Epstein-Barr virus specifična metilacija človeških genov v želodcu rakave celice

Epstein-Barr virus specifične metilacija človeških genov v želodcu rakavih celic
Abstract
Ozadje
Epstein-Barr virus (EBV), ki je na voljo v 10% vseh želodčnih adenokarcinome vendar je njegova vloga pri razvoju tumorjev in ostankov vzdrževanja nejasna. Cilj te raziskave je bil preučiti, EBV posredovano frakcijo celičnih dejavnikov, ki so vpletene v želodcu rakotvornost.
Metode
Izražanje genov vzorci so bili pregledani, EBV-negativna in AGS želodčne epitelijskih celic EBV-pozitiven uporabo mikromrež nizke gostote, reverzna transkripcija PCR, histokemične madeže in metilacija specifična DNK zaporedja. Izražanje PTGS2 (COX2) je bila merjena v AGS celic in primarnih adenokarcinomom želodca tkiva.
Rezultati
V študijah polj, skoraj polovica od 96 človeških genov testiranih, kar predstavlja 15 različnih, povezanih z rakom signalov poti, so dysregulated po okužbi EBV. Reverzno transkripcijo PCR potrdili velik vpliv na dejavnike, ki imajo različne funkcije, kot so uredbe celičnega ciklusa (IGFBP3
, CDKN2A, CCND1, Hsp70, ID2, ID4)
, popravilo DNA (BRCA1, TFF1
), celično adhezijo ( ICAM1
), vnetje (COX2
), in angiogenezo (HIF1A
). Demetilacija z uporabo 5-aza-2'-deoksicitidin obrnil-EBV posredovane frakcijo za vseh 11 genov, navedene tukaj. Za nekatere sekvenco promotorja, CpG otok metilacija in demetilacija pojavila v vzorcu EBV specifična, kot je prikazano z bisulfita zaporedja DNK. Imunohistokemija je manj občutljiva kot je western blot za odkrivanje downregulation za COX2 na okužbo EBV. povezanih z virusom disregulacijo ravni COX2 vitro
ni povzel in vivo
med naravno okuženih želodčnega tkiva raka.
sklepe
EBV spremeni izraz človeškega genski na način, ki bi lahko prispevali k edinstveni patobiologije virusa -associated rak. Poleg tega, pogostost in reversability povezanih s metilacijskih transkripcijskih sprememb kažejo, da imajo demetiliranjem agenti terapevtski potencial za obvladovanje raka, povezanih z EBV.
Ozadje
raka želodca je četrta najpogostejša vrsta raka in drugi najpogostejši vzrok raka smrti na svetu [1]. Različne genskih sprememb, kot tudi infekcijskih in drugih okoljskih dejavnikov zdijo dejavniki pri želodca karcinogenezo. Virus Epstein-Barr (EBV), dvojno DNA gammaherpesvirus, se nahaja znotraj maligne celice v 10% želodčnih adenokarcinomov, in zdi se okužba pred maligne transformacije [2]. Osnovni in klinična opažanja kažejo, da imajo-EBV povezana želodčni rak drugačno patobiologije iz želodca raka EBV-negativna [3-8]. Racionalno načrtovanje zdravljenja z virusom usmerjena na zahteva boljše razumevanje patogeno vlogo EBV v želodcu rakotvornost.
Predhodne študije so pokazale izgubo v višini treh ključnih zaviralnih genskih produktov, CDH1 (E-kadherina), P73 in CDKN2A (P16 ), v želodcu raka EBV okuženih [9-18]. Virus povezano metilacije teh genov, skupaj z dokazi globalnega metilacije DNA EBV-pozitiven raka, kažejo, da so želodčni rak, povezane z EBV podmnožica CpG otok methylator fenotip (CIMP) raka [4, 11, 19-26]. Potencialni mediator DNA metiltransferaza 1 (DNMT1)
, da je povečana pri naravno okuženih želodčnih raka in bi lahko pomagali vzpostaviti metilacije vzorce razmnožene na hčerinskih celic na celične delitve [21, 27-29]. Tekoči študije so usmerjene v razumevanje vloge okužbe EBV in Helicobacter pylori pri vnetjih in povezano globalno hypermethylation fazi razvoja želodčnega raka [22].
Pri modelih s celičnimi linijami, DNMT1 čezmernim je posredovana s EBV LMP1 in LMP2 [21, 28 -31]. EBV zdi zaposliti epigenetski mehanizmi za nadzor gostinskih transkriptome in tudi za nadzor ekspresije svojih virusno kodirane genov [11, 12, 14, 15, 19, 21, 24, 29, 32, 33]. Po začetnem infekcijo celice lahko nemetiliran virusni genom opraviti virusno replikacijo z novo proizvodnjo virionovo, medtem podskupina okuženih celic pridobi visoko metiliran virusni genom, ki squelches ekspresijo tujih proteinov in posreduje dolgoročno virusno vztrajnost preko latentne infekcije [23, 34]. Okužene tumorji imajo ponavadi zelo metiliran EBV DNA, in v zvezi z metiliranja utišanje virusnih genov pomaga razložiti, kako okuženo tumorji izognejo imunski uničenje.
Čeprav je metilacija promotorjev genov običajno povezana z transkripcijske downregulation
preko selektivno vezavo represorju proteinov prvi protein doslej pokazale, da se veže in aktivirati
metilirano promotor je EBV BZLF1, ključni dejavnik nadzoruje prehod iz latentne do replikacije oblik virusne okužbe [35]. Zdi se, da se je virus spretno razvili način za premagovanje promotor metilacije v svojo korist [34, 35]. Protivirusna strategije Preučuje se za njihovo delovanjem na novotvorbe potencial. Zanimivo je, da najpogosteje uporabljajo protivirusna zdravila, aciklovir in ganciklovir, so učinkoviti pri ugašanju razmnoževanje virusa, vendar ne odpravi izraz latentne in zgodnjih litičnih virusnih genov, kot so LMP1, LMP2 in BZLF1.
Klinične posledice EBV povezane metilacije na želodčni genoma raka so ogromne. Prvič, nastajajočih dokazov kaže na možnost za izboljšano diagnozo raka želodca s testiranjem želodčne opere za rakom specifičnih vzorcev metilacije, morda v dogovoru s testi za EBV opredeliti virusom okuženih podskupino raka [36-40]. Različne vzorce promotorja metilacije v virus-pozitivni v primerjavi z virusom negativnih celic [11, 21, 24] poudarjajo potrebo po zaznamoval metilacijskih vzorcev na način, ki, ki povečuje občutljivost test za odkrivanje raka. Oba okužba in spremenjeno DNA metilacija zdi, da je zgodnji dogodki v rakotvornost [2, 41], lahko olajša odkrivanje predrakavih sprememb v želodčni sok.
Druga klinična implikacija je potencial za boljše zdravljenje želodčnih raka z uporabo zdravil, ki se obrne učinek promotor hypermethylation [42, 43]. Zlasti demetiliranjem zdravil, ki zavirajo DNK metiltransferazo in povratne zaviralnih genov za dušenje zvoka ali aktivacija onkogena so potencialni antineoplastična strategije [43]. Upoštevati je treba, da morebitne razlike v učinku demetiliranjem sredstev v virus-pozitivnem primerjavi
virusom negativni tumorjev [43-45]. Mi in drugi so pokazale, da so naravno okužene želodčni rak imajo nižjo CDKN2A (P16) izraz [14, 15]. V kliničnem preskušanju fluorouracil (5-FU) za raka na želodcu, je bila CDKN2A
stanje promotor metilacija neodvisen napovedovalec preživetja [46]. Razlog za uporabo demetiliranjem sredstva, na primer 5-aza-2'-deoksicitidinska v kliničnih preskušanjih temelji na znanstvenih dokazih, ki demetiliranjem zdravljenje spreminja na tumorogene lastnosti rakavih celic.
Več preiskovalci so uspešno okuženih epitelijskih celičnih linij z EBV v
vitro
[47, 48]. V sedanji raziskavi, so bili pregledani EBV-pozitivne in EBV-negativne AGS želodca rakave celice za razlike v izražanju genov vzorci z nizko gostoto analizo mikromrež in reverzno transkripcijo verižne reakcije s polimerazo (rtPCR). AGS je celična linija, ki je bil prvotno zrasla iz želodca adenokarcinomom tkiva in zdaj se pogosto uporablja kot model za rakom želodca. Vloga metilacije DNA pri posredovanju izbrane učinke je pregledal bisulfita zaporedja DNK in s testiranjem sposobnost demetiliranjem sredstvo za obratni učinek EBV na genskega utišanja. Rezultati so pokazali obsežno genov frakcijo na okužbo EBV v AGS celic z dokazi, da je promotor metilacija odgovoren, vsaj delno. Odprava virusom povezana transkripcijskih učinkov, predlaga, da se demetiliranjem agenti prouči njihov potencial za nadzor rasti malignih bolezni, povezane z EBV.
Metode
želodca rakave celične linije
AGS želodčni rak celične linije (ATCC referenčnim laboratorijem Skupnosti 1739) je bila gojimo v Dulbeccovem Modified Eagle je medij, ki vsebuje 10% fetalni goveji serum (toplotno inaktiviramo 20 minut pri 65 ° C) in 1% penicilin-streptomicina (10.000 enot penicilin, 10.000 ug /ml streptomicina, Gibco, Carlsbad, CA) . Celice so bile okužene z rekombinantnim EBV sev (darilo dr Henri J. Delecluse) [33, 49, 50], ki je bil zasnovan tako, da izrazijo zeleni fluorescentni protein (GFP) in higromicin odpornost B s kloniranjem teh genov v prototipne B95 0,8 sev EBV, kjer drugi izvod oriLyt običajno prebiva. Pred okužbo, smo AGS celice transficirane z 1 ig kodira CD21 na ekspresijski vektor (EBV receptorja) in gena odpornostjo puromicin z Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN), kot je predhodno opisan [51]. 48 ur po transfekciji smo celice, ki vsebujejo CD21 pozitivno izbran za uporabo 0.5

• Odkrivanje promotor hypermethylation otoka CpG elektronskega kadherina v želodcu srca odkrivanje adenocarcinoma
• Spremembe lipidov profilov po radikalni želodca pri bolnikih z želodca cancer