Lymfangiogenese i Gastric Cancer reguleret gennem Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D-aksen

Lymfangiogenese i Gastric Cancer reguleret gennem Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D-aksen
Abstract
Baggrund
lymphangiogenese spiller en væsentlig rolle i metastase og tilbagefald af mavekræft. Der er ingen rapport endnu fokuserer på graduering af VEGF vej og lymfangiogenese af gastrisk kræft ved at målrette Akt /mTOR pathway. Denne undersøgelse har til formål at demonstrere forholdet mellem Akt /mTOR pathway og VEGF-C /D i mavekræft.
Metoder
Vi indsamlede kirurgisk resektion gastrisk adenocarcinom prøver fra 55 samtykket patienter. Immunhistokemi farvning af p-Akt, p-mTOR, VEGF-C, VEGF-D blev udført og afsluttet af to uafhængige patologer. Resultaterne blev præsenteret som farvningsintensitet og positiv farvning cellerate. Vi målte også lymfekar densitet (LVD) med D2-40 farvning. Forskellige doseringer af p-Akt inhibitor LY294002 (12,5 uM, 25 um, 50 um) og p-mTOR inhibitor Rapamycin (25 nM, 50 nM, 100 nM) blev givet til gastrisk cancercellelinie SGC-7901 in vitro. Hæmningen rate af cellevækst blev testet af MTT på 24 timer, 48 timer og 72 timer henholdsvis og protein udtryk i Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D blev undersøgt ved Western blot.
Resultater Salg The positiv farvning satser for p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D i 55 gastrisk kræft kliniske prøver var 74,54%, 85,45%, 72,73% og 58,18%. p-Akt og p-mTOR var positivt korreleret med VEGF-C og VEGF-D (p < 0,01). LVD steg med inkremental tendens farvningsintensitet af p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D. LY294002 eller Rapamycin undertrykt væsentligt SGC-7901 cellevækst og hæmning lå dosis og tidsafhængig (p < 0,001). Desuden blev proteinet ekspression af p-Akt og p-mTOR positivt korreleret med den af ​​VEGF-C og VEGF-D (p < 0,05).
Konklusioner
Niveauet af LSD i gastrisk cancer prøver blev signifikant højere end den for den normale gastriske væv og var positivt korreleret med p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D. Inhibering af p-Akt og p-mTOR, in vitro, nedsat tumorcelle VEGF-C og VEGF-D betydeligt. Vi konkluderede derfor, at lymfangiogenese af mavekræft kan være relateret til Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D-aksen.
Nøgleord
lymphangiogenese mavekræft Akt /mTOR VEGF Baggrund
mavekræft er en af ​​de mest almindelige maligne neoplasmer verdensplan [1-3]. Fælles behandlingsstrategier for mavekræft omfatter kirurgi, strålebehandling, kemoterapi og målrettet terapi [4,5]. Behandling fiaskoer omfatter metastase og tilbagefald efter operation. De vigtigste metastatiske ruter af mavekræft er direkte invasion, vaskulær metastase, lymfe metastase og enterocoelia metastase [3]. Blandt dem, lymfe metastase er en stadig vigtigere kriterium for vurderingen af ​​prognosen af ​​gastrisk karcinom og lymfangiogenese er anerkendt som en væsentlig prædiktor for prognosen for patienter med mavekræft [1,2]. Desuden er mavecancer lymfatiske metastaser menes at være en tidligere begivenhed sammenlignet med vaskulær metastase, sker også i den tidlige fase gastrisk cancer [3,4]. Derfor Den Internationale Union mod Kræft tog lymfangiogenese sats og metastaser mængden af ​​lymfeknuderne i iscenesættelsen af ​​mavekræft i evalueringen af ​​prognosen [2,5]. Desuden, selv om lymphadenectomy og intraperitoneal kemoterapi blev udført under lymfeknude negativ progression, det bragte også den positive effekt på forbedring af 5-års overlevelsesraten for mavekræft [5].
De to etablerede måder at indrejse tumorceller i lymprhatic systemet er invasion af eksisterende lymfekar og induktion af lymfangiogenese [3]. Sidstnævnte betragtes som væsentlig måde. Desuden lymfangiogenese spiller en afgørende rolle i metastase, gentagelse og prognose i begyndelsen af ​​gastrisk kræft [4]. Således studier af lymfangiogenese har en lovende effekt på behandlingen. VEGF-C og VEGF-D var positivt relateret til solid tumor lymfe metastase, lymfekar densitet (LVD) og dybden af ​​tumor invasion og tilbagefald efter tidligere undersøgelser [6-8]. Desuden er Akt /mTOR pathway også involveret i reguleringen af ​​lymphangiogenese og lymfe metastaser [9-11]. Derfor er forholdet mellem Akt /mTOR pathway og VEGF veje er værdig til at blive belyst. Til vores viden, er der ingen rapport endnu fokuserer på graduering af VEGF vej og lymfangiogenese ved at målrette Akt /mTOR pathway i mavekræft. I denne undersøgelse, vi sigter mod at demonstrere forholdet mellem Akt /mTOR pathway og VEGF-C /D i mavekræft.
Metoder
Kliniske eksemplar
Kirurgisk resektion gastrisk adenocarcinom prøver blev indsamlet fra 55 patienter med gastrisk kræft fra april 2011 til november 2012 Alle af dem modtog ingen strålebehandling, kemoterapi eller immunterapi før operationen. Undersøgelsen blev godkendt af etiske udvalg af First Affiliated Hospital i Nanchang Universitet og alle deltagere gav skriftligt informeret samtykke.
Immunhistokemi
Alle vævsprøver blev fikseret med 10% formalin, rutinemæssigt indlejret i paraffin, skåret i 4-um tyk som serielle snit, afvoksede med xylen, rehydrering med en ethanol-gradient og vasket med destilleret vand. Antigen genfinding blev udført ved nedsænkning sektioner i antigene hentning puffer (0,5 M EDTA), og microwaving i 20 min. Snit blev derefter behandlet med 3% hydrogenperoxid-opløsning. Prøverne blev blokeret med 5% normalt gedeserum og derefter inkuberet natten over ved 4 ° C med det primære antistof: p-Akt (Ser473) (Rabbit, 1: 100, Cell Signaling Technology, USA), p-mTOR (ser2448) ( kanin, 1: 200, Abcam, USA), VEGF-C (Goat, 1: 400, R &D, USA), VEGF-D (Mouse, 1:50, Santa Cruz, USA) og D2-40 (Mouse, 1: 100, ZSGB-BIO, Kina). Derefter blev andet antistof tilsat, og prøverne blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur og derefter fremkaldt med DAB. 5% normalt gedeserum blev anvendt som en negativ kontrol i stedet for det primære antistof. Immunhistokemi farvning blev scoret af to uafhængige patologer. Resultater blev præsenteret i form af farvningsintensitet (+ /++ /+++) og positiv farvning cellerate.
Lymfekar densitet
Ifølge Masakau kriterier, D2-40 positiv farvning (enkelt endotelcelle eller celle klynger) blev markeret som positiv microlymphatic fartøj. Det vaskulære-rigt område i para-neoplastisk placering og tumor center blev defineret og 5 områder af "hot spots" blev tilfældigt talt under stor forstørrelse (× 400). Den gennemsnitlige blev regnet som LSD.
Cell overlevelse
Tre forskellige doseringer (12,5 uM, 25 uM, 50 uM) af Akt aktivering inhibitor LY294002 (Sigma) eller mTOR aktivering inhibitor (25 nM, 50 nM, 100 nM ) Rapamycin (Sigma) blev givet til gastrisk cancercellelinie SGC-7901. Inhiberingsgraden af ​​cellevækst blev testet ved MTT-assay efter 24 timer, 48 timer og 72 t.
Western blot
SGC-7901-celler blev homogeniseret i RIPA-lysepuffer (10 mM Tris-HCI, pH 7,4 , 150 mM NaCl, 600 mM NP-40, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mM natriumfluorid, og 1 mM natriumorthovanadat) og anbragt på is i 2 timer. Proteinkoncentrationen af ​​hver prøve blev bestemt ved Bio-Rad Protein Assay kit (Bio-Rad, Laboratories, Hercules, CA, USA) i overensstemmelse med instruktion af fabrikanten. Lysater indeholdende 50 ug protein blev separeret ved SDS-PAGE og derefter overført til nitrocellulosemembraner. Uspecifikke reaktioner blev blokeret i 4 timer med TBS-T (50 mM Tris.HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) indeholdende 5% fedtfri tørmælk. Derefter membraner blev inkuberet natten over ved 4 ° C med primært antistof: Akt (Mouse, 1: 2000, Cell Signaling Technology, USA), p-Akt (Ser473) (Rabbit, 1: 2000, Cell Signaling Technology, USA), mTOR ( kanin, 1: 1000, Cell Signaling Technology, USA), p-mTOR (ser2448) (kanin, 1: 3000, Abcam, USA), VEGF-C (Goat, 1: 1000, R &D, USA) og VEGF- D (Mouse, 1: 500, Santa Cruz, USA). Efter at være blevet vasket med TBS-T indeholdende fedtfri tørmælk blev membranerne inkuberet med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer. De protein blot blev visualiseret ved chemiluminescens hjælp ECL (Amersham).
Statistisk analyse
Uafhængige prøver T-test mellem to grupper og enkelt faktor variansanalyse (ANOVA) til flere sammenligninger udnyttes, når dataene i overensstemmelse med normalfordeling og varianshomogenitet. Ellers blev Mann-Whitney-test mellem to grupper og Kruskal-Wallis test blandt multi-grupper gennemføres. Spearman-analyse blev anvendt til at måle korrelationen af ​​målinger og tælledata. Statistiske analyser blev udført ved SPSS17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). En p-værdi på < 0.05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Resultater
Ekspression af p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D in situ
Den immunhistokemiske farvninger af p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D i 55 gastriske cancer kliniske prøver blev vist (figur 1). Den positive farvning præsenteret for det meste i cytoplasma og et par nukleare farves i p-Akt og p-mTOR. De positivitet satser p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D var 74,54%, 85,45%, 72,73% og 58,18% hhv. Kvantificeringen af ​​farvningsintensitet blev vist i tabel 1. Figur 1 Immunhistokemi farvning af p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D i gastrisk cancer prøve (× 400). A: p-Akt, B: p-mTOR, C: VEGF-C, D: VEGF-D, E: Sammenhængen mellem p-Akt og p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D
tabel 1. immunhistokemi farvning af p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D i mavekræft prøver
Intensitet (n)
Positiv sats (%)
-
+
++

p-Akt
14
29
12
74.54
p-mTOR
8
21
26
85.45
VEGF-C
15
22
18
72.73
VEGF-D
23
27
5
58.18
blev analyseret yderligere De korrelationer af p-Akt og p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D, p-mTOR og VEGF-C /VEGF-D. p-Akt ekspression blev positivt korreleret med p-mTOR (p = 0,001), VEGF-C (p = 0,002) og VEGF-D (p = 0,009) (figur 1E). Desuden, p-mTOR var også signifikant positiv relateret til VEGF-C (p < 0,001). Og VEGF-D (p = 0,003)
lymfekar densitet
D2-40 farvning blev anvendt til at beregne LVD for gastrisk cancer (figur 2A) og matches normal gastrisk væv (figur 2B). Ifølge resultaterne, D2-40 farves hovedsagelig i lymfatisk endotel i spredt eller grupperet fordeling. Tynde lymfekar væg manglede basale lag. Den højeste LVD blev observeret på kanten af ​​tumoren med en tæt klynge-lignende morfologi. Desuden blev D2-40 udtrykt i submucosa af normalt væv, med en svagere ekspression i slimhinden eller muskel laget. Den gennemsnitlige LVD af gastrisk karcinom og normale væv var 94,18 ± 72,965 vs 23.31 ± 21.569 antal /5 høj effekt felter, s < 0,001. Figur 2 Immunhistokemi farvning af D2-40 for LSD (× 400). A: Gastric kræftvæv, B: Matchet normalt væv, C: Sammenhængen mellem LSD og p-Akt /p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D. . LVD = lymfe fartøj tæthed
LVD var positivt korreleret med p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D-ekspression pr Spearman analyse (p < 0,05). LVD steg med den trinvise tendens farvningsintensitet af p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D (figur 2C).
Virkninger af LY294002 og rapamycin på SGC-7901 cellevækst
SGC-7901 celler blev dyrket med tre forskellige doser af LY294002 i 24 timer, 48 timer og 72 timer. Ifølge MTT assay blev SGC-7901 cellevækst bremses, og inhiberingen var signifikant korreleret med LY294002 dosering og handling tid (p < 0,001) (figur 3A). Figur 3 Inhibering af p-Akt og p-mTOR i SGC-7901-celler ved LY294002 og rapamycin. A: SGC-7901 cellevækst med intervention forskellige tidspunkter og doser af LY294002, B: SGC-7901 cellevækst med intervention forskellige tidspunkter og doser af Rapamycin, C: Effekt af LY294002 (50 uM) og Rapamycin (100 nM ) på Akt /mTOR pathway og VEGF-C /D ved Western blot.
desuden blev celler også dyrket med forskellige doseringer af rapamycin i 24 timer, 48 timer og 72 timer henholdsvis. Inhiberingen på SGC-7901 var også signifikant korreleret med enten Rapamycin dosering eller handling tid (p < 0,001) (figur 3B). Derfor kunne både LY294002 og Rapamycin inhiberer væksten af ​​SGC-7901 i enten tidsafhængig eller dosisafhængig måde.
Effekt af LY294002 på Akt /mTOR pathway og VEGF-C /D
protein niveau Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D i SGC-7901 med LY294002 (50 uM) hæmning blev undersøgt ved Western blot. Blandt dem, blev p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D gradvist aftog med forlængelsen handling cirka LY294002 (figur 3C). Der var en signifikant forskel sammenlignet med gruppen uden LY294002 (p < 0,05). Der var imidlertid ingen statistisk forskel for Akt og mTOR (p 0,05). Ved yderligere at foretage en dobbelt variant relation analyse blev p-Akt positivt korreleret med p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D (p < 0,05) og p-mTOR blev også positivt forbundet med VEGF-C /VEGF-D ( p. < 0,05)
Effekt af Rapamycin på mTOR pathway og VEGF-C /D
proteinniveau af Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D i SGC -7901 med Rapamycin (100 nM) hæmning blev undersøgt ved Western blot. Blandt dem, blev p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D-ekspression faldt med forlængelsen handling cirka rapamycin (figur 3C). Der var en signifikant forskel sammenlignet med gruppen uden Rapamycin (p < 0,05). Der var imidlertid ingen statistisk forskel for Akt, p-Akt og mTOR (p 0,05). Ved yderligere at foretage en dobbelt variant relation analyse blev p-mTOR positivt korreleret med VEGF-C og VEGF-D (p < 0,05).
Diskussion
Akt /mTOR-signalvejen er en vigtig intracellulær vej, som reagerer cytokin signaler, og har vist sig at spille en vigtig rolle i cellevækst, metabolisme og apoptose [12,13]. Akt /mTOR pathway involverer i forskellige patologiske mekanismer i kolorektal cancer, mavekræft, leverkræft, brystkræft og livmoderkræft mv [12-14]. Vores tidligere undersøgelse bekræftede, at p-Akt involveret i angiogenese af gastrisk adenocarcinom og Akt aktivering kan bidrage til angiogenese via VEGF-A opregulering [15]. I denne undersøgelse, de positive farvning satser p-Akt og p-mTOR i 55 tilfælde af mavekræft var 74,54% og 85,45% hhv. Desuden blev p-Akt positivt korreleret med p-mTOR (p < 0,01). Dette resultat var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser og bekræftet den betydelige rolle af Akt /mTOR pathway i mavekræft. Det foreslås også kliniske prognose for mavekræft at være forbundet med Akt pathway og VEGF vej. For eksempel Murakami et al.
Foreslog, at prognosen for mavecancerpatienter uden p-Akt udtryk var altid bedre end p-Akt positive, og de 5-årige overlevelsesrater var 68% og 35% for patienter med T3 eller T4 fase tumorer, henholdsvis [16]. Desuden blev den Akt kodning gen PI3CA
af opstrøms protein PI3K associeret med sygdomsfri overlevelse [17]. Desuden Wang et al.
Viste, at VEGF-C, VEGF-D og LVD af mavekræft var relateret til tumor størrelse og samlet overlevelse ifølge en undersøgelse i 123 tilfælde [18,19]. Korrelationen mellem VEGF-C /LVD og prognose i tumor differentiering, T stadium lymfeknudemetastase, og fjernmetastase blev også bekræftet [20]. En anden undersøgelse yderligere foreslog at bruge en kombination af VEGF-C /D og CA199 at forudsige lymfekar metastaser [21].
Betragtning af, at Akt /mTOR pathway og VEGF-C /-D spille en afgørende rolle i lymfe metastase og prognose vores undersøgelse har til formål at undersøge forholdet mellem to veje og yderligere fremme den mekanisme af lymphangiogenese og metastase. Ifølge resultaterne af farvning in situ
, p-Akt og p-mTOR var positivt korreleret med VEGF-C og VEGF-D (p < 0,01). Med hensyn til LVD blev D2-40 niveau af gastrisk carcinom og normale væv undersøges samtidigt. LVD i gastrisk kræft var fire gange højere end for normalt væv. Desuden, LVD var signifikant korreleret med p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D (p < 0,05). Især LVD samt VEGF-C /D var tydeligvis lavere hos patienter med negativ udtryk for p-Akt og p-mTOR end positive. Det foreslås, at både Akt /mTOR pathway og VEGF pathway involveret i lymphangiogenese og lymfe fartøj metastase i mavekræft. Lignende resultater blev også bekræftet af andre undersøgelser. Yu et al.
Foreslog, at p-mTOR var meget overens med lymfeknude metastaser og kunne være en uafhængig prædiktor af lymfatisk metastaser og prognose af mavekræft [22]. Desuden Onogawa et al.
Viste, at VEGF-C blev stærkt korreleret med lymfatisk metastaser ifølge en undersøgelse foretaget i 140 tilfælde af tidlig mavekræft [23]. VEGF-C samt VEGF-D blev også betragtet som en forudsiger af lymfatisk metastaser i patienter med tidlig gastrisk cancer [24]. I undersøgelsen, vi yderligere bekræftet sammenhængen af ​​Akt /mTOR, VEGF-C /D og LVD gastrisk cancer in situ
.
LY294002, som en Akt aktivering hæmmer, bekræftes med anti-tumor effekt og fremmet apoptose af gastrisk cancer in vitro
og in vivo
[25]. Rapamycin kendt som en mTOR aktivering inhibitor anvendes klinisk for sin antitumorvirkning og immunmodulation [26]. Resultaterne af vores undersøgelse yderligere bekræftet, at LY294002 og Rapamycin effektivt kunne hæmme væksten af ​​SGC-7901 celler. Desuden, LY294002 på 50 uM) og rapamycin ved 100 nM havde den mest effektiv inhibering på (52.53 ± 3.19)% og (48,72 ± 3,06)% ved 24 timer. Når forlængelse til 72 timer, de hæmning satser var (68,76 ± 1,00)% og (68,50 ± 3,77)% hhv. Derefter observerede vi indflydelsen af ​​phosphorylering hæmning af Akt og mTOR på lymfatiske faktorer, VEGF-C og VEGF-D. Høj koncentration af LY294002 (50 uM) og rapamycin (100 nM) blev anvendt til interventionsstudie. Ifølge resultaterne, Rapamycin undertrykt ekspression af p-mTOR og LY294002 inhiberede ekspressionen af ​​p-Akt samt p-mTOR effektivt. Det bemærkes, at begge inhibitorer effektivt kunne inhibere ekspressionen af ​​VEGF-C /D. Desuden er nedregulering af p-Akt /p-mTOR viste en høj konsistens med den af ​​VEGF-C /D. Derfor blev Akt /mTOR pathway foreslås nært beslægtet med VEGF-C /D. De tilsvarende resultater blev også tidligere rapporteret i andre tumormodeller. For eksempel, Zhang et al.
Faldt insulinreceptoren ved kort hårnål RNA i cancer-cellelinjer, LCC6 og T47D. Celleproliferationen, angiogenese, lymfangiogenese og metastase blev også inhiberet på grund af nedregulering af p-Akt og inaktivering af VEGF-D [27]. Desuden kunne mTOR inhibering undertrykke ekspressionen af ​​VEGF-C og effektivt at reducere lymfangiogenese i bugspytkirtelkræft musemodel [11]. I en anden undersøgelse blev VEGF-D nedbrydes af honokiol at inhibere lymfangiogenese af lungecancer xenograft [28]. IL-6 kunne også regulere VEGF-C på mRNA-niveau gennem Akt /mTOR-signalvejen, som effektivt faldt lymfangiogenese og metastase i mundtlig planocellulært karcinom [29].
Konklusion
Niveauet af LSD i gastrisk kræft prøver var signifikant højere end i den normale gastriske væv og positivt korreleret med immunhistokemi farvning af p-Akt, p-mTOR, VEGF-C og VEGF-D. Med inhibering af p-Akt og p-mTOR in vitro, VEGF-C og VEGF-D blev også signifikant reduceret. Derfor foreslår vi, at lymfangiogenese af mavekræft kan effektivt moduleres gennem Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D-aksen.
Notes
Hongxia Chen, Runnian Guan, Yu Peng Lei og Jianyong Chen bidraget lige til dette arbejde .
Forkortelse
LSD:
lymfatisk fartøj tæthed
erklæringer
Kvittering
undersøgelsen blev støttet af midler fra National Science Foundation Tilskud i Kina ( No. 81160307); Jiangxi Videnskab & Teknologi Søjle Program og Science Foundation for Young Scholars af Jiangxi-provinsen (nr 2007GQY1167); . Voyage Projekt i Jiangxi-provinsen Videnskab og Teknologi Association
Konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser
Forfattere bidrag
Undersøgelse koncepter og design:. XZhou, HC; Dataindsamling: HC, RG, HC; Dataanalyse: YL, JC; Manuskript forberedelse: QG, RD, XZhang; Manuskript revision: XQ, HL, CC. Alle forfattere har deltaget tilstrækkeligt i undersøgelsen og godkendt den endelige version.

• Bursectomy og ikke-bursectomy D2 gastrektomi til avanceret mavekræft, første erfaringer fra en enkelt institution i China
• Klinisk-patologisk betydning af nuklear faktor (erythroid-2) -relateret faktor 2 (Nrf2) udtryk i gastrisk cancer