoge consistentie met die van VEGF-C /D. Daarom werd Akt /mTOR route voorgesteld nauw verwant aan VEGF-C /D. De vergelijkbare resultaten werden voorheen in andere tumormodellen. Bijvoorbeeld, Zhang et al.
Verlaagde de insulinereceptor door korte haarspeld RNA in kankercellijnen, LCC6 en T47D. Celproliferatie, angiogenese, metastase en lymfangiogenese werden geremd door de down-regulatie van p-Akt en inactiveren van VEGF-D [27]. Bovendien zou mTOR remming van de expressie van VEGF-C te onderdrukken en lymfevaten in pancreaskanker muismodel [11] effectief verminderen. In een ander onderzoek werd VEGF-D afgebroken door Honokiol om lymfangiogenese van longkanker xenograft [28] remmen. IL-6 kan ook geregeld VEGF-C op mRNA-niveau via Akt /mTOR signaleringsroute, die lymfangiogenese en metastase effectief afgenomen orale plaveiselcelcarcinoom [29].
Conclusie Ondernemingen De mate van LVD in maagkanker monsters was significant hoger dan die van normaal maagweefsel en positief gecorreleerd met immunohistochemische kleuring van p-Akt, p-mTOR, VEGF-C en VEGF-D. Met de remming van p-Akt en p-mTOR in vitro VEGF-C en VEGF-D werd ook significant verlaagd. Daarom stellen wij voor dat lymfevatontwikkeling van maagkanker efficiënt kan worden gemoduleerd door middel van Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D as.
Notes
Hongxia Chen, runnian Guan, Yupeng Lei en Jianyong Chen bijgedragen evenzeer voor dit werk .
Afkorting
LVD:
lymfatische vaatdichtheid
verklaringen
Erkenning Ondernemingen De studie werd ondersteund door de financiering van de National Science Foundation Subsidies van China ( Nee. 81160307); Jiangxi Science & Technology Pillar Program en het Science Foundation for Young Scholars van de provincie Jiangxi (No. 2007GQY1167); . Voyage Project van de provincie Jiangxi Science and Technology Association
Concurrerende belangen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen
auteurs bijdragen
Study concepten en ontwerpen. XZhou, HC; Data-acquisitie: HC, RG, HC; Data-analyse: YL, JC; Manuscript voorbereiding: QG, RD, XZhang; Manuscript revisie: XQ, HL, CC. Alle auteurs hebben voldoende aan het onderzoek meegewerkt en goedgekeurd de definitieve versie.

• Bursectomy en non-bursectomy D2 gastrectomie voor gevorderde maagkanker, de eerste ervaringen van een enkele instelling in China
• Klinisch-pathologische betekenis van de nucleaire factor (erytroïde-2) -gerelateerde factor 2 (Nrf2) expressie bij maagkanker