Lymphangiogenesis i Gastric Cancer regulert gjennom Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D axis

Lymphangiogenesis i Gastric Cancer regulert gjennom Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D aksen
Abstract
Bakgrunn
Lymphangiogenesis spiller en betydelig rolle i metastaser og tilbakefall av magekreft. Det er ingen rapport ennå fokus på modulering av VEGF sti og lymphangiogenesis av magekreft ved å målrette Akt /mTOR veien. Denne studien tar sikte på å vise sammenhengen mellom Akt /mTOR sti og VEGF-C /D i magekreft.
Metoder
Vi samles kirurgisk resected med adenokarsinom i prøver fra 55 samtykket pasienter. Immunhistokjemi farging av p-Akt, p-mTOR, VEGF-C, VEGF-D ble utført og avsluttet med to uavhengige patologer. Resultatene ble presentert som fargeintensitet og positiv farging celle rate. Vi målte også lymfekar tetthet (LVD) ved D2-40 farging. Forskjellige doser av p-Akt-inhibitor LY294002 (12,5 uM, 25 uM, 50 uM) og p-mTOR-inhibitor Rapamycin (25 nM, 50 nM, 100 nM) ble gitt til magekreft cellelinje SGC-7901 in vitro. Hemmingshastigheten av cellevekst ble testet ved MTT ved 24 h, 48 h og 72 h, henholdsvis og protein uttrykk av Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D ble undersøkt ved Western blot.
Resultater
Den positive flekker priser av p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D i 55 mage kreft kliniske prøver var 74,54%, 85,45%, 72,73% og 58,18%. p-Akt og p-mTOR var positivt korrelert med VEGF-C og VEGF-D (p < 0,01). Den LVD økt med inkrementell tendens til fargeintensitet p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D. LY294002 eller Rapamycin undertrykte betydelig SGC-7901 cellevekst og inhiberingshastigheten var dose og tidsavhengig (p < 0,001). I tillegg ble det protein ekspresjon av p-Akt og p-mTOR positivt korrelert med den av VEGF-C og VEGF-D (p 0,05).
Konklusjoner
nivået av LVD i magekreft prøvene var betydelig høyere enn den for normal gastrisk vev og er positivt korrelert med p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D. Hemning av p-Akt og p-mTOR, in vitro, redusert tumorcelle-VEGF-C og VEGF-D betraktelig. Derfor konkluderte vi med at lymphangiogenesis av magekreft kan være relatert til Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D aksen.
Nøkkelord
Lymphangiogenesis Magekreft Akt /mTOR VEGF Bakgrunn
Magekreft er en av de de vanligste ondartede svulster over hele verden [1-3]. Vanlige behandlingsstrategier for magekreft omfatter kirurgi, strålebehandling, kjemoterapi og målrettet terapi [4,5]. Behandlingssvikt inkluderer metastase og tilbakefall etter operasjon. De viktigste metastatiske veier magekreft er direkte invasjon, vaskulær metastase, lymfatisk metastaser og enterocoelia metastase [3]. Blant dem, er lymfesystemet metastase en stadig viktigere kriterium i å bedømme prognosen av magekreft og lymphangiogenesis er anerkjent som en signifikant prediktor for prognosen for pasienter med magekreft [1,2]. I tillegg er det magekreft lymfatiske metastasering antas å være en tidligere hendelse i forhold til vaskulær metastasering, som skjer selv i tidlig stadium magekreft [3,4]. Derfor International Union mot kreft tok lymphangiogenesis hastighet og metastase mengden av lymfeknute i iscenesettelsen av magekreft i å vurdere prognosen [2,5]. Dessuten, selv om lymphadenectomy og intraperitoneal kjemoterapi ble utført i løpet av lymfeknute negative progresjon, det førte også positiv effekt på forbedring av 5-års overlevelse av magekreft [5].
De to etablerte måter å tumorceller oppføring i lymprhatic system er invasjon av eksisterende lymfesystem og induksjon av lymphangiogenesis [3]. Den sistnevnte er ansett som den viktigste måte. I tillegg spiller lymphangiogenesis en avgjørende rolle i metastase, regelmessighet og prognose i begynnelsen av magekreft [4]. Således studier av lymphangiogenesis har en lovende virkning på behandlingen. VEGF-C og VEGF-D ble positivt relatert til solid svulst lymfatisk metastase, lymfekar tetthet (LVD) og dybden av tumorinvasjon og tilbakefall etter tidligere studier [6-8]. Dessuten er Akt /mTOR sti også involvert i reguleringen av lymphangiogenesis og lymfatiske metastase [9-11]. Derfor er forholdet mellom Akt /mTOR sti og VEGF trasé verdig til å bli belyst. Så vidt vi vet, er det ingen rapport ennå fokus på modulering av VEGF sti og lymphangiogenesis ved å målrette Akt /mTOR sti i magekreft. I denne studien ønsker vi å synliggjøre sammenhengen mellom Akt /mTOR sti og VEGF-C /D i magekreft.
Metoder
klinisk prøve
Kirurgisk reseksjon med adenokarsinom i prøvene ble samlet inn fra 55 pasienter med mage kreft fra april 2011 til november 2012. Alle av dem fikk ingen strålebehandling, kjemoterapi eller immunterapi før operasjonen. Studien ble godkjent av etisk komité av First Affiliated Hospital of Nanchang universitet og alle deltakerne ga skriftlig informert samtykke.
Immunohistochemistry
Alle vevsprøver ble fiksert med 10% formalin, rutinemessig i parafin, skåret i 4-mikrometer tykk som seriesnitt, avvoksede med xylen, rehydrering med en etanol-gradient og vasket med destillert vann. Antigen henting ble utført ved å senke deler i antigen gjenfinning buffer (0,5 M EDTA), og mikrobølgeovnen i 20 min. Seksjonene ble deretter behandlet med 3% hydrogenperoksydoppløsning. Prøvene ble blokkert med 5% normalt geiteserum og deretter inkubert over natten ved 4 ° C med primært antistoff: p-Akt (ser473) (kanin, 1: 100, Cell Signaling Technology, USA), p-mTOR (ser2448) ( kanin, 1: 200, Abcam, USA), VEGF-C (Goat, 1: 400, R & D, USA), VEGF-D (Mouse, 01:50, Santa Cruz, USA) og D2-40 (Mouse, 1: 100, ZSGB-BIO, Kina). Deretter ble det andre antistoff tilsatt, og prøvene ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur og ble deretter fremkalt med DAB. 5% normalt geiteserum ble anvendt som en negativ kontroll i stedet for det primære antistoff. Immunhistokjemi farging ble scoret av to uavhengige patologer. Resultatene ble presentert i form av fargeintensitet (+ /++ /+++) og positiv farging celle rate.
Lymfekar tetthet
Ifølge Masakau kriterier, D2-40 positiv farging (single endotelceller eller celle klynger) ble merket som positivt microlymphatic fartøy. Vaskulær rikt område i para-neoplastisk plassering og tumor sentrum ble definert og 5 felt av "hot spots" ble tilfeldig medregnes under høy forstørrelse (× 400). Den gjennomsnittlige ble regnet som den LVD.
Cell overlevelses
Tre forskjellige doser (12,5 mikrometer, 25 mikrometer, 50 um) av Akt aktivering inhibitor LY294002 (Sigma) eller mTOR aktivering inhibitor (25 nM, 50 nM, 100 nM ) Rapamycin (Sigma) ble gitt til magekreft cellelinje SGC-7901. Hemmingshastigheten av cellevekst ble testet ved MTT-analysen ved 24 timer, 48 timer og 72 timer henholdsvis.
Western blot
SGC-7901-celler ble homogenisert i RIPA lysebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.4 , 150 mM NaCl, 600 mM NP-40, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 1 mM natriumfluorid, og 1 mM natrium ortovanadat) og satt på is i 2 timer. Proteinkonsentrasjonen av hver prøve ble bestemt ved Bio-Rad Protein Assay kit (Bio-Rad, Laboratories, Hercules, CA, USA) i henhold til den instruksjon av produsenten. Lysater inneholdende 50 ug protein ble separert ved SDS-PAGE og deretter overført til nitrocellulosemembraner. Ikke-spesifikke reaksjoner ble blokkert i 4 timer med TBS-T (50 mM Tris * HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) som inneholdt 5% ikke-fettholdig tørrmelk. Deretter ble membranene inkubert over natten ved 4 ° C med primær antistoff: Akt (Mouse, 1: 2000, Cell Signaling Technology, USA), p-Akt (ser473) (kanin, 1: 2000, Cell Signaling Technology, USA), mTOR ( kanin, 1: 1000, Cell Signaling Technology, USA), p-mTOR (ser2448) (kanin, 1: 3000, Abcam, USA), VEGF-C (Goat, 1: 1000, R & D, USA) og VEGF- D (Mouse, 1: 500, Santa Cruz, USA). Etter å ha blitt vasket med TBS-T inneholdende ikke-fet tørrmelk, ble membranene inkubert med pepperrotperoksydase-konjugert sekundært antistoff. Protein blotter ble visualisert ved chemiluminescence hjelp ECL (Amersham).
Statistisk analyse
uavhengige utvalg T test mellom to grupper og enkeltfaktoren variansanalyse (ANOVA) for multiple sammenligninger ble benyttet når dataene i samsvar med normalfordeling og homogeniteten av varians. Ellers ble Mann-Whitney test mellom to grupper og Kruskal-Wallis test blant multi-grupper gjennomført. Spearman-analyse ble anvendt for å måle korrelasjon av måling og telle data. Statistiske analyser ble utført ved SPSS17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). En p-verdi på < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Uttrykk for p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D in situ Bedrifter Den immunhistokjemi stainings av p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D i 55 magekreft kliniske prøver ble vist (figur 1). Den positive farging presenteres for det meste i cytoplasma og noen atom farget i p-Akt og p-mTOR. Positivitet priser av p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D var henholdsvis 74,54%, 85,45%, 72,73% og 58,18%. Kvantifisering av fargeintensitet ble vist i tabell 1. Figur 1 Immunhistokjemi farging av p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D i magekreft prøven (x 400). A: p-Akt, B: p-mTOR, C: VEGF-C, D: VEGF-D, E: Sammenhengen mellom p-Akt og p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D
Tabell 1. immunhistokjemi farging av p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D i magekreft prøver Book Intensitet (n)
Positive rate (%)
- product: +
++

p-Akt
14
29
12
74.54
p-mTOR
8
21
26
85.45
VEGF-C
15
22
18
72.73
VEGF-D
23
27
5
58.18
Korrelasjonene av p-Akt og p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D, p-mTOR og VEGF-C /VEGF-D ble videre analysert. p-Akt ekspresjon var positivt korrelert med p-mTOR (p = 0,001), VEGF-C (p = 0,002) og VEGF-D (p = 0,009) (figur 1E). Dessuten, p-mTOR var også signifikant positiv relatert til VEGF-C (p < 0,001). Og VEGF-D (p = 0,003)
lymfatiske kar tetthet
D2-40 farging ble anvendt for å beregne den LVD for magekreft (figur 2A) og matchet normal mage vev (figur 2B). Ifølge resultatene, D2-40 farget hovedsakelig i lymfatisk endotel i spredt eller gruppert distribusjon. Thin lymfatisk åreveggen manglet basal laget. Den høyeste LVD ble observert på kanten av tumor med en tett klynge-lignende morfologi. I tillegg ble D2-40 uttrykt i submukosa av normalt vev, med en svakere uttrykk i slimhinnen eller muskellaget, såvel. Den gjennomsnittlige LVD av magekreft og normalt vev var 94,18 ± 72,965 vs 23.31 ± 21.569 nummer /5 høye kraft felt, p < 0,001. Figur 2 Immunohistokjemi farging av D2-40 for LVD (× 400). A: Magekreft vev, B: matchede normalt vev, C: Sammenhengen mellom LVD og p-Akt /p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D. . LVD = lymfekar tetthet
LVD var positivt korrelert med p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D uttrykk per Spearman analyse (p < 0,05). LVD økt med inkrementell tendens til fargeintensitet p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D (Figur 2C).
Effekter av LY294002 og Rapamycin på SGC-7901 cellevekst
SGC-7901 cellene ble dyrket med tre forskjellige doseringer av LY294002 i 24 timer, 48 timer og 72 timer. Ifølge MTT analysen ble SGC-7901 cellevekst dempet og inhiberingshastigheten var signifikant korrelert med LY294002 dosering og handling tid (p < 0,001) (figur 3A). Figur 3 Hemming av p-Akt og p-mTOR i SGC-7901 celler ved LY294002 og Rapamycin. A: SGC-7901 cellevekst med intervensjon av ulike tidspunkt og dosering av LY294002, B: SGC-7901 cellevekst med intervensjon av ulike tidspunkt og dosering av Rapamycin, C: Effekt av LY294002 (50 mm) og Rapamycin (100 nM ) på Akt /mTOR sti og VEGF-C /D ved Western blot.
Dessuten celler ble også dyrket med forskjellige doseringer av rapamycin for 24 timer, 48 timer og 72 timer henholdsvis. Hemming frekvensen av SGC-7901 ble også signifikant korrelert med enten Rapamycin dosering eller handling tid (p < 0,001) (figur 3B). Derfor kan både LY294002 og Rapamycin hemme veksten av SGC-7901 i enten tidsavhengig eller doseavhengig måte.
Effekt av LY294002 på Akt /mTOR sti og VEGF-C /D
proteinnivå Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D i SGC-7901 med LY294002 (50 mm) hemming ble undersøkt med Western blot. Blant dem, ble p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D gradvis redusert med en forlengelse handlingstid av LY294002 (figur 3C). Det var en signifikant forskjell sammenlignet med gruppen uten LY294002 (p < 0,05). Imidlertid var det ingen statistisk forskjell for Akt og mTOR (p 0,05). Ved videre å gjennomføre en dobbelt variant forhold analyse ble p-Akt positivt korrelert med p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D (p 0,05) og p-mTOR ble også positivt relatert til VEGF-C /VEGF-D ( p. < 0,05)
Effekt av Rapamycin på mTOR sti og VEGF-C /D
protein nivået av Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D i SGC -7901 med Rapamycin (100 nM) hemming ble undersøkt med Western blot. Blant dem, ble p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D-ekspresjon ble redusert med en forlengelse handlingstid av Rapamycin (figur 3C). Det var en signifikant forskjell sammenlignet med gruppen uten Rapamycin (p < 0,05). Imidlertid var det ingen statistisk forskjell for Akt, p-Akt og mTOR (p 0,05). Ved videre å gjennomføre en dobbel variant forhold analyse, ble p-mTOR positivt korrelert med VEGF-C og VEGF-D (p < 0,05).
Diskusjon
Akt /mTOR signalveien er en viktig intracellulær vei, som responderer til cytokinproduksjon signaler, og viste seg å spille en viktig rolle i cellevekst, metabolisme og apoptose [12,13]. Akt /mTOR sti innebærer i ulike patologiske mekanismer for tykktarmskreft, magekreft, leverkreft, brystkreft og livmorkreft etc. [12-14]. Vår tidligere studie bekreftet at p-Akt involvert i angiogenese av adenokarsinom i ventrikkel og Akt aktivering kan bidra til angiogenese via VEGF-A oppregulering [15]. I denne studien positive flekker priser av p-Akt og p-mTOR i 55 tilfeller av magekreft var henholdsvis 74,54% og 85,45%. Dessuten, p-Akt ble positivt korrelert med p-mTOR (p < 0,01). Dette resultatet var i overensstemmelse med tidligere studier og bekreftet den betydelige rolle Akt /mTOR banen i magekreft. Den kliniske prognosen for magekreft er også foreslått å være assosiert med Akt bane og VEGF pathway. For eksempel, Murakami et al.
Antydet at prognosen av magekreftpasienter uten p-Akt uttrykk var alltid bedre enn p-Akt positive, og de fem-års overlevelse var 68% og 35% for pasienter med T3 eller T4 scenen svulster, henholdsvis [16]. Dessuten ble det Akt kodende gen PI3CA
av oppstrøms protein forbundet med PI3K sykdomsfri overlevelse [17]. I tillegg Wang et al.
Indikerte at VEGF-C, VEGF-D og LVD av magekreft var knyttet til tumorstørrelse og total overlevelse ifølge en studie i 123 tilfeller [18,19]. Korrelasjonen mellom VEGF-C /LVD og prognose i tumor differensiering, T scenen, lymfeknutemetastase, og fjernmetastaser ble også bekreftet [20]. En annen studie videre foreslått å bruke en kombinasjon av VEGF-C /D og CA199 å forutsi lymfekar metastase [21].
Gitt at Akt /mTOR sti og VEGF-C /-D spiller en viktig rolle i lymfesystemet metastaser og prognose som mål vår studie for å utforske forholdet mellom to stier og fremme mekanismen av lymphangiogenesis og metastasering. I henhold til resultatene av flekker in situ
, p-Akt og p-mTOR var positivt korrelert med VEGF-C og VEGF-D (p 0,01). I form av LVD, ble D2-40 nivå av magekreft og normale vev undersøkt samtidig. LVD i magekreft var fire ganger høyere enn for normalt vev. Dessuten LVD var signifikant korrelert med p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D (p < 0,05). Spesielt, LVD samt VEGF-C /D var åpenbart lavere hos pasienter med negativ uttrykk for p-Akt og p-mTOR enn positive. Det foreslås at både Akt /mTOR sti og VEGF sti involvert i lymphangiogenesis og lymfekar metastase i magekreft. Lignende resultater ble også bekreftet av andre studier. Yu et al.
Antydet at p-mTOR var svært konsistente med lymfeknutemetastase, og kan være en uavhengig prediktor for lymfatisk metastaser og prognose for magekreft [22]. Dessuten Onogawa et al.
Indikerte at VEGF-C var høyt korrelert med lymfatisk metastaser ifølge en studie utført i 140 tilfeller av tidlig magekreft [23]. VEGF-C samt VEGF-D ble også ansett som en prediktor for lymfatisk metastaser hos pasienter med tidlig magekreft [24]. I studien vi ytterligere bekreftet forholdet mellom Akt /mTOR, VEGF-C /D og LVD i magekreft in situ
.
LY294002, som en Akt aktiverings inhibitor, er bekreftet med anti-tumoreffekt og fremmet apoptose av magekreft in vitro Hotell og in vivo product: [25]. Rapamycin er kjent som en mTOR-inhibitor aktiverings blir klinisk anvendt for sin anti-tumoreffekt og immunmodulering [26]. Resultatene fra vår studie ytterligere bekreftet at LY294002 og Rapamycin kan effektivt hemme veksten av SGC-7901 celler. Dessuten, LY294002 ved 50 uM) og Rapamycin ved 100 nM hadde den mest effektive inhibering hastighet (52,53 ± 3,19)% og (48,72 ± 3,06)% ved 24 timer. Når forlenge til 72 timer, de hemming ratene var henholdsvis (68,76 ± 1,00)% og (68,50 ± 3,77)%. Deretter, observerte vi påvirkning av fosforylering inhibering av Akt og mTOR på lymfatiske faktorer, VEGF-C og VEGF-D. Høy konsentrasjon av LY294002 (50 uM) og Rapamycin (100 nM) ble anvendt for intervensjonsstudie. Ifølge resultatene, Rapamycin undertrykket ekspresjon av p-mTOR og LY294002 effektivt hemmet ekspresjon av p-Akt, så vel som p-mTOR. Det skal bemerkes at begge inhibitorer kan effektivt inhiberer ekspresjonen av VEGF-C /D. Dessuten nedregulering av p-Akt /p-mTOR viste en høy konsistens med den av VEGF-C /D. Derfor Akt /mTOR veien ble foreslått til å være nært knyttet til VEGF-C /D. De tilsvarende resultater ble også tidligere rapportert i andre tumormodeller. For eksempel, redusert Zhang et al.
Insulinreseptoren etter kort hårnål RNA i kreftcellelinjer, LCC6 og T47D. Den celleproliferasjon, angiogenese, metastase og lymphangiogenesis ble også hemmet på grunn av den nedregulering av p-Akt og inaktivering av VEGF-D [27]. Dessuten kan mTOR hemming undertrykke ekspresjonen av VEGF-C og effektivt redusere lymphangiogenesis i bukspyttkjertelkreft musemodell [11]. I en annen studie ble VEGF-D degradert ved Honokiol å inhibere lymphangiogenesis av lungekreft xenograft [28]. IL-6 kan også regulere VEGF-C på mRNA nivå gjennom Akt /mTOR signalveien, som effektivt redusert lymphangiogenesis og metastase i muntlig plateepitelkarsinom [29].
Konklusjon
nivået av LVD i magekreftprøver var signifikant høyere enn for normal gastrisk vev og positivt korrelert med immunhistokjemisk farging av p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D. Ved inhibering av p-Akt og p-mTOR in vitro, VEGF-C og VEGF-D ble også betydelig redusert. Derfor foreslår vi at lymphangiogenesis av magekreft kan være effektivt moduleres gjennom Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D aksen
. Merknader
Hongxia Chen, Runnian Guan, Yu Peng Lei og Jianyong Chen bidratt likt til dette arbeidet .
forkortelse
LVD:
lymfekar tetthet
Erklæringer
Erkjennelse
studien ble støttet av midler fra National Science Foundation Grants of China ( Nei. 81160307); Jiangxi Science & Teknologi Pillar Program og Science Foundation for unge forskere i Jiangxi-provinsen (nr 2007GQY1167); . Voyage Prosjekt i Jiangxi-provinsen Science and Technology Association
konkurrerende interesser
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende interesser bidrag
Forfatternes Studie konsepter og design. XZhou, HC; Datainnsamling: HC, RG, HC; Dataanalyse: YL, JC; Manuskript under utarbeidelse: QG, RD, XZhang; Manuscript revisjon: XQ, HL, CC. Alle forfattere har deltatt tilstrekkelig i studien og godkjent den endelige versjonen.

• Bursectomy og ikke-bursectomy D2 gastrektomi for avansert magekreft, innledende erfaring fra en enkelt institusjon i Kina
• Clinicopathological betydningen av kjernefysiske faktor (erytropoide-2) -relaterte faktor 2 (Nrf2) uttrykk i magekreft