Linfoangiogenesi nel cancro gastrico regolabile attraverso Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D axis

linfoangiogenesi nel carcinoma gastrico regolata attraverso l'asse Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D
Abstract
sfondo
linfangiogenesi gioca un ruolo significativo nella metastasi e recidive di cancro gastrico. Non vi è alcun rapporto ancora concentrandosi sulla modulazione della via di VEGF e linfoangiogenesi di cancro gastrico di mira Akt /mTOR. Questo studio ha lo scopo di dimostrare la relazione tra Akt mTOR /e VEGF-C /-D nel carcinoma gastrico.
Metodi
abbiamo raccolto chirurgicamente asportato esemplari con adenocarcinoma gastrico da 55 acconsentito pazienti. Immunoistochimica colorazione di p-Akt, p-mTOR, VEGF-C, VEGF-D sono stati effettuati e ha segnato da due patologi indipendenti. I risultati sono stati presentati come intensità di colorazione e la frequenza delle cellule colorazione positiva. Abbiamo anche misurato la densità vasi linfatici (LVD) per D2-40 colorazione. Diversi dosaggi di inibitore della p-Akt LY294002 (12,5 micron, 25 um, 50 micron) e inibitore della p-mTOR La rapamicina (25 Nm, 50 Nm, 100 nM) sono stati dati a gastrica linea di cellule di cancro SGC-7901 in vitro. Il tasso di inibizione della crescita cellulare è stato testato da MTT a 24 ore, 48 ore e 72 ore, rispettivamente e le espressioni di proteine ​​di Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D sono stati esaminati da Western Blot.
Risultati
I tassi di colorazione positivi di p-Akt, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D in 55 campioni clinici di cancro gastrico erano 74.54%, 85.45%, 72.73% e 58.18%. p-Akt e p-mTOR sono stati correlati positivamente con VEGF-C e VEGF-D (p < 0,01). L'LVD aumentata con tendenza incrementale di intensità della colorazione di p-Akt, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D. LY294002 o Rapamicina soppressi in modo significativo la crescita delle cellule SGC-7901 e il tasso di inibizione era dose e tempo dipendente (p < 0,001). Inoltre, l'espressione della proteina di p-Akt e p-mTOR sono stati positivamente correlata con quella di VEGF-C e VEGF-D (p < 0,05).
Conclusioni
Il livello di LVD in campioni di cancro gastrico è stato significativa superiore a quella del tessuto gastrico normale ed è stata positivamente correlata con p-Akt, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D. Inibizione di p-Akt e p-mTOR, in vitro, diminuzione di cellule tumorali VEGF-C e VEGF-D significativamente. Pertanto, abbiamo concluso che linfoangiogenesi di cancro gastrico potrebbe essere correlato alla Akt /mTOR-VEGF-C Asse /VEGF-D.
Parole
linfoangiogenesi cancro gastrico Akt /mTOR VEGF Sfondo
cancro gastrico è uno dei più la maggior parte delle neoplasie maligne comuni in tutto il mondo [1-3]. strategie di trattamento comune per il cancro gastrico comprendono la chirurgia, la radioterapia, la chemioterapia e la terapia mirata [4,5]. fallimenti di trattamento comprendono metastasi e recidive dopo l'operazione. Le principali vie di cancro gastrico metastatico sono invasione diretta, metastasi vascolare, metastasi linfatica e enterocoelia metastasi [3]. Tra questi, le metastasi linfatico è un criterio sempre più importante nel giudicare la prognosi del carcinoma gastrico e linfoangiogenesi è riconosciuto come un predittore significativo per la prognosi dei pazienti con cancro gastrico [1,2]. Inoltre, la metastasi linfatica cancro dello stomaco si crede di essere un evento precedente rispetto a metastasi vascolare, accade anche nel cancro gastrico precoce [3,4]. Pertanto, l'Unione internazionale contro il cancro ha portato il tasso linfoangiogenesi e la quantità di metastasi del linfonodo nella stadiazione del cancro gastrico nel valutare la prognosi [2,5]. Inoltre, anche se linfoadenectomia e chemioterapia intraperitoneale sono stati eseguiti durante il linfonodo progressione negativa, ha anche portato l'effetto positivo sul miglioramento del tasso di sopravvivenza a 5 anni di cancro gastrico [5].
I due modi stabiliti di entrata cellule tumorali nel sistema lymprhatic sono invasione dei dotti linfatici esistenti e l'induzione di linfoangiogenesi [3]. Quest'ultimo è considerato come il modo principale. Inoltre, linfoangiogenesi gioca un ruolo decisivo nella metastasi, recidive e la prognosi nei primi mesi del cancro gastrico [4]. Così, gli studi di linfoangiogenesi hanno un impatto promettente trattamento. VEGF-C e VEGF-D sono stati positivamente correlate a tumore metastasi solido linfatica, densità dei vasi linfatici (LVD) e profondità di invasione tumorale e recidiva secondo studi precedenti [6-8]. Inoltre, Akt /mTOR percorso è anche coinvolto nella regolazione della linfoangiogenesi e metastasi linfatica [9-11]. Pertanto, il rapporto tra pathway e VEGF vie Akt /mTOR è degno di essere chiariti. A nostra conoscenza, non vi è alcun rapporto ancora concentrandosi sulla modulazione della via di VEGF e linfangiogenesi di mira Akt /mTOR nel cancro gastrico. In questo studio, ci proponiamo di dimostrare la relazione tra Akt mTOR /e VEGF-C /-D nel carcinoma gastrico.
Metodi
campione clinico
resecati chirurgici esemplari con adenocarcinoma gastrico sono stati raccolti da 55 pazienti con gastrica cancro da aprile 2011 al novembre 2012. Tutti loro non ha ricevuto la radioterapia, la chemioterapia o immunoterapia prima dell'operazione. Lo studio è stato approvato dal comitato etico del Primo Ospedale Affiliato di Nanchang University e tutti i partecipanti hanno firmato un consenso informato.
Immunoistochimica
Tutti i campioni di tessuto sono stati fissati con formalina al 10%, di routine inclusi in paraffina, tagliato in 4 micron spessa come sezioni seriali, deparaffinato con xilene, reidratazione con un gradiente di etanolo e lavate con acqua distillata. Antigen recupero è stato eseguito immergendo sezioni in tampone recupero antigenico (0,5 M EDTA), e microonde per 20 min. Le sezioni sono state poi trattate con soluzione di perossido di idrogeno al 3%. I campioni sono stati bloccati con 5% di siero normale di capra e poi incubate overnight a 4 ° C con l'anticorpo primario: p-Akt (ser473) (coniglio, 1: 100, Cell Signaling Tecnologia, USA), p-mTOR (ser2448) ( Coniglio, 1: 200, Abcam, Stati Uniti d'America), VEGF-C (capra, 1: 400, R & D, Stati Uniti d'America), VEGF-D (mouse, 01:50, Santa Cruz, USA) e D2-40 (mouse, 1: 100, ZSGB-BIO, Cina). Poi, è stato aggiunto secondo anticorpo, ei campioni sono stati incubati per 30 min a temperatura ambiente e poi sviluppata con DAB. 5% di siero normale di capra è stato usato come controllo negativo invece dell'anticorpo primario. Immunoistochimica colorazione è stato segnato da due patologi indipendenti. I risultati sono stati presentati in forma di intensità di colorazione (+ /++ /+++) e tasso di cellule colorazione positiva.
Linfatico densità dei vasi
Secondo i criteri Masakau, D2-40 colorazione positiva (singola cellule endoteliali o cellule cluster) è stato contrassegnato come nave microlymphatic positivo. La zona ricca di vascolare in posizione e del tumore centro para-neoplastica sono stati definiti e 5 campi di "punti caldi" sono stati contati in modo casuale sotto alto ingrandimento (× 400). La media è stato contato come il LVD.
Cellula di sopravvivenza
Tre diversi dosaggi (12,5 micron, 25 micron, 50 micron) di inibitore di attivazione di Akt LY294002 (Sigma) o inibitore di attivazione di mTOR (25 Nm, 50 Nm, 100 nM ) rapamicina (Sigma) sono stati dati a gastrica linea di cellule di cancro SGC-7901. Il tasso di inibizione della crescita cellulare è stata testata mediante saggio MTT a 24 ore, 48 ore e 72 ore, rispettivamente.
Western Blot
cellule SGC-7901 sono stati omogeneizzati in RIPA tampone di lisi (10 mM Tris-HCl, pH 7,4 , 150 mM NaCl, 600 mM NP-40, 1% Triton X-100, 10% glicerolo, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoro, 1 mM sodio fluoruro, e 1 mM sodio orthovanadate) e mettere in ghiaccio per 2 h. La concentrazione di proteine ​​di ogni campione è stato determinato da Bio-Rad kit Protein Assay (Bio-Rad, laboratori, Hercules, CA, USA) secondo le istruzioni del produttore. Lisati contenenti 50 ug di proteine ​​sono state separate mediante SDS-PAGE e trasferite su membrane di nitrocellulosa. Le reazioni non specifiche sono state bloccate per 4 ore con TBS-T (50 mm Tris.HCl, pH7.4, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) contenente il 5% di latte secco non grasso. Poi le membrane sono state incubate overnight a 4 ° C con l'anticorpo primario: Akt (mouse, 1: 2000, Cell Signaling Tecnologia, Stati Uniti d'America), p-Akt (ser473) (Coniglio, 1: 2000, Cell Signaling Tecnologia, Stati Uniti d'America), mTOR ( Coniglio, 1: 1000, Cell Signaling Tecnologia, Stati Uniti d'America), p-mTOR (ser2448) (Coniglio, 1: 3000, Abcam, Stati Uniti d'America), VEGF-C (capra, 1: 1000, R & D, USA) e VEGF- D (mouse, 1: 500, Santa Cruz, USA). Dopo essere stato lavato con TBS-T che contiene latte in polvere senza grassi, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano. Le macchie proteiche sono state visualizzate mediante chemiluminescenza utilizzando ECL (Amersham). L'analisi statistica
campioni indipendenti T di prova tra i due gruppi e singoli analisi fattoriale della varianza (ANOVA) per confronti multipli sono stati utilizzati quando i dati in conformità con distribuzione normale ed omogeneità della varianza. In caso contrario, sono stati condotti test di Mann-Whitney tra i due gruppi e test di Kruskal-Wallis tra i multi-gruppi. analisi Spearman è stato usato per misurare la correlazione di misura e contare dati. Le analisi statistiche sono state eseguite da SPSS17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Un valore p < 0.05 è stato
considerato statisticamente significativo. Risultati
espressione di p-Akt, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D in situ
Le colorazioni immunoistochimica di p-Akt, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D in 55 campioni clinici di cancro gastrico sono stati mostrati (Figura 1). La colorazione positiva presentato soprattutto nel citoplasma e pochi nucleare macchiato in p-Akt e p-mTOR. I tassi di positività di p-Akt, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D sono stati 74.54%, 85.45%, 72.73% e 58.18% rispettivamente. La quantificazione di intensità della colorazione è stato mostrato nella Tabella 1. Figura 1 immunoistochimica colorazione di p-Akt, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D in campioni di cancro gastrico (× 400). A: p-Akt, B: p-mTOR, C: VEGF-C, D: VEGF-D, E: La correlazione tra p-Akt e p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D
Tabella 1. immunoistochimica colorazione di p-Akt, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D in campioni di cancro gastrico
Intensity (n)
tasso positivo (%) sull'oggetto -
+
++

p-Akt
14
29
12
74.54
p-mTOR
8
21
26
85.45
VEGF-C
15
22
18
72.73
VEGF-D
23
27
5
58.18
Le correlazioni di p-Akt e p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D, p-mTOR e VEGF-C /VEGF-D sono stati ulteriormente analizzati. espressione p-Akt è stata positivamente correlata con p-mTOR (p = 0,001), VEGF-C (p = 0,002) e VEGF-D (p = 0,009) (Figura 1E). Inoltre, p-mTOR è stato anche significativamente positivo relativo al VEGF-C (p < 0,001). E VEGF-D (p = 0,003)
densità vaso linfatico
D2-40 colorazione è stato utilizzato per calcolare l'LVD per cancro gastrico (Figura 2A) e abbinati tessuto gastrico normale (Figura 2B). Secondo i risultati, D2-40 macchiato soprattutto in endotelio linfatico nella distribuzione diffusa o in cluster. Sottile parete dei vasi linfatici mancava strato basale. La massima LVD è stata osservata sul bordo del tumore con una morfologia cluster come denso. Inoltre, D2-40 stato espresso nella sottomucosa di tessuto normale, con una espressione debole nello strato mucosa o muscolare così. L'LVD media di carcinoma gastrico e del tessuto normale erano 94.18 ± 72,965 vs 23,31 ± 21.569 Numero /5 campi ad alta potenza, p < 0.001. Figura 2 immunoistochimica colorazione dei D2-40 per LVD (× 400). A: tessuto del cancro gastrico, B: Matched tessuto normale, C: La correlazione tra LVD e p-Akt /p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D. . LVD = densità dei vasi linfatici
LVD sono stati correlati positivamente con p-Akt, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D per l'analisi di Spearman (p < 0,05). LVD è aumentata con la tendenza incrementale di intensità della colorazione di p-Akt, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D (Figura 2C).
Effetti di LY294002 e Rapamicina sulla SGC-7901 la crescita delle cellule
SGC-7901 cellule sono state coltivate con tre diversi dosaggi di LY294002 per 24 h, 48 he 72 h. Secondo saggio MTT, la crescita delle cellule SGC-7901 è stato frenato e il tasso di inibizione è risultata significativamente correlata con LY294002 dosaggio e tempo di azione (p < 0,001) (Figura 3A). Figura 3 Inibizione di p-Akt e p-mTOR nelle cellule SGC-7901 di LY294002 e Rapamicina. A: la crescita delle cellule SGC-7901 con l'intervento di diversi punti di tempo e dosaggi di LY294002, B: la crescita delle cellule SGC-7901 con l'intervento di diversi punti di tempo e dosaggi della rapamicina, C: Effetto di LY294002 (50 micron) e rapamicina (100 nM ) su Akt /mTOR e VEGF-C /-D da Western blot.
inoltre, le cellule sono state anche in coltura con diversi dosaggi di Rapamicina per 24 ore, 48 ore e 72 ore, rispettivamente. Il tasso di inibizione della SGC-7901 è stato anche significativamente correlata sia con Rapamicina dosaggio o tempo di azione (p < 0,001) (Figura 3B). Pertanto, sia LY294002 e rapamicina potrebbe inibire la crescita di SGC-7901 sia in modo dipendente dal tempo o dose-dipendente.
Effetto di LY294002 su Akt /mTOR e VEGF-C /-D
Il livello di proteine ​​di Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D in SGC-7901 con LY294002 (50 micron) di inibizione sono stati esaminati da Western blot. Tra questi, p-Akt, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D sono stati gradualmente diminuita con il tempo di azione prolungamento del LY294002 (Figura 3C). Vi era una differenza significativa rispetto al gruppo senza LY294002 (p < 0,05). Tuttavia, non vi era alcuna differenza statisticamente significativa per Akt e mTOR (p > 0,05). Conducendo inoltre una doppia analisi relazione variante, p-Akt è stata positivamente correlata con p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D (p < 0,05) e p-mTOR è stata anche positivamente correlata al VEGF-C /VEGF-D ( p. < 0,05)
effetto della rapamicina sul percorso mTOR e VEGF-C /-D
Il livello di proteine ​​di Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D in SGC -7901 con rapamicina (100 nM) inibizione sono stati esaminati da Western blot. Tra questi, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D sono diminuiti con il tempo di azione prolungamento della rapamicina (Figura 3C). Vi era una differenza significativa rispetto al gruppo senza rapamicina (p < 0,05). Tuttavia, non vi era alcuna differenza statistica per Akt, p-Akt e mTOR (p > 0,05). Conducendo inoltre una doppia analisi relazione variante, p-mTOR è stata positivamente correlata con VEGF-C e VEGF-D (p < 0,05).
Discussione
Akt /mTOR via di segnalazione è un importante percorso intracellulare, che risponde di citochine segnali, ed è dimostrato di svolgere un ruolo importante nella crescita cellulare, il metabolismo e l'apoptosi [12,13]. Akt /mTOR coinvolge in vari meccanismi patologici di tumore del colon-retto, cancro gastrico, cancro al fegato, cancro al seno e il cancro uterino, ecc [12-14]. Il nostro precedente studio ha confermato che p-Akt coinvolti nell'angiogenesi di adenocarcinoma gastrico e l'attivazione di Akt può contribuire a angiogenesi tramite VEGF-A up-regolazione [15]. In questo studio, i tassi di colorazione positivi di p-Akt e p-mTOR in 55 casi di cancro gastrico sono stati rispettivamente 74.54% e 85.45%. Inoltre, p-Akt è stata positivamente correlata con p-mTOR (p < 0,01). Questo risultato è stato coerente con gli studi precedenti e ha confermato il ruolo significativo di Akt /mTOR nel cancro gastrico. La prognosi clinica di cancro gastrico è anche proposto di essere associato con Akt e via VEGF. Per esempio, Murakami et al.
Ha suggerito che la prognosi dei pazienti affetti da cancro gastrico, senza espressione p-Akt era sempre meglio di quelli positivi p-Akt, e il tasso di sopravvivenza a 5 anni è stato del 68% e del 35% per i pazienti con T3 o tumori stadio T4, rispettivamente, [16]. Inoltre, il gene codificante Akt PI3CA
di PI3K proteine ​​a monte è stata associata con la sopravvivenza libera da malattia [17]. Inoltre, Wang et al.
Ha indicato che VEGF-C, VEGF-D e LVD di cancro gastrico è stato legato alla dimensione del tumore e la sopravvivenza globale, secondo uno studio in 123 casi [18,19]. La correlazione tra VEGF-C /LVD e la prognosi nella differenziazione del tumore, stadio T, metastasi linfonodali e metastasi a distanza sono stati anche confermato [20]. Un altro studio ha inoltre suggerito utilizzando la combinazione di VEGF-C /-D e CA 19-9 per predire le metastasi vasi linfatici [21].
Dato che Akt /mTOR e VEGF-C /-D svolgono un ruolo fondamentale nella metastasi linfatica e la prognosi , il nostro studio si propone di esplorare il rapporto tra due percorsi e promuovere ulteriormente il meccanismo di linfoangiogenesi e metastasi. Secondo i risultati di colorazione in situ
, p-Akt e p-mTOR erano correlati positivamente con VEGF-C e VEGF-D (p < 0.01). In termini di LVD, livello D2-40 del carcinoma gastrico e tessuti normali sono stati esaminati contemporaneamente. LVD nel cancro gastrico è quattro volte superiore a quello del tessuto normale. Inoltre, LVD è risultata significativamente correlata con p-Akt, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D (p < 0,05). In particolare, LVD così come VEGF-C /-D era ovviamente più bassa nei pazienti con espressione negativa di p-Akt e p-mTOR di quelli positivi. Si suggerisce che sia Akt /mTOR e percorso VEGF coinvolti in linfoangiogenesi e metastasi vaso linfatico nel cancro gastrico. Risultati simili sono stati confermati anche da altri studi. Yu et al.
Suggerito che p-mTOR sono stati molto coerenti con metastasi linfonodali e potrebbe essere un fattore predittivo indipendente di metastasi linfatica e la prognosi del cancro gastrico [22]. Inoltre, Onogawa et al.
Ha indicato che VEGF-C è stato fortemente correlata con metastasi linfatica secondo uno studio condotto in 140 casi di cancro gastrico precoce [23]. VEGF-C e VEGF-D è stato anche considerato come un fattore predittivo di metastasi linfatica in pazienti con cancro gastrico precoce [24]. Nello studio, abbiamo confermato ulteriormente il rapporto di Akt /mTOR, VEGF-C /-D e LVD nel cancro gastrico in situ
.
LY294002, come un inibitore di attivazione di Akt, è confermata con l'effetto anti-tumorale e promosso l'apoptosi di cancro gastrico in vitro e in vivo

[25]. Rapamicina conosciuto come un inibitore di attivazione mTOR è clinicamente utilizzato per il suo effetto anti-tumorale e immunomodulazione [26]. I risultati del nostro studio ha inoltre verificato che LY294002 e rapamicina potrebbe efficacemente inibire la crescita delle cellule SGC-7901. Inoltre, LY294002 a 50 micron) e Rapamicina a 100 nM ha avuto il tasso di inibizione più efficace (52.53 ± 3.19)% e (48.72 ± 3.06)% a 24 ore. Quando prolungando di 72 ore, i tassi di inibizione erano (68.76 ± 1.00)% e (68.50 ± 3.77)%, rispettivamente. Poi, abbiamo osservato l'influenza di inibizione della fosforilazione di Akt e mTOR da fattori linfatici, VEGF-C e VEGF-D. Alta concentrazione di LY294002 (50 pM) e rapamicina (100 nM) sono stati utilizzati per lo studio di intervento. Secondo i risultati, Rapamicina soppressa l'espressione di p-mTOR e LY294002 inibita efficacemente l'espressione di p-Akt e p-mTOR. Va osservato che entrambi inibitori potrebbero efficacemente inibire l'espressione di VEGF-C /-D. Inoltre, la down-regulation di p-Akt /p-mTOR ha mostrato una elevata coerenza con quella di VEGF-C /-D. Pertanto, Akt /mTOR è stato proposto di essere strettamente legato al VEGF-C /-D. I risultati sono stati simili anche in precedenza riportati in altri modelli tumorali. Ad esempio, Zhang et al.
Diminuito il recettore dell'insulina da breve hairpin RNA in linee cellulari di cancro, LCC6 e T47D. La proliferazione cellulare, l'angiogenesi, linfoangiogenesi e le metastasi sono stati inibiti a causa della down-regulation di p-Akt e l'inattivazione di VEGF-D [27]. Inoltre, l'inibizione mTOR potrebbe sopprimere l'espressione di VEGF-C e ridurre efficacemente linfoangiogenesi nel modello murino cancro pancreatico [11]. In un altro studio, VEGF-D è stato degradato da Honokiol per inibire linfangiogenesi di xenotrapianto cancro al polmone [28]. IL-6 potrebbe anche regolare VEGF-C a livello di mRNA attraverso Akt /segnalazione mTOR, che è diminuito in modo efficace il linfoangiogenesi e le metastasi nel carcinoma a cellule squamose orale [29].
Conclusione
Il livello di LVD in campioni di cancro gastrico era significativamente più alta di quella del tessuto gastrico normale e positivamente correlata con immunoistochimica colorazione di p-Akt, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D. Con l'inibizione di p-Akt e p-mTOR in vitro, VEGF-C e VEGF-D sono stati anche notevolmente diminuito. Pertanto, proponiamo che linfoangiogenesi di cancro gastrico potrebbe essere modulata in modo efficiente attraverso l'asse Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D
. Note
Hongxia Chen, Runnian Guan, Yupeng Lei e Jianyong Chen contribuito ugualmente a questo lavoro .
Abbreviazione
LVD:
linfatico densità dei vasi
dichiarazioni
Riconoscimento
Lo studio è stato sostenuto da un finanziamento da National Science Foundation sovvenzioni della Cina ( No. 81160307); Jiangxi Scienza & Tecnologia Programma pilastro e Science Foundation per giovani studiosi della provincia di Jiangxi (n 2007GQY1167); . Voyage progetto della provincia di Jiangxi Scienza e della Tecnologia Associazione
Competere interessi
Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco
autori contributi
concetti di studio e progettazione. XZhou, HC; L'acquisizione dei dati: HC, RG, HC; Analisi dei dati: YL, JC; preparazione del manoscritto: QG, RD, XZhang; revisione Manoscritto: XQ, HL, CC. Tutti gli autori hanno partecipato a sufficienza nello studio e approvato la versione finale.

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