Linfangiogénesis en el cáncer gástrico regulada a través de Akt mTOR VEGF-C-eje /VEGF-D /

Linfangiogénesis en el cáncer gástrico regulada a través del eje Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D
Abstract
Antecedentes
Linfangiogénesis juega un papel importante en la metástasis y la recurrencia de cáncer gástrico. No hay ningún informe aún se centra en la modulación de la vía VEGF y linfangiogénesis de cáncer gástrico por la orientación Akt /mTOR. Este estudio pretende demostrar la relación entre Akt /mTOR y VEGF-C /D en el cáncer gástrico.
Métodos
Recogimos resecado quirúrgicamente muestras de adenocarcinoma gástrico de 55 pacientes dieron su consentimiento. La tinción inmunohistoquímica de p-Akt, p-mTOR, VEGF-C, VEGF-D se realizaron y marcó por dos patólogos independientes. Los resultados se presentaron como la intensidad de tinción y velocidad de células de tinción positiva. También medimos la densidad de los vasos linfáticos (LVD) por D2-40 tinción. se les dio diferentes dosis de inhibidor de p-Akt LY294002 (12,5 M, 25 m, 50 m) y inhibidor de p-mTOR rapamicina (25 nM, 50 nM, 100 nM) a la línea celular de cáncer gástrico SGC-7901 in vitro. La tasa de inhibición del crecimiento celular se ensayó mediante MTT a las 24 h, 48 h y 72 h, respectivamente y expresiones de proteínas de Akt, p-AKT, mTOR, p-mTOR, VEGF-C y VEGF-D se examinaron por transferencia Western.
resultados
Las tasas de tinción positiva de p-Akt, p-mTOR, VEGF-C y VEGF-D en 55 muestras clínicas de cáncer gástrico fueron 74,54%, 85,45%, 72,73% y 58,18%. p-Akt y p-mTOR se correlacionó positivamente con VEGF-C y VEGF-D (p < 0,01). El LVD aumentó con la tendencia incremental de la intensidad de la tinción de p-Akt, p-mTOR, VEGF-C y VEGF-D. LY294002 o rapamicina suprimió significativamente el crecimiento celular SGC-7901 y la tasa de inhibición de la dosis y dependiente del tiempo (p < 0,001). Además, la expresión de la proteína de p-Akt y p-mTOR se correlacionaron positivamente con la de VEGF-C y VEGF-D (p < 0,05). Conclusiones
Francia El nivel de LVD en las muestras gástricas cáncer era significativamente mayor que la de tejido gástrico normal y se correlacionó positivamente con la p-Akt, p-mTOR, VEGF-C y VEGF-D. La inhibición de p-Akt y p-mTOR, in vitro, la disminución de las células tumorales VEGF-C y VEGF-D de manera significativa. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la LI de cáncer gástrico podría estar relacionado con la Akt-mTOR VEGF-C /eje /VEGF-D.
Palabras clave
cáncer gástrico Linfangiogénesis Akt /mTOR VEGF Antecedentes
El cáncer gástrico es una de las la mayoría de los tumores malignos comunes en todo el mundo [1-3]. estrategias de tratamiento común para el cáncer gástrico incluyen cirugía, radioterapia, quimioterapia y terapia dirigida [4,5]. Los fracasos del tratamiento incluyen la metástasis y la recurrencia después de la operación. Las principales rutas metastásicas de cáncer gástrico son la invasión directa, metástasis vascular, metástasis linfática y enterocoelia metástasis [3]. Entre ellos, metástasis linfática es un criterio cada vez más importante para juzgar el pronóstico de carcinoma gástrico y linfangiogénesis se reconoce como un factor de predicción importante para el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico [1,2]. Además, la metástasis linfática cáncer de estómago se cree que es un evento anterior en comparación con metástasis vascular, pasando incluso en el cáncer gástrico etapa temprana [3,4]. Por lo tanto, la Unión Internacional contra el Cáncer llevó la tasa de LI y la cantidad de metástasis de los ganglios linfáticos en la estadificación del cáncer gástrico en evaluar el pronóstico [2,5]. Además, incluso si la linfadenectomía y quimioterapia intraperitoneal se llevaron a cabo durante la progresión negativa de los ganglios linfáticos, también trajo el efecto positivo en la mejora de la tasa de supervivencia a 5 años del cáncer gástrico [5]. Empresas El dos formas establecidas de entrada de las células tumorales en el sistema lymprhatic son invasión de conductos linfáticos existentes y la inducción de la linfangiogénesis [3]. Este último se considera como la manera importante. Además, linfagiogénesis juega un papel decisivo en la metástasis, recurrencia y pronóstico en el cáncer gástrico precoz [4]. Por lo tanto, los estudios de linfagiogénesis tienen un impacto prometedora en el tratamiento. VEGF-C y VEGF-D se relacionaron positivamente con la metástasis de tumores sólidos linfático, la densidad de los vasos linfáticos (LVD) y la profundidad de la invasión tumoral y la recurrencia de acuerdo con estudios anteriores [6-8]. Además, Akt /mTOR también está implicado en la regulación de la LI y la metástasis linfática [9-11]. Por lo tanto, la relación entre Akt /mTOR la ​​vía VEGF y vías es digno de ser dilucidado. Hasta donde sabemos, no hay ningún informe todavía se centra en la modulación de la vía VEGF y linfagiogénesis por la orientación de Akt /mTOR en el cáncer gástrico. En este estudio, nuestro objetivo es demostrar la relación entre Akt /mTOR y VEGF-C /D en el cáncer gástrico.
Métodos
muestra clínica
muestras de adenocarcinoma gástrico resecados quirúrgicos se obtuvieron de 55 pacientes con gástrico cáncer de abril de 2011 hasta noviembre de 2012. Todos ellos no recibió radioterapia, quimioterapia o inmunoterapia antes de la operación. El estudio fue aprobado por el comité de ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Nanchang y todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito.
Inmunohistoquímica
Todas las muestras de tejido fueron fijadas con formol al 10%, habitualmente se incluyen en parafina, cortado en 4 micras grueso como secciones de serie, desparafinados con xileno, la rehidratación con un gradiente de etanol y se lavó con agua destilada. La recuperación del antígeno se llevó a cabo sumergiendo las secciones en tampón de recuperación antigénica (0,5 M EDTA), y el horno de microondas durante 20 min. Las secciones se trataron a continuación con una solución de 3% de peróxido de hidrógeno. Las muestras se bloquearon con suero de cabra normal al 5% y después se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario: p-Akt (Ser473) (conejo, 1: 100, Cell Signaling Technology, EE.UU.), p-mTOR (Ser2448) ( conejo, 1: 200, Abcam, EE.UU.), VEGF-C (cabra, 1: 400, R & D, EE.UU.), VEGF-D (ratón, 1:50, Santa Cruz, EE.UU.) y D2-40 (ratón, 1: 100, ZSGB-BIO, china). Después, se añadió segundo anticuerpo, y las muestras se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente y luego se desarrolló con DAB. 5% de suero de cabra normal se utilizó como control negativo en lugar del anticuerpo primario. La tinción inmunohistoquímica fue marcado por dos patólogos independientes. Los resultados se presentaron en forma de intensidad de la tinción (+ /++ /+++) y velocidad de células de tinción positiva.
Densidad de los vasos linfático
acuerdo con los criterios Masakau, tinción positiva D2-40 (célula endotelial o célula individual racimos) se ha marcado como buque microlymphatic positivo. El área vascular rico en para-neoplásica ubicación del tumor y el centro se definieron y 5 campos de "puntos calientes" se contaron al azar con gran aumento (x400). El promedio se contó como la DBT. Célula de supervivencia
tres dosis diferentes (12,5 M, 25 M, 50 M) de Akt inhibidor de la activación LY294002 (Sigma) o un inhibidor de la activación de mTOR (25 nM, 50 nM, 100 nM ) La rapamicina (Sigma) se les dio a la línea celular de cáncer gástrico SGC-7901. La tasa de inhibición del crecimiento celular se ensayó mediante el ensayo de MTT a las 24 h, 48 h y 72 h, respectivamente.
Western blot
células SGC-7901 se homogeneizaron en tampón de lisis RIPA (10 mM Tris-HCl, pH 7,4 , NaCl 150 mM, NP-40 600, 1% de Triton X-100, 10% de glicerol, 1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo, fluoruro de sodio 1 mM, y ortovanadato de sodio 1 mM) y poner en hielo durante 2 h. La concentración de proteínas de cada muestra se determinó por Bio-Rad kit de ensayo de proteínas (Bio-Rad, Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Los lisados ​​que contienen 50 g de proteína se separaron mediante SDS-PAGE y después se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. reacciones no específicas se bloquearon durante 4 h con TBS-T (mM Tris.HCl 50, pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,1% de Tween 20) que contiene 5% de leche seca no grasa. A continuación, las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario: Akt (ratón, 1: 2000, Cell Signaling Technology, EE.UU.), p-Akt (Ser473) (conejo, 1: 2000, Cell Signaling Technology, EE.UU.), mTOR ( conejo, 1: 1000, Cell Signaling Technology, EE.UU.), p-mTOR (Ser2448) (conejo, 1: 3000, Abcam, EE.UU.), VEGF-C (cabra, 1: 1000, R & D, EE.UU.) y VEGF D (ratón, 1: 500, Santa Cruz, EE.UU.). Después de ser lavado con TBS-T que contiene leche en polvo no grasa, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios de rábano picante y conjugado con peroxidasa. Las manchas de proteínas se visualizaron por quimioluminiscencia utilizando ECL (Amersham). El análisis estadístico
prueba de muestras independientes T entre dos grupos y análisis de un solo factor de la varianza (ANOVA) para las comparaciones múltiples cuando se utilizaron los datos de acuerdo con la distribución normal y la homogeneidad de la varianza. De lo contrario, se llevaron a cabo la prueba de Mann-Whitney entre los dos grupos y la prueba de Kruskal-Wallis entre múltiples grupos. Se utilizó el análisis de Spearman para medir la correlación de la medida y los datos de conteo. Los análisis estadísticos se realizaron mediante SPSS17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Un valor de p < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Expresión de p-Akt, p-mTOR, VEGF-C y VEGF-D in situ
Las tinciones de inmunohistoquímica de p-Akt, p-mTOR, VEGF-C y VEGF-D en 55 muestras clínicas de cáncer gástrico se muestra (Figura 1). La tinción positiva presenta principalmente en el citoplasma y unos pocos nuclear manchado de p-Akt-mTOR y p. Las tasas de positividad de p-Akt, p-mTOR, VEGF-C y VEGF-D eran 74,54%, 85,45%, 72,73% y 58,18%, respectivamente. La cuantificación de la intensidad de la tinción se muestra en la Tabla 1. La Figura 1 Inmunohistoquímica La tinción de p-Akt, p-mTOR, VEGF-C y VEGF-D en la muestra de cáncer gástrico (× 400). A: p-Akt, B: p-mTOR, C: VEGF-C, D: VEGF-D, E: La correlación entre P-Akt y p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D sobre Table 1. La tinción inmunohistoquímica de p-Akt, p-mTOR, VEGF-C y VEGF-D en muestras de cáncer gástrico
Intensidad (n)
tasa positiva (%) guía empresas -
+
++

p-Akt
14
29
12
74.54
p-mTOR
8
21
26
85.45
VEGF-C
15
22
18
72.73
VEGF-D
23
27
5
58.18
Se analizaron además las correlaciones de p-Akt-mTOR y p /VEGF-C /VEGF-D, p-mTOR y VEGF-C /VEGF-D. expresión de P-Akt se correlacionó positivamente con p-mTOR (p = 0,001), VEGF-C (p = 0,002) y VEGF-D (p = 0,009) (Figura 1E). Además, p-mTOR también estaba relacionado significativamente positivo al VEGF-C (p < 0,001). Y VEGF-D (p = 0,003)
densidad de los vasos linfáticos
tinción se utilizó para calcular el D2-40 LVD para cáncer gástrico (Figura 2A) y el tejido gástrico normal correspondiente (Figura 2B). Según los resultados, D2-40 tiñeron principalmente en el endotelio linfático en distribución dispersa o agrupado. Delgada pared del vaso linfático faltaba capa basal. El más alto LVD se observó en el borde del tumor con una densa agrupación morfología similar. Además, D2-40 se expresó en la submucosa de tejido normal, con una expresión más débil en la capa mucosa o muscular, así. El DVL promedio de carcinoma gástrico y el tejido normal fueron 94.18 ± 23.31 vs 72.965 ± 21.569 Número 5 campos de energía /alta, p < 0.001. Figura 2 La inmunohistoquímica tinción de D2-40 de LVD (× 400). R: tejido de cáncer gástrico, B: combinado de tejido normal, C: La correlación entre LVD y p-Akt /mTOR-p /VEGF-C /VEGF-D. . LVD = densidad de vasos linfáticos
LVD se correlacionó positivamente con p-Akt, p-mTOR, VEGF-C y VEGF-D expresión por análisis de Spearman (p < 0,05). LVD aumentó con la tendencia incremental de la intensidad de la tinción de p-Akt, p-mTOR, VEGF-C y VEGF-D (Figura 2C).
Efectos de LY294002 y rapamicina sobre el crecimiento celular-7901 SGC
SGC-7901 las células se cultivaron con tres dosis diferentes de LY294002 durante 24 h, 48 h y 72 h. De acuerdo con el ensayo de MTT, SGC-7901 el crecimiento celular fue frenada y la tasa de inhibición se correlacionó significativamente con la dosis y el tiempo de acción LY294002 (p < 0,001) (Figura 3A). Figura 3 La inhibición de p-Akt y p-mTOR en las células SGC-7901 por LY294002 y rapamicina. A: el crecimiento celular SGC-7901 con la intervención de diferentes puntos de tiempo y dosis de LY294002, B: crecimiento celular SGC-7901 con la intervención de diferentes puntos de tiempo y dosis de rapamicina, C: Efecto de LY294002 (50 M) y rapamicina (100 nM ) en Akt /mTOR y VEGF-C /D por Western blot.
además, las células también se cultivaron con diferentes dosis de rapamicina por 24 h, 48 h y 72 h, respectivamente. La tasa de inhibición de la SGC-7901 también se correlacionó significativamente con la dosis, ya sea rapamicina o el tiempo de acción (p < 0,001) (Figura 3B). Por lo tanto, tanto LY294002 y rapamicina podrían inhibir el crecimiento de SGC-7901, ya sea en forma dependiente del tiempo o dependiente de la dosis.
Efecto de LY294002 en Akt /mTOR y VEGF-C /D
El nivel de proteína de Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR, VEGF-C y VEGF-D en SGC-7901 con LY294002 (50 mM) de inhibición se examinó por transferencia de Western. Entre ellos, p-Akt, p-mTOR, VEGF-C y VEGF-D se redujo gradualmente con el tiempo de acción prolongación de LY294002 (Figura 3C). Hubo una diferencia significativa en comparación con el grupo sin LY294002 (p < 0,05). Sin embargo, no hubo diferencia estadística para Akt y mTOR (p > 0,05). Al llevar a cabo además un análisis de relación variante dual, p-Akt se correlacionó positivamente con p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D (p < 0,05) y p-mTOR también fue positivamente relacionada con el VEGF-C /VEGF-D ( p <. 0.05)
efecto de la rapamicina sobre la vía mTOR y VEGF-C /D
El nivel de proteína Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR, VEGF-C y VEGF-D en SGC -7901 con rapamicina (100 nM) inhibición se examinaron mediante transferencia Western. Entre ellos, p-mTOR, VEGF-C y la expresión de VEGF-D se redujo con el tiempo de acción prolongación de la rapamicina (Figura 3C). Hubo una diferencia significativa en comparación con el grupo sin rapamicina (p < 0,05). Sin embargo, no hubo diferencia estadística para Akt, p-Akt y mTOR (p > 0,05). Al llevar a cabo además un análisis de relación variante dual, p-mTOR se correlacionó positivamente con VEGF-C y VEGF-D (p < 0,05).
Discusión
vía de señalización de Akt /mTOR es una importante vía intracelular, que responde de citoquinas señales, y está demostrado desempeñar un papel importante en el crecimiento celular, el metabolismo y la apoptosis [12,13]. Akt /mTOR implica en diversos mecanismos patológicos de cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de mama y cáncer uterino etc. [12-14]. Nuestro estudio anterior confirmó que p-Akt implicados en la angiogénesis de adenocarcinoma gástrico y la activación de Akt puede contribuir a la angiogénesis a través de VEGF-A de la regulación [15]. En este estudio, las tasas de tinción positiva de p-Akt y p-mTOR en 55 casos de cáncer gástrico fueron 74,54% y 85,45%, respectivamente. Además, p-Akt se correlacionó positivamente con p-mTOR (p < 0,01). Este resultado fue consistente con estudios previos y confirmó el importante papel de la vía /mTOR Akt en el cáncer gástrico. También se propone la pronóstico clínico de cáncer gástrico asociado con Akt y la vía VEGF. Por ejemplo, Murakami et al.
Sugirió que el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico sin expresión de p-Akt fue siempre mejor que los p-Akt positivos, y las tasas de supervivencia a 5 años fue del 68% y del 35% para los pacientes con T3 o tumores en etapa T4, respectivamente [16]. Además, el gen que codifica la Akt PI3CA Red de PI3K proteína de aguas arriba se asoció con la supervivencia libre de enfermedad [17]. Además, Wang et al.
Indica que el VEGF-C, VEGF-D y LVD de cáncer gástrico se relaciona con el tamaño del tumor y la supervivencia global, según un estudio de 123 casos [18,19]. La correlación entre el VEGF-C /LVD y el pronóstico en la diferenciación tumoral, estadio T, metástasis de ganglios linfáticos y metástasis a distancia también se confirmaron [20]. Otro estudio sugiere además el uso de la combinación de VEGF-C /D y CA 19-9 para predecir la metástasis linfática vascular [21].
Dado que la Akt /mTOR y VEGF-C /D juegan un papel vital en la metástasis linfática y pronóstico , nuestro estudio tiene como objetivo explorar la relación entre dos vías y promover aún más el mecanismo de la LI y la metástasis. De acuerdo con los resultados de la tinción in situ
, p-Akt y p-mTOR se correlacionó positivamente con VEGF-C y VEGF-D (p < 0,01). En términos de LVD, D2-40 nivel del carcinoma gástrico y los tejidos normales fueron examinados al mismo tiempo. LVD en el cáncer gástrico era cuatro veces mayor que la del tejido normal. Además, LVD se correlacionó significativamente con p-Akt, p-mTOR, VEGF-C y VEGF-D (p < 0,05). Notablemente, LVD, así como VEGF-C /D fue obviamente menor en pacientes con expresión negativa de p-Akt y p-mTOR que los positivos. Se sugirió que tanto Akt /mTOR y la vía VEGF implicados en la LI y la metástasis de vasos linfáticos en el cáncer gástrico. Resultados similares también fueron confirmados por otros estudios. Yu et al.
Sugirió que el p-mTOR eran muy coherentes con metástasis en los ganglios linfáticos y podría ser un predictor independiente de la metástasis linfática y pronóstico del cáncer gástrico [22]. Además, Onogawa et al.
Indica que el VEGF-C fue altamente correlacionado con metástasis linfática de acuerdo con un estudio realizado en 140 casos de cáncer gástrico precoz [23]. VEGF-C, así como VEGF-D también se ha considerado como un predictor de metástasis linfática en pacientes con cáncer gástrico precoz [24]. En el estudio, se confirmó aún más la relación de Akt /mTOR, VEGF-C /D y LVD en el cáncer gástrico in situ
.
LY294002, como un inhibidor de la activación de Akt, se confirma con el efecto antitumoral y promovió la apoptosis de cáncer gástrico in vitro e in vivo

[25]. La rapamicina conocido como un inhibidor de la activación de mTOR se utiliza clínicamente para su efecto antitumoral e inmunomodulación [26]. Los resultados de nuestro estudio verificó además que LY294002 y rapamicina podría inhibir eficazmente el crecimiento de las células SGC-7901. Además, LY294002 a 50 mM) y rapamicina a 100 nM tenían la tasa de inhibición más eficaz de (52,53 ± 3,19)% y (48,72 ± 3,06)% en 24 h. Cuando la prolongación a 72 h, las tasas de inhibición fueron (68,76 ± 1,00)% y (68.50 ± 3.77)%, respectivamente. A continuación, se observó la influencia de la inhibición de la fosforilación de Akt y mTOR en factores linfáticos, VEGF-C y VEGF-D. La alta concentración de LY294002 (50 M) y rapamicina (100 nM) se utilizaron para el estudio de intervención. Según los resultados, la rapamicina suprime la expresión de p-mTOR y LY294002 inhibe eficazmente la expresión de p-Akt, así como p-mTOR. Se observa que ambos inhibidores pueden inhibir eficazmente la expresión de VEGF-C /D. Además, la baja regulación de p-Akt /mTOR-p mostró una alta consistencia con la de VEGF-C /D. Por lo tanto, se propuso vía /mTOR Akt estar estrechamente relacionado con VEGF-C /D. Los resultados similares También se informó anteriormente en otros modelos de tumores. Por ejemplo, Zhang et al.
Disminuyó el receptor de la insulina por el ARN de horquilla corta en líneas celulares de cáncer, LCC6 y T47D. La proliferación celular, la angiogénesis, la LI y la metástasis también se inhibieron debido a la baja regulación de p-Akt y la inactivación de VEGF-D [27]. Además, la inhibición de mTOR podría suprimir la expresión de VEGF-C y reducir efectivamente la linfangiogénesis en modelo de ratón de cáncer de páncreas [11]. En otro estudio, VEGF-D se degradó por Honokiol para inhibir la linfangiogénesis de xenoinjerto de cáncer de pulmón [28]. IL-6 también podría regular VEGF-C a nivel del ARNm a través de Akt vía de señalización /mTOR, que efectivamente disminuyó la LI y la metástasis en el carcinoma oral de células escamosas [29].
Conclusión comentario El nivel de LVD en muestras de cáncer gástrico fue significativamente mayor que la de tejido gástrico normal y una correlación positiva con la tinción inmunohistoquímica de p-Akt, p-mTOR, VEGF-C y VEGF-D. Con la inhibición de la p-Akt y p-mTOR in vitro, VEGF-C y VEGF-D también se redujo significativamente. Por lo tanto, proponemos que la LI de cáncer gástrico podría ser modulada de manera eficiente a través del eje de Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D.
Notas
Hongxia Chen, Runnian Guan, Yupeng Lei y Chen Jianyong contribuido igualmente a esta labor .
Abreviatura
LVD:
densidad de los vasos linfáticos
Declaraciones
Reconocimiento Francia El estudio fue apoyado por fondos de la National Science Foundation Subvenciones de china ( No. 81160307); Jiangxi Ciencia & Programa Pilar Tecnología y la Fundación Ciencia para Jóvenes Investigadores de la provincia de Jiangxi (núm 2007GQY1167); . Proyecto de rutas de la provincia de Jiangxi Ciencia y Tecnología Asociación
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia contribuciones
Autores de conceptos y diseño del estudio:. XZhou, HC; La adquisición de datos: HC, RG, HC; Análisis de los datos: YL, JC; Preparación del manuscrito: QG, RD, XZhang; revisión de manuscritos: XQ, NS, CC. Todos los autores han participado lo suficiente en el estudio y aprobó la versión final.

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