Лимфангиогенез в рака желудка регулируется с помощью Akt /МРМ-VEGF-C /VEGF-D axis

лимфангиогенез в рака желудка регулируется с помощью оси /МРМ-VEGF-C /VEGF-D Akt
Аннотация
Справочная информация
лимфангиогенез играет Значительную роль в метастазирования и рецидива рака желудка. Там нет отчета еще сосредоточив внимание на модуляции VEGF пути и лимфангиогенеза рака желудка путем пристреливать Akt /MTOR путь. Цель данного исследования, чтобы продемонстрировать взаимосвязь между Akt /MTOR пути и VEGF-C /-D при раке желудка.
Методы
Мы собрали хирургическим путем резецированные желудка образцов аденокарциномы из 55 пациентов согласились. Иммуногистохимическое окрашивание р-Akt, п-МРМ, VEGF-C, VEGF-D были выполнены и забил два независимых патологоанатомов. Результаты были представлены в виде интенсивности окрашивания и положительной скоростью клеточного окрашивания. Мы также измеряли лимфатическую плотность сосудов (LVD) путем D2-40 окрашивания. Различные дозы р-Akt ингибитор LY294002 (12,5 мкМ, 25 мкМ, 50 мкМ) и ингибитора р-MTOR Рапамицин (25 нМ, 50 нМ, 100 нМ) были даны клетку рака желудка линии SGC-7901 в пробирке. Степень ингибирования роста клеток тестировали МТТ через 24 ч, 48 ч и 72 ч соответственно и белковые выражениям Akt, п-Akt, МРМ, п-МРМ, VEGF-C и VEGF-D были исследованы Вестерн-блоттинга.

Результаты положительные темпы окрашивания р-Akt, п-МРМ, VEGF-C и VEGF-D в 55 рака желудка клинических образцов были 74,54%, 85,45%, 72,73% и 58,18%. п-Akt и п-MTOR положительно коррелируют с VEGF-C и VEGF-D (р &л; 0,01). LVD увеличилась с инкрементного тенденцией интенсивности окрашивания р-Akt, п-МРМ, VEGF-C и VEGF-D. LY294002 или Рапамицин значительно подавлена ​​SGC-7901 рост клеток и степень ингибирования была доза и зависящая от времени (р &л; 0,001). Кроме того, экспрессия белка п-Akt и п-МРМ положительно коррелируют с тем из VEGF-C и VEGF-D (р &л; 0,05).
Выводы
Уровень из LVD в желудочном образцов рака было значительное выше, чем у нормальной желудочной ткани и положительно коррелировал с п-Akt, п-МРМ, VEGF-C и VEGF-D. Ингибирование р-Akt и п-МРМ, в пробирке, снижение опухолевых клеток VEGF-C и VEGF-D значительно. Таким образом, мы пришли к выводу, что лимфангиогенез рака желудка может быть связано с Akt /МРМ-VEGF-C оси /VEGF-D.
Ключевые слова
лимфангиогенез рак желудка Akt /MTOR VEGF Предпосылки
Рак желудка является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований во всем мире [1-3]. Общие стратегии для лечения рака желудка включают хирургию, лучевую терапию, химиотерапию и целенаправленной терапии [4,5]. неудачи лечения включают метастаз и рецидивов после операции. Основными метастатических маршруты рака желудка являются прямое вторжение, сосудов, метастазирования лимфатический метастазирование и enterocoelia метастазирование [3]. Среди тех, лимфатический метастаз становится все более важным критерием при оценке прогноза карциномы желудка и лимфангиогенеза признан значимым предиктором для прогноза больных раком желудка [1,2]. Кроме того, рак желудка лимфатического метастазирования, как полагают, более раннее событие по сравнению с сосудистым метастаз, что происходит, даже на ранней стадии рака желудка [3,4]. Таким образом, Международный союз против рака принял ставку лимфангиогенез и количество метастаз лимфатических узлов в стадии рака желудка в оценке прогноза [2,5]. К тому же, даже если лимфаденэктомии и внутрибрюшинного химиотерапии были проведены во время лимфоузлов отрицательной прогрессии, она также принесла положительный эффект на улучшение коэффициента выживаемости 5-летней рака [5] желудка.
Два установленных пути вступления опухолевых клеток в система lymprhatic являются вторжением в существующих лимфатическим путям и индукция лимфангиогенеза [3]. Последнее рассматривается в качестве основного пути. Кроме того, лимфангиогенез играет решающую роль в метастазирования, рецидивов и прогноз при раннем раке желудка [4]. Таким образом, исследования лимфангиогенеза имеют многообещающее влияние на лечение. VEGF-C и VEGF-D были положительно связаны с солидных опухолей лимфатической метастаз, лимфатический сосуд плотности (LVD) и глубиной инвазии опухоли и рецидива в соответствии с предыдущими исследованиями [6-8]. Кроме того, Akt /MTOR путь также участвует в регуляции лимфангиогенеза и лимфатического метастазирования [9-11]. Таким образом, отношения между Akt /MTOR пути и пути VEGF достоин быть выяснены. Насколько нам известно, нет никакого отчета еще сосредоточив внимание на модуляции VEGF пути и лимфангиогенеза путем пристреливать Akt /MTOR пути в развитии рака желудка. В данном исследовании мы стремимся продемонстрировать взаимосвязь между Akt /MTOR пути и VEGF-C /-D при раке желудка.
Методы клинического образца

Хирургические резецированными желудка образцов аденокарциномы были собраны из 55 пациентов с язвенной рак с апреля 2011 по ноябрь 2012 года Все они не получали радиотерапию, химиотерапию или иммунотерапию перед операцией. Исследование было одобрено этическим комитетом Первого филиал больницы Наньчан университета, и все участники дали письменное информированное согласие.
Immunohistochemistry
Все образцы ткани фиксировали 10% формалином, обычно заключали в парафин, разрезать на 4-мкм толщиной в серийных срезах, депарафинированных ксилолом, регидратации с градиентом этанола и промывают дистиллированной водой. Антиген поиска проводили погружая секции в антигенной поиска взаимосвязанного буфере (0,5 М ЭДТА), и микропомахивание в течение 20 мин. Затем срезы обрабатывали 3% раствором перекиси водорода. Образцы блокировали 5% нормальной козьей сыворотки, а затем инкубировали в течение ночи при 4 ° С с первичным антителом: п-Akt (ser473) (Кролик, 1: 100, Cell Signaling Technology, США), п-МРМ (ser2448) ( Кролик, 1: 200, Abcam, США), VEGF-C (Коза, 1: 400, R &Amp; D, USA), VEGF-D (мышь, 1:50, Санта Круз, США) и D2-40 (мышь, 1: 100, ZSGB-BIO, Китай). Затем добавляют второе антитело, и образцы инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем разработана с ДАБ. 5% сыворотки нормальной козьей использовали в качестве отрицательного контроля вместо первичного антитела. Иммуногистохимическое окрашивание оценивали двумя независимыми патологоанатомов. Результаты были представлены в виде интенсивности окрашивания (+ /++ /+++) и положительную скорость окрашивания клеток.
плотность сосудов лимфатической
В соответствии с критериями Masakau, D2-40 положительное окрашивание (одной эндотелиальной клетки или клетки кластеры) был отмечен как положительный microlymphatic судна. Сосудисто-богатая область в п-опухолевое местонахождения и опухолевой центра были определены и 5 полей «горячих точек» были случайным образом подсчитываются при большом увеличении (× 400). Средняя подсчитывали как LVD.
Выживание клеток
Три различных дозировок (12,5 мкМ, 25 мкМ, 50 мкМ) ингибитора активации Akt LY294002 (Sigma) или ингибитора активации МРМ (25 нМ, 50 нМ, 100 нМ ) рапамицин (Sigma) были даны клетку рака желудка линии SGC-7901. Степень ингибирования роста клеток тестировали с помощью МТТ-теста через 24 ч, 48 ч и 72 ч, соответственно.
Вестерн-блот
СГК-7901 клетки гомогенизировали в RIPA буфера для лизиса (10 мМ Трис-HCl, рН 7,4 , 150 мМ NaCl, 600 мМ NP-40, 1% Тритон Х-100, 10% глицерина, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, 1 мМ фторида натрия и 1 мМ ортованадата натри) и помещали на лед в течение 2 ч. Концентрация белка каждого образца определяли с помощью Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories,, Hercules, CA, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Лизаты содержащие 50 мкг белка разделяли с помощью SDS-PAGE, а затем переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Неспецифические реакции блокировали в течение 4 ч с TBS-T (50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,1% Tween 20), содержащей 5% нежирное сухое молоко. Затем мембраны инкубировали в течение ночи при 4 ° С с первичным антителом: Akt (мышь, 1: 2000, Cell Signaling Technology, США), п-Akt (ser473) (кролик, 1: 2000, Cell Signaling Technology, США), МРМ ( Кролик, 1: 1000, Cell Signaling Technology, США), п-МРМ (ser2448) (Кролик, 1: 3000, Abcam, США), VEGF-C (Коза, 1: 1000, R &Amp; D, USA), и VEGF- D (Мышь, 1: 500, Santa Cruz, США). После промывки с TBS-T, содержащий обезжиренное сухое молоко, мембраны инкубировали с конъюгированными с пероксидазой хрена вторичных антител. Белковые блоты были визуализированы с помощью хемилюминесценции с использованием ECL (Amersham).
Статистический анализ
независимых выборок Т тест между двумя группами и одного факторного анализа вариаций (ANOVA) для множественных сравнений были использованы, когда данные в соответствии с нормальным распределением и однородность дисперсии. В противном случае, были проведены испытания Манна-Уитни между двумя группами и тест Крускала-Уоллиса среди мульти-групп. анализ Спирмена был использован для измерения корреляции измерения и подсчета данных. Статистический анализ проводили с помощью SPSS17.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Р-значение &л; 0,05 считали статистически значимыми.

Результаты Экспрессия р-Akt, п-МРМ, VEGF-C и VEGF-D на месте
The иммуногистохимических окрашиванием р-Akt, п-МРМ, VEGF-C и VEGF-D в 55 рака желудка клинических образцов было показано (рисунок 1). Положительное окрашивание представлены в основном в цитоплазме и несколько ядерный окрашивали в р-Akt и п-МРМ. Скорости положительности р-Akt, п-МРМ, VEGF-C и VEGF-D были 74,54%, 85,45%, 72,73% и 58,18% соответственно. Количественное интенсивности окрашивания было показано в таблице 1. Рисунок 1 иммуногистохимии окрашивание р-Akt, п-МРМ, VEGF-C и VEGF-D в желудочном образце рака (× 400). А: р-Akt, В: п-МРМ, С: СЭФР-С, D: VEGF-D, Е: Корреляция между п-Akt и п-МРМ /VEGF-C /VEGF-D
Таблица 1. Иммуногистохимическое окрашивание р-Akt, п-МРМ, VEGF-C и VEGF-D в желудочном образцов рака

Intensity (п)

Положительная ставка (%) Buhsoft Forums -

+

++

p-Akt
14
29
12
74.54
p-mTOR
8
21
26
85.45
VEGF-C
15
22
18
72.73
VEGF-D
23
27
5
58.18
были дополнительно проанализированы корреляции р-Akt и п-МРМ /VEGF-C /VEGF-D, п-МРМ и VEGF-C /VEGF-D. п-Akt выражение положительно коррелировал с п-МРМ (р = 0,001), VEGF-C (р = 0,002) и VEGF-D (р = 0,009) (рис 1E). Кроме того, п-МРМ была также значительно положительно связано с VEGF-C (р &л; 0,001). И VEGF-D (р = 0,003)
плотность сосудов лимфатической
D2-40 окрашивания был использован для расчета LVD для рак желудка (фиг.2А) и в норме у желудочной ткани (фиг.2В). Согласно результатам, D2-40 окрашивают преимущественно в лимфатической эндотелий в рассеянном или кластерном распределении. Тонкий лимфатической стенки сосуда не хватало базального слоя. Самая высокая LVD наблюдалась у края опухоли с плотной кластерной морфологией. Кроме того, была выражена D2-40 в подслизистой нормальной ткани, с более слабым выражением в слизистой оболочке или мышечного слоя, а также. Средняя LVD желудочного рака и нормальной ткани были 94.18 ± 72.965 против 23.31 ± 21.569 число /5 высоких силовых полей, с &лт; 0,001. Рисунок 2 Иммуногистохимическое окрашивание D2-40 для NSR (× 400). A: Желудочный раковой ткани, B: Сопрягано нормальная ткань, C: Корреляция между LVD и п-Akt /п-МРМ /VEGF-C /VEGF-D. . LVD = лимфатический сосуд плотность изображения LVD положительно коррелируют с п-Akt, п-МРМ, VEGF-C и экспрессии VEGF-D на анализ Спирмена (р &л; 0,05). LVD увеличилась с пошаговыми тенденцией окрашивания интенсивности р-Akt, п-МРМ, VEGF-C и VEGF-D (рис 2С).
Эффекты LY294002 и рапамицина на рост-7901 SGC клеток
SGC-7901 клетки культивировали с тремя различными дозами LY294002 в течение 24 ч, 48 ч и 72 ч. В соответствии с МТТ, рост клеток SGC-7901 был бордюр, и степень ингибирования была достоверно коррелирует с дозой LY294002 и времени действия (р &ЛТ; 0,001) (рис 3А). Рисунок 3 Ингибирование р-Akt и п-МРМ в SGC-7901 клеток с помощью LY294002 и рапамицина. А: СГК-7901 рост клеток с вмешательством различные моменты времени и дозировки LY294002, B: рост СГК-7901 клеток с вмешательством различные моменты времени и дозы рапамицина, C: Влияние LY294002 (50 мкМ) и рапамицином (100 нМ ) на Akt /МРМ пути и VEGF-C /-D путем Вестерн-блоттинга.
Кроме того, клетки были также культивировали с различными дозами рапамицина в течение 24 ч, 48 ч и 72 ч соответственно. Степень ингибирования СГК-7901 была также достоверно коррелировала с дозой либо рапамицина или времени действия (р &ЛТ; 0,001) (рис 3б). Поэтому, как LY294002 и Рапамицин может ингибировать рост SGC-7901 в любом зависящих от времени или зависимым от дозы образом.
Влияние LY294002 на Akt /MTOR пути и VEGF-C /-D
Уровень белка Akt, п-Akt, МРМ, п-МРМ, VEGF-C и VEGF-D в SGC-7901 с LY294002 (50 мкМ) ингибирование исследовали с помощью Вестерн-блоттинга. Среди них, п-Akt, п-МРМ, VEGF-C и VEGF-D были постепенно уменьшается со временем пролонгации действия LY294002 (рис 3C). Был значительное различие в сравнении с группой без LY294002 (р ≪ 0,05). Тем не менее, не было никакой статистической разницы для Akt и МРМ (р > 0,05). При дальнейшем проведении анализа двойного отношение вариант, п-Akt положительно коррелировал с п-МРМ /VEGF-C /VEGF-D (р &л; 0,05) и п-МРМ был также положительно связан с VEGF-C /VEGF-D ( P ≪ 0,05).
Эффект рапамицина на MTOR пути и VEGF-C /-D
уровень белка Akt, п-Akt, МРМ, п-МРМ, VEGF-C и VEGF-D в ГЭК -7901 с рапамицином (100 нМ) ингибирование исследовали с помощью Вестерн-блоттинга. Среди них, п-МРМ, VEGF-C и экспрессия VEGF-D были снижены со временем пролонгации действия рапамицина (рис 3C). Был значительное различие в сравнении с группой без Рапамицине (р ≪ 0,05). Тем не менее, не было статистически значимых различий в Akt, п-Akt и МРМ (р > 0,05). При дальнейшем проведении анализа двойного отношение вариант, п-MTOR положительно коррелирует с VEGF-C и VEGF-D (р &л; 0,05).
Обсуждение
Akt /MTOR сигнального пути является важным внутриклеточного пути, который отвечает к цитокинами сигналов, и доказано, чтобы играть важную роль в росте клеток, метаболизма и апоптоза [12,13]. Akt /МРМ путь включает в различных патологических механизмов колоректального рака, рака желудка, рак печени, рак молочной железы и рак матки и т.д. [12-14]. Наше предыдущее исследование подтвердило, что п-Akt участвует в ангиогенезе аденокарциномы желудка и активации Akt может способствовать ангиогенеза с помощью VEGF-A повышающей регуляции [15]. В этом исследовании, положительные темпы окрашивания р-Akt и п-МРМ в 55 случаях рака желудка были 74,54% и 85,45% соответственно. Кроме того, п-Akt положительно коррелирует с п-МРМ (р &ЛТ; 0,01). Этот результат согласуется с предыдущими исследованиями и подтвердили значительную роль Akt /MTOR пути в развитии рака желудка. Клинический прогноз развития рака желудка предлагается также быть связан с Akt пути и пути VEGF. Например, Мураками и др.
Предположил, что прогноз у больных раком желудка без р-Akt выражение было всегда лучше, чем р-Akt положительных, и показатели выживаемости в течение 5 лет были 68% и 35% для пациентов с T3 или стадии Т4 опухоли, соответственно [16]. Кроме того, Akt ген, кодирующий PI3CA Каталог вверх по течению белка PI3K была связана с безрецидивной выживаемости [17]. Кроме того, Ван и др.
Показали, что VEGF-C, VEGF-D и LVD рака желудка были связаны с размером опухоли и общей выживаемости по данным исследования, в 123 случаях [18,19]. Корреляция между VEGF-C /LVD и прогноза при дифференцировки опухоли, Т стадии, метастаз узла лимфы, и отдаленные метастазы были также подтверждены [20]. Еще одно исследование дополнительно предложил использовать сочетание VEGF-C /-D и CA199 для прогнозирования лимфатическую метастазирование сосудов [21].
Учитывая, что Akt /MTOR путь и VEGF-C /-D играют жизненно важную роль в лимфатической метастазирования и прогноза , наше исследование направлено на изучение взаимосвязи между двумя путями и далее содействовать механизм лимфангиогенеза и метастазирования. По результатам окрашивания на месте
, п-Akt и п-МРМ в положительно коррелируют с VEGF-C и VEGF-D (р &ЛТ; 0,01). С точки зрения LVD, D2-40 уровень карциномы желудка и нормальных тканей были исследованы в то же время. LVD при раке желудка была в четыре раза выше, чем у нормальных тканей. К тому же, LVD была достоверно коррелировала с п-Akt, п-МРМ, VEGF-C и VEGF-D (р &л; 0,05). Следует отметить, что LVD, а также VEGF-C /-D был явно ниже у пациентов с отрицательным выражением р-Akt и п-МРМ, чем положительных. Он предположил, что как Akt /MTOR путь и путь VEGF участвует в лимфангиогенеза и лимфатического метастазирования сосудов при раке желудка. Аналогичные результаты были также подтверждены другими исследованиями. Ю. и др.
Предположил, что п-МРМ были очень совместимы с метастазов в лимфатических узлах и может быть независимым предиктором лимфатического метастазирования и прогноза рака желудка [22]. К тому же, Onogawa и др.
Показали, что VEGF-C был сильно коррелирует с лимфатической метастазирования по результатам исследования, проведенного в 140 случаях раннего рака желудка [23]. VEGF-C, а также VEGF-D также рассматривается как предсказатель лимфатического метастазирования у больных с ранним раком желудка [24]. В ходе исследования мы также подтвердили взаимосвязь Akt /МРМ, VEGF-C /-D и LVD при раке желудка на месте
в.
LY294002, как Akt ингибитор активации, подтверждается с эффектом противоопухолевой и способствовало апоптозу рака желудка в пробирке
и в естественных условиях
[25]. Рапамицин известен как ингибитор активации МРМ клинически используется для его эффекта противоопухолевой и иммуномодуляции [26]. Результаты нашего исследования еще раз подтвердили, что LY294002 и Рапамицин может эффективно ингибировать рост SGC-7901 клеток. Кроме того, LY294002 при 50 мкМ) и рапамицин при 100 нМ имел наиболее эффективную скорость ингибирования (52,53 ± 3,19)% и (48,72 ± 3,06)% в 24 ч. При продлении до 72 ч, скорости ингибирования (68,76 ± 1,00)% и (68,50 ± 3,77)% соответственно. Затем мы наблюдали влияние фосфорилирования ингибирования Akt и МРМ по лимфатическим факторов, VEGF-C и VEGF-D. Высокая концентрация LY294002 (50 мкМ) и рапамицином (100 нМ) использовали для исследования вмешательства. Согласно результатам, Рапамицин подавляли экспрессию р-МРМ и LY294002 эффективно ингибирует экспрессию р-Akt, а также п-МРМ. Следует отметить, что оба ингибитора может эффективно ингибировать экспрессию VEGF-C /-D. К тому же, понижающая регуляция п-Akt /п-МРМ показал высокую согласованность с, что СЭФР-C /-D. Поэтому был предложен Akt /MTOR путь тесно связан с VEGF-C /-D. Аналогичные результаты были также сообщалось ранее в других моделях опухолей. Например, Чжан и др.
Уменьшил рецептор инсулина короткого шпилька РНК в клеточных линиях рака, LCC6 и T47D. Пролиферация клеток, ангиогенез, лимфангиогенез и метастазирования также ингибируется вследствие понижающей регуляции п-Akt и инактивации VEGF-D [27]. Кроме того, ингибирование МРМ может подавлять экспрессию VEGF-C и эффективно уменьшить лимфангиогенез в поджелудочной мышиной модели рака [11]. В другом исследовании, VEGF-D была понижена гонокиол ингибировать лимфангиогенез из ксенотрансплантаты рака легких [28]. IL-6 может также регулировать VEGF-C на уровне мРНК через Akt /сигнализации MTOR пути, который эффективно снижал лимфангиогенез и метастазирование в полости рта плоскоклеточного рака [29].
Вывод изображения Уровень LVD в желудочном образцов рака был значительным выше, чем у нормальной желудочной ткани и положительно коррелирует с иммуногистохимического окрашивания р-Akt, п-МРМ, VEGF-C и VEGF-D. При ингибировании п-Akt и п-МРМ в пробирке, VEGF-C и VEGF-D также значительно уменьшились. Таким образом, мы полагаем, что лимфангиогенез рака желудка может быть эффективно модулируется через ось Akt /МРМ-VEGF-C /VEGF-D.
Notes
Hongxia Chen, Runnian Гуан, Yupeng Lei и Jianyong Чен способствовали в равной степени к этой работе .
Аббревиатура
LVD:
плотности сосудов лимфатической


декларациях
Acknowledgement
исследование было поддержано финансирование из Национального научного фонда грантов Китая ( No. 81160307); Цзянси Наука &Amp; Программа Столб технологии и научный фонд для молодых ученых провинции Цзянси (№ 2007GQY1167); . Voyage Проект Цзянсиский науки и технологии ассоциации
Конкурирующие интересы
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов взносов
Авторского
концепции Изучение и дизайн:. XZhou, HC; Сбор данных: HC, RG, HC; Анализ данных: Ю.Л., JC; Подготовка рукописи: QG, RD, XZhang; Рукопись редакция: XQ, HL, CC. Все авторы участвовали достаточно в исследовании и утвержден окончательный вариант.

• Бурсэктомия и не бурсэктомия D2 резекция распространенного рака желудка, начальный опыт из одного учреждения…
• Клинико-патологическими значение ядерного фактора (эритроидного-2) Фактор 2 о связанных выражение (Nrf2) при рак…