Lymphangiogenèse dans le cancer gastrique réglementé par Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D axis

lymphangiogenèse dans le cancer gastrique réglementé par l'axe Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D
Résumé de l'arrière-plan
lymphangiogenèse joue un rôle important dans les métastases et la réapparition du cancer gastrique. Il n'y a pas encore le rapport en mettant l'accent sur la modulation de la voie du VEGF et la lymphangiogenèse du cancer gastrique en ciblant Akt /mTOR. Cette étude vise à démontrer la relation entre Akt /mTOR et VEGF-C /D dans le cancer gastrique.
Méthodes
Nous avons recueilli des échantillons de résection chirurgicale adénocarcinome gastrique à partir de 55 patients ont consenti. Immunohistochimie coloration de p-Akt, p-mTOR, VEGF-C, VEGF-D ont été effectuées et marqué par deux pathologistes indépendants. Les résultats ont été présentés comme intensité de la coloration et le taux de cellules de coloration positive. Nous avons également mesuré la densité des vaisseaux lymphatiques (LVD) par D2-40 coloration. Différentes doses d'inhibiteur de la p-Akt LY294002 (12,5 pM, 25 pM, 50 pM) et l'inhibiteur de p-mTOR rapamycine (25 nM, 50 nM, 100 nM) ont été données à la lignée cellulaire de cancer gastrique SGC-7901 in vitro. Le taux de croissance de la cellule d'inhibition a été testée par le MTT après 24 h, 48 h et 72 h, respectivement, et les expressions de protéines de Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR, le VEGF-C et VEGF-D ont été examinés par Western Blot.
Résultats
Les taux de coloration positive de p-Akt, p-mTOR, VEGF-C et VEGF-D dans 55 échantillons cliniques de cancer gastrique ont été 74,54%, 85,45%, 72,73% et 58,18%. p-Akt et p-mTOR étaient positivement corrélés avec le VEGF-C et VEGF-D (p < 0,01). LVD a augmenté avec une tendance progressive de l'intensité de la coloration de p-Akt-mTOR p, VEGF-C et VEGF-D. La rapamycine ou LY294002 supprimé de manière significative la croissance cellulaire SGC-7901 et le taux d'inhibition est dose et dépendante du temps (p < 0,001). En outre, l'expression de la protéine de p-Akt et p-mTOR ont été positivement corrélée avec celle du VEGF-C et VEGF-D (p < 0,05).
Conclusions
Le niveau de LVD dans des échantillons de cancer gastrique significativement plus élevée que celle du tissu gastrique normale et a été corrélée positivement avec le p-Akt-mTOR p, VEGF-C et VEGF-D. L'inhibition de p-Akt-mTOR et p, in vitro, une diminution des cellules tumorales VEGF-C et VEGF-D de manière significative. Par conséquent, nous avons conclu que la lymphangiogenèse du cancer gastrique pourrait être lié à Akt /mTOR VEGF-C axe /VEGF-D.
Mots-clés
lymphangiogenèse cancer gastrique Akt /mTOR VEGF Contexte
Le cancer gastrique est l'un des la plupart des tumeurs malignes communes dans le monde entier [1-3]. stratégies de traitement communes pour le cancer gastrique comprennent la chirurgie, la radiothérapie, la chimiothérapie et la thérapie ciblée [4,5]. Les échecs thérapeutiques comprennent les métastases et récidive après opération. Les principales voies métastatiques du cancer gastrique sont invasion directe, la métastase vasculaire, la métastase lymphatique et enterocoelia métastases [3]. Parmi ceux-ci, les métastases lymphatiques est un critère de plus en plus important pour juger le pronostic du carcinome gastrique et la lymphangiogenèse est reconnue comme étant un facteur prédictif significatif pour le pronostic des patients atteints d'un cancer gastrique [1,2]. En outre, le cancer de l'estomac métastatique lymphatique est considéré comme un événement antérieur par rapport à la métastase vasculaire, qui se passe même dans le cancer gastrique à un stade précoce [3,4]. Par conséquent, l'Union internationale contre le cancer a pris le taux de lymphangiogenèse et le montant de la métastase des ganglions lymphatiques dans la stadification du cancer gastrique dans l'évaluation du pronostic [2,5]. D'ailleurs, même si lymphadénectomie et chimiothérapie intrapéritonéale ont été réalisées au cours des ganglions lymphatiques progression négative, il a aussi apporté l'effet positif sur l'amélioration du taux de survie à 5 ans du cancer gastrique [5].
Les deux façons établies de cellules tumorales entrée dans la système lymprhatic sont invasion des conduits lymphatiques existants et l'induction de la lymphangiogenèse [3]. Ce dernier est considéré comme le principal moyen. En outre, la lymphangiogenèse joue un rôle décisif dans les métastases, la récurrence et le pronostic dans le cancer gastrique précoce [4]. Ainsi, les études de la lymphangiogenèse ont un impact sur le traitement prometteur. VEGF-C et VEGF-D ont été positivement liés à tumeur solide métastases lymphatiques, la densité des vaisseaux lymphatiques (LVD) et la profondeur de l'invasion tumorale et la récurrence selon des études précédentes [6-8]. En outre, la voie Akt /mTOR est également impliqué dans la régulation de la lymphangiogenèse et la métastase lymphatique [9-11]. Par conséquent, la relation entre Akt /mTOR et VEGF voies est digne d'être élucidé. À notre connaissance, il n'y a pas de rapport encore en mettant l'accent sur la modulation de la voie du VEGF et la lymphangiogenèse en ciblant Akt /mTOR dans le cancer gastrique. Dans cette étude, nous cherchons à démontrer la relation entre Akt /mTOR et VEGF-C /D dans le cancer gastrique.
Méthodes
échantillons cliniques
chirurgicaux réséqués échantillons d'adénocarcinome gastrique ont été recueillies auprès de 55 patients souffrant de l'estomac cancer d'Avril 2011 pour Novembre 2012. Tous reçu aucune radiothérapie, chimiothérapie ou immunothérapie avant l'opération. L'étude a été approuvée par le comité d'éthique de l'First Affiliated Hospital de l'Université de Nanchang et tous les participants a donné un consentement éclairé écrit.
Immunohistochimie
Tous les échantillons de tissus ont été fixés avec 10% de formaline, systématiquement inclus dans la paraffine, coupé en 4 pm épais comme sections de série, déparaffinées avec du xylène, réhydratation avec un gradient d'éthanol et lavé avec de l'eau distillée. La récupération d'antigène a été effectuée en immergeant les sections dans un tampon d'extraction antigénique (0,5 M d'EDTA) et aux micro-ondes pendant 20 min. Les coupes ont été ensuite traitées avec une solution à 3% de peroxyde d'hydrogène. Les échantillons ont été bloquées avec 5% de sérum de chèvre normal et ensuite mis en incubation pendant une nuit à 4 ° C avec l'anticorps primaire: p-Akt (Ser473) (lapin, 1: 100, Cell Signaling Technology, USA), le p-mTOR (ser2448) ( Lapin, 1: 200, Abcam, États-Unis), le VEGF-C (chèvre, 1: 400, R & D, USA), VEGF-D (souris, 01h50, Santa Cruz, États-Unis) et D2-40 (souris, 1: 100, ZSGB-BIO, Chine). Ensuite, le second anticorps a été ajouté et les échantillons ont été mis en incubation pendant 30 min à température ambiante, et ensuite développé avec DAB. 5% de sérum de chèvre normal a été utilisé comme témoin négatif à la place de l'anticorps primaire. Immunohistochimie coloration a été marqué par deux pathologistes indépendants. Les résultats ont été présentés sous la forme d'intensité de coloration (+ /++ /+++) et le taux de cellules de coloration positive.
Densité Lymphatique
Selon les critères Masakau, D2-40 coloration positive (seule cellule endothéliale ou cellule grappes) a été marquée comme navire microlymphatique positif. La zone vasculaire riche en emplacement et tumeur centre para-néoplasiques ont été définis et 5 champs de «points chauds» ont été comptés au hasard à fort grossissement (× 400). La moyenne a été compté comme le LVD.
Survie de cellulaire Trois dosages différents (12,5 uM, 25 uM, 50 uM) d'inhibiteur Akt d'activation LY294002 (Sigma) ou un inhibiteur de l'activation de mTOR (25 nM, 50 nM, 100 nM ) rapamycine (Sigma) ont été donnés à la lignée cellulaire de cancer gastrique SGC-7901. Le taux de croissance de la cellule d'inhibition a été testée par un test MTT à 24 h, 48 h et 72 h, respectivement.
Western Blot
cellules SGC-7901 ont été homogénéisées dans un tampon de lyse RIPA (10 mM de Tris-HCl, pH 7,4 , NaCl 150 mM, 600 mM, NP-40, 1% de Triton X-100, 10% de glycerol, 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle, le fluorure de sodium 1 mM et orthovanadate de sodium 1 mM) et mis sur de la glace pendant 2 heures. La concentration en protéines de chaque échantillon a été déterminée par Bio-Rad kit Protein Assay (Bio-Rad, Laboratories, Hercules, CA, USA) selon les instructions du fabricant. Les lysats contenant 50 ug de protéine ont été séparées par SDS-PAGE puis transférées sur des membranes de nitrocellulose. Les réactions non spécifiques ont été bloqués pendant 4 h avec du TBS-T (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,1% de Tween 20) contenant 5% de lait sec non gras. Ensuite, les membranes ont été incubées pendant une nuit à 4 ° C avec l'anticorps primaire: Akt (souris, 1: 2000, Cell Signaling Technology, USA), p-Akt (Ser473) (Rabbit, 1: 2000, Cell Signaling Technology, USA), mTOR ( Lapin, 1: 1000, Cell Signaling Technology, USA), p-mTOR (ser2448) (rabbit, 1: 3000, Abcam, USA), VEGF-C (chèvre, 1: 1000, R & D, USA) et le VEGF D (souris, 1: 500, Santa Cruz, États-Unis). Après lavage avec du TBS-T contenant du lait sec non gras, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort. Les empreintes de protéines ont été visualisées par chimioluminescence en utilisant ECL (Amersham). L'analyse statistique
échantillons indépendants Test T entre deux groupes et l'analyse de facteur de variance (Anova) pour les comparaisons multiples ont été utilisées lorsque les données en conformité avec la distribution normale et l'homogénéité de la variance. Sinon, le test de Mann-Whitney entre deux groupes et test de Kruskal-Wallis parmi les multi-groupes ont été menées. analyse Spearman a été utilisé pour mesurer la corrélation entre la mesure et données de comptage. Les analyses statistiques ont été effectuées par SPSS17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Une valeur de p < Expression: Résultats de 0,05 était considérée comme statistiquement significative. de p-Akt-mTOR p, VEGF-C et VEGF-D in situ
Les colorations immunohistochimiques de p-Akt-mTOR p, VEGF-C et VEGF-D dans des échantillons cliniques 55 gastriques de cancer ont été présentés (figure 1). La coloration positive a présenté la plupart du temps dans le cytoplasme et quelques nucléaire teinté p-Akt et p-mTOR. Les taux de p-Akt-mTOR p, VEGF-C et VEGF-D positivité sont respectivement 74,54%, 85,45%, 72,73% et 58,18%. La quantification de l'intensité de coloration a été présentée dans le tableau 1. La figure 1 coloration immunohistochimique de p-Akt-mTOR p, VEGF-C et VEGF-D dans un échantillon de cancer gastrique (x 400). R: p-Akt, B: p-mTOR, C: VEGF-C, D: VEGF-D, E: La corrélation entre le p-Akt-mTOR et p /VEGF-C /VEGF-D
Tableau 1. immunohistochimie coloration de p-Akt, p-mTOR, VEGF-C et VEGF-D dans les échantillons de cancer gastrique
Intensity (n)
taux positif (%)
-
+
++

p-Akt
14
29
12
74.54
p-mTOR
8
21
26
85.45
VEGF-C
15
22
18
72.73
VEGF-D
23
27
5
58.18
Les corrélations de p-Akt-mTOR et p /VEGF-C /VEGF-D, le p-mTOR et le VEGF-C /VEGF-D ont été analysés. l'expression de p-Akt est positivement corrélé avec le p-mTOR (p = 0,001), le VEGF-C (p = 0,002) et le VEGF-D (p = 0,009) (figure 1E). D'ailleurs, le p-mTOR a également été associée significativement positif au VEGF-C (p < 0,001). Et le VEGF-D (p = 0,003)
densité des vaisseaux Lymphatique
D2-40 coloration a été utilisée pour calculer le LVD pour cancer de l'estomac (figure 2A) et le tissu gastrique normale appariés (figure 2B). Selon les résultats, D2-40 tachée principalement dans l'endothélium lymphatique dans la distribution dispersée ou en cluster. Thin paroi du vaisseau lymphatique manquait couche basale. La plus haute LVD a été observée au bord de la tumeur avec une morphologie dense de cluster-like. En outre, D2-40 a été exprimé dans la sous-muqueuse du tissu normal, avec une expression plus faible dans la couche de muqueuse ou de muscle aussi bien. Le LVD moyen d'un carcinome gastrique et les tissus normaux étaient 94,18 ± 72,965 vs 23,31 ± 21.569 nombre /5 champs de forte puissance, p < 0,001. Figure 2 immunohistochimie coloration des D2-40 pour LVD (× 400). A: tissu de cancer gastrique, B: Assorti tissu normal, C: La corrélation entre LVD et p-Akt /p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D. . LVD = densité des vaisseaux lymphatiques
LVD étaient positivement corrélés avec le p-Akt, p-mTOR, VEGF-C et l'expression de VEGF-D par analyse Spearman (p < 0,05). LVD augmente avec la tendance progressive de l'intensité de la coloration de p-Akt-mTOR p, VEGF-C et VEGF-D (figure 2C).
Effets de LY294002 et de la rapamycine sur la croissance des cellules 7901 CGT CGT-7901
les cellules ont été cultivées avec trois doses différentes de LY294002 pendant 24 h, 48 h et 72 h. Selon le dosage MTT, SGC-7901 la croissance cellulaire a été freinée et le taux d'inhibition était significativement corrélée avec LY294002 dosage et le temps d'action (p < 0,001) (figure 3A). Figure 3: Inhibition de p-Akt et p-mTOR dans les cellules SGC-7901 par LY294002 et rapamycine. A: la croissance cellulaire SGC-7901 avec intervention de différents points dans le temps et les doses de LY294002, B: la croissance cellulaire SGC-7901 avec intervention de différents points dans le temps et les doses de rapamycine, C: Effet de LY294002 (50 uM) et de la rapamycine (100 nm ) sur Akt /mTOR et le VEGF-C /D par Western blot.
par ailleurs, les cellules ont également été cultivées avec différentes doses de rapamycine pendant 24 h, 48 h et 72 h, respectivement. Le taux de SGC-7901 inhibition a également été significativement corrélée avec soit rapamycine dosage ou le temps d'action (p < 0,001) (figure 3B). Effet de conséquence, à la fois le LY294002 et la rapamycine pourrait inhiber la croissance de la CGT-7901 soit de manière dépendante du temps ou la dose-dépendante. De LY294002 sur Akt /mTOR et le VEGF-C /D
Le niveau de protéine akt, le p-Akt, mTOR, p-mTOR, le VEGF-C et VEGF-D dans le SGC-7901 avec LY294002 (50 uM), une inhibition a été examinée par buvardage de Western. Parmi ceux-ci, le p-Akt-mTOR p, VEGF-C et VEGF-D ont été progressivement diminué avec le temps de LY294002 (figure 3C) d'action de prolongation. Il y avait une différence significative par rapport au groupe sans LY294002 (p < 0,05). Cependant, il n'y avait pas de différence statistique pour Akt et mTOR (p > 0,05). En réalisant en outre une double analyse de la relation variante, p-Akt est positivement corrélé avec le p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D (p < 0,05) et p-mTOR a également été positivement liée au VEGF-C /VEGF-D ( effet de 0,05) de la rapamycine sur la voie mTOR et le VEGF-C /D
Le niveau de protéine Akt, le p-Akt, mTOR, p-mTOR, le VEGF-C et VEGF-D dans le SGC; p <. -7901 avec de la rapamycine (100 nm) d'inhibition ont été examinés par Western blot. Parmi ceux-ci, le p-mTOR, le VEGF-C et l'expression de VEGF-D ont diminué avec le temps de la rapamycine (figure 3C) d'action de prolongation. Il y avait une différence significative par rapport au groupe sans rapamycine (p < 0,05). Cependant, il n'y avait pas de différence statistique pour Akt, p-Akt et mTOR (p > 0,05). En réalisant en outre une double analyse de la relation variante, p-mTOR est positivement corrélé avec le VEGF-C et VEGF-D (p < 0,05). De la discussion
Akt /mTOR voie de signalisation est une voie intracellulaire importante, qui répond à cytokine signaux, et il est prouvé à jouer un rôle majeur dans la croissance cellulaire, le métabolisme et l'apoptose [12,13]. Akt /mTOR entraîne dans divers mécanismes pathologiques du cancer colo-rectal, le cancer gastrique, le cancer du foie, le cancer du sein et cancer de l'utérus, etc. [12-14]. Notre précédente étude a confirmé que le p-Akt impliqué dans l'angiogenèse d'adénocarcinome gastrique et l'activation de Akt peut contribuer à l'angiogénèse par l'intermédiaire de VEGF-A-régulation [15]. Dans cette étude, les taux de coloration positive de p-Akt et p-mTOR dans 55 cas de cancer gastrique ont été 74,54% et 85,45% respectivement. D'ailleurs, le p-Akt est positivement corrélé avec le p-mTOR (p < 0,01). Ce résultat est cohérent avec les études précédentes et a confirmé le rôle important de Akt /mTOR dans le cancer gastrique. Le pronostic clinique d'un cancer gastrique est également proposé d'associer à la voie Akt et de VEGF. Par exemple, Murakami et al.
A suggéré que le pronostic des patients atteints de cancer gastrique sans expression de p-Akt était toujours mieux que les positifs p-Akt, et les taux de survie à 5 ans était de 68% et 35% pour les patients atteints de T3 ou de tumeurs de stade T4, respectivement [16]. Par ailleurs, le Akt gène codant PI3CA
amont PI3K de protéine a été associée à une survie sans maladie [17]. En outre, Wang et al.
A indiqué que le VEGF-C, VEGF-D et LVD du cancer gastrique ont été liée à la taille de la tumeur et la survie globale selon une étude dans 123 cas [18,19]. La corrélation entre le VEGF-C /LVD et le pronostic dans la différenciation de la tumeur, le stade T, métastase ganglionnaire et les métastases à distance ont également été confirmée [20]. Une autre étude a également suggéré d'utiliser la combinaison de VEGF-C /-D et CA 19.9 pour prédire lymphatique métastases des vaisseaux [21]. Étant donné que
Akt /mTOR et VEGF-C /-D jouent un rôle vital dans la métastase lymphatique et le pronostic , notre étude vise à explorer la relation entre les deux voies et de promouvoir davantage le mécanisme de la lymphangiogenèse et la métastase. D'après les résultats de la coloration in situ
, le p-Akt-mTOR et p en corrélation positive avec le VEGF-C et VEGF-D (p < 0,01). En termes de LVD, le niveau D2-40 du carcinome gastrique et les tissus normaux ont été examinés en même temps. DBT dans le cancer gastrique était quatre fois supérieure à celle des tissus normaux. Par ailleurs, LVD était significativement corrélé avec le p-Akt-mTOR p, VEGF-C et VEGF-D (p < 0,05). Notamment, LVD ainsi que VEGF-C /-D était évidemment plus faible chez les patients présentant une expression négative de p-Akt et p-mTOR que positifs. Il a suggéré que les deux Akt /mTOR et la voie VEGF impliqués dans la lymphangiogenèse et lymphatique métastases vasculaire dans le cancer gastrique. Des résultats similaires ont également été confirmés par d'autres études. Yu et al.
A suggéré que le p-mTOR étaient très compatibles avec métastases ganglionnaires et pourrait être un facteur prédictif indépendant de métastase lymphatique et le pronostic du cancer gastrique [22]. D'ailleurs, Onogawa et al.
A indiqué que le VEGF-C a été fortement corrélée avec la métastase lymphatique selon une étude menée dans 140 cas de cancer gastrique [23]. VEGF-C ainsi que le VEGF-D a également été considéré comme un prédicteur de métastase lymphatique chez les patients atteints de cancer gastrique précoce [24]. Dans l'étude, nous avons confirmé en outre la relation de Akt /mTOR, VEGF-C /-D et LVD dans le cancer gastrique situ
à.
LY294002, comme un inhibiteur de l'activation de Akt, est confirmée avec l'effet anti-tumoral et favorisé l'apoptose du cancer gastrique in vitro et in vivo

[25]. Rapamycine connu comme inhibiteur d'activation de mTOR est utilisée cliniquement pour son effet anti-tumoral et une immunomodulation [26]. Les résultats de notre étude a vérifié par ailleurs que le LY294002 et la rapamycine pourrait inhiber efficacement la croissance des cellules CGT-7901. Par ailleurs, le LY294002 à 50 uM) et de la rapamycine à 100 nM avaient le taux le plus efficace d'inhibition (52,53 ± 3,19)% et (48,72 ± 3,06)% en 24 h. Lors de la prolongation de 72 h, les taux d'inhibition étaient (68,76 ± 1,00)% et (68,50 ± 3,77)%, respectivement. Ensuite, on a observé l'influence de l'inhibition de la phosphorylation de Akt et mTOR sur les facteurs lymphatiques, le VEGF-C et VEGF-D. Une concentration élevée de LY294002 (50 uM) et rapamycine (100 nM) ont été utilisées pour l'étude d'intervention. D'après les résultats, la rapamycine a supprimé l'expression de la p-mTOR et LY294002 efficacement inhibé l'expression de la p-Akt, ainsi que le p-mTOR. Il est à noter que les deux inhibiteurs peuvent efficacement inhiber l'expression de VEGF-C /D. En outre, la régulation négative de p-Akt /p mTOR a montré une consistance élevée avec celle du VEGF-C /D. Par conséquent, Akt /mTOR a été proposé d'être étroitement liés à VEGF-C /-D. Les mêmes résultats ont également été rapportés précédemment dans d'autres modèles tumoraux. Par exemple, Zhang et al.
A diminué le récepteur de l'insuline par le petit ARN en épingle à cheveux dans des lignées cellulaires cancéreuses, et LCC6 T47D. La prolifération cellulaire, l'angiogenèse, la lymphangiogenèse et les métastases ont également été inhibée en raison de la régulation négative de p-Akt et l'inactivation de VEGF-D [27]. En outre, l'inhibition de mTOR peut supprimer l'expression de VEGF-C et de réduire efficacement la lymphangiogenèse dans le modèle de souris de cancer du pancréas [11]. Dans une autre étude, le VEGF-D a été dégradée par Honokiol pour inhiber la lymphangiogenèse du cancer du poumon xénogreffe [28]. IL-6 pourrait également réguler le VEGF-C, au niveau de l'ARNm par Akt /signalisation de mTOR, qui a diminué de manière efficace la lymphangiogenèse et des métastases dans le carcinome à cellules squameuses buccal [29].
Conclusion
Le niveau de DBT dans des échantillons de cancer gastrique était significativement plus élevée que celle du tissu gastrique normal et une corrélation positive avec la coloration immunohistochimique de p-Akt-mTOR p, VEGF-C et VEGF-D. Grâce à l'inhibition de la p-Akt-mTOR et p in vitro, le VEGF-C et VEGF-D ont également diminué de manière significative. Par conséquent, nous proposons que la lymphangiogenèse du cancer gastrique pourrait être efficacement modulée par l'axe Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D
. Hongxia Chen Notes, Runnian Guan, Yupeng Lei et Jianyong Chen a contribué également à ce travail .
Abréviation
LVD:
densité lymphatique
Déclarations de reconnaissance
L'étude a été soutenue par un financement de la Fondation des subventions nationales des sciences de Chine ( n ° 81160307); Jiangxi Science & Programme de pilier de la technologie et de la Fondation des sciences pour les jeunes chercheurs de la province du Jiangxi (n ° 2007GQY1167); . Projet Voyage de la province du Jiangxi la science et de la technologie Association
intérêts concurrents
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts des concepts d'étude de Contributions de
Auteurs et conception:. XZhou, HC; L'acquisition des données: HC, RG, HC; Analyse des données: YL, JC; Préparation du manuscrit: QG, RD, XZhang; révision du manuscrit: XQ, HL, CC. Tous les auteurs ont participé suffisamment à l'étude et approuvé la version finale.

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