Epstein-Barr virus-specifične metiliranje ljudskih gena u stanicama raka želuca

Epstein-Barr virus-specifična metilacija ljudskih gena u želučanih stanica raka
apstraktne pregled pozadine
Epstein-Barrov virus (EBV) je pronađen u 10% svih želučanih adenokarcinoma, ali je njegova uloga u razvoju tumora i ostataka održavanja nejasno. Cilj ovog istraživanja bio je ispitati EBV-posredovane deregulacija staničnih čimbenika umiješane u želučanom karcinogeneze.
Metode
Genska ekspresija uzorci su ispitani u EBV-negativnih i AGS želučanog epitela EBV-pozitivnih koriste nisku mikročipa gustoće, reverzne transkripcije PCR, histokemijske mrlje i metilacije specifične DNA. Izražavanje PTGS2 (CoX2) izmjerena je u AGS stanica i primarnih želučane adenokarcinoma tkiva. Pregled Rezultati
u bojne istraživanjima, gotovo polovica od 96 ljudskih gena ispitanih, što predstavlja 15 različitih karcinoma povezanih puteva prijenosa signala, bili dereguliran nakon EBV infekcije. Reverzne transkripcije PCR potvrdila značajan utjecaj na čimbenike koji imaju različite funkcije kao što su regulaciji staničnog ciklusa (IGFBP3
, lokusu CDKN2A, CCND1, hsp 70, ID2, ID4) pregled, popravak DNA (BRCA1, TFF1 pregled), stanične adhezije ( ICAM1 pregled), upale (CoX2 pregled) i angiogenezu (HIF1A pregled). Demetiliranje upotrebom 5-aza-2'-deoksicitidin obrnuo EBV posredovanog poremećajem za svih 11 gena koje su ovdje navedene. Za neke promotorske sekvence, CPG otok metilacije i demetilacija dogodila u obrascu EBV-specifičnih kao što je prikazano bisulfita sekvenciranje DNA. Imunohistokem bila manje osjetljiva nego što je western blot za otkrivanje downregulation od COX-2 nakon EBV infekcije. Virus se odnose deregulacija razine COX-2 in vitro pregled nije uglavljeno in vivo pregled kod prirodno inficiranih želučanog tkiva raka. Pregled zaključaka
EBV mijenja izraz ljudskog gena na način koji bi mogao doprinijeti jedinstvenoj patobiologije virusa -associated raka. Osim toga, učestalost i reversability metilacije vezane transkripcijskih promjene ukazuju na to da demethylating agenti imaju terapeutski potencijal za upravljanje karcinom EBV-povezane. Pregled Pozadina pregled, raka želuca je četvrti najčešći tip raka i drugi vodeći uzrok raka smrt u svijetu [1]. Čini se da čimbenici u želučanom karcinogeneze Razne genetskih promjena, kao i zaraznih i druge tvari iz okoline. Epstein-Barrov virus (EBV), DNA gammaherpesvirus s dvostrukim lancima, nalazi se unutar malignih stanica u 10% želučanih adenokarcinoma, a infekcija se čini da prethoditi malignoj [2]. Osnovni i klinička opažanja ukazuju da je rak želučane EBV-povezana imaju drugačiju patobiologije od EBV-negativne želučanog karcinoma [3-8]. Racionalna terapija virusa usmjerena zahtijeva bolje razumijevanje patogenog ulogu EBV u želučanom karcinogeneze.
Prethodne studije pokazale su gubitak tri kritična tumor supresor gena proizvoda, CDH1 (E-kadherina), p73 i lokusu CDKN2A (P16 ) u EBV inficirane želučanog raka [9-18]. Virus povezan s metiliranje tih gena, zajedno s dokazom globalnog metilacije DNA u karcinomima EBV pozitivne, sugerira da EBV vezane gastrični karcinomi su podskup CpG otok methylator fenotipu (CIMP) karcinoma [4, 11, 19-26]. Potencijalni Posrednik je DNK metiltransferaza 1 (DNMT1) pregled, koji je reguliran u prirodno zaraženih želučanog raka i može pomoći uspostaviti obrasce metilaciju propagira na stanice kćeri nakon diobe [21, 27-29]. Trenutne studije su usmjerene na razumijevanje uloge EBV i Helicobacter pylori infekcije u nastanku upale i prateće globalnu Hipermetilacija tijekom razvoja želučanog raka [22].
U stanične linije modela, DNMT1 pretjerana ekspresija je posredovana EBV LMP1 i LMP2 [21, 28 -31]. EBV izgleda upotrijebiti Epigenetički mehanizmi za kontrolu domaćina transcriptome i za kontrolu ekspresije vlastitih virusno kodirane genima [11, 12, 14, 15, 19, 21, 24, 29, 32, 33]. Nakon početne infekcije stanice je nemetilirani virusni genom može biti podvrgnut replikaciju virusa s novim proizvodnju viriona, a podskup inficiranim stanicama nabaviti visoko metilirani virusni genom koji squelches ekspresiju stranih proteina i posreduje dugotrajnu postojanost prema virusu putem latentne infekcije [23, 34]. Zaražene tumori imaju tendenciju da imaju vrlo metilirani EBV DNA, i metilacija vezane utišavanje virusnih gena pomaže objasniti kako zaražena tumori izbjegne imunološki uništenje.
Dok metilacije genskih promotora obično je povezana s transkripcije downregulation Netlogu preko selektivno vezanje represora proteina , prvi proteina ikada prikazane vezati i aktivirati pregled metiliranog promotor bio EBV BZLF1, ključni čimbenik kontrole prijelaza iz latentna na repliciranih oblika virusne infekcije [35]. Čini se da je virus kojeg se razvio kao sredstvo za prevladavanje promotora metilacije u svoju korist [34, 35]. Antivirusni strategije, ispituje se za njihovu antineoplastičnog potencijal. Zanimljivo je da su najčešće korištene antivirusna sredstva, aciklovir i ganciklovir, učinkoviti su u gašenje replikaciju virusa, ali oni ne eliminiraju izraz latentnih i početkom lize virusnih gena, kao što su LMP1, LMP2 i BZLF1.
Kliničke implikacije EBV vezane metilacije želučanog genoma raka su goleme. Prvo, u nastajanju dokazi pokazuju potencijal za bolju dijagnozu raka želuca Testiranjem želučanog ispiranja za rak specifičan metilacije obrazaca, možda u dogovoru s testovima za EBV identificirati zaražene podskup raka [36-40]. Različite uzorke promotora metilacije u virus-pozitivne u odnosu na virus-negativnih stanica [11, 21, 24] naglašavaju potrebu za karakterizaciju metilaciju uzorke na način koji koji maksimizira testu osjetljivost za otkrivanje raka. Obje infekcije i promijenjen DNA metilacije Čini se da su rani događaji u procesu karcinogeneze [2, 41], potencijalno olakšava otkrivanje prekanceroznih lezija u soku želuca.
Druga klinička Implikacija je potencijal za poboljšanje liječenja raka želuca upotrebom lijekova koji preokrenuti učinak promotora Hipermetilacija [42, 43]. Konkretno, demethylating sredstva koja inhibiraju DNA-metiltransferaze i uklanjanja tumor supresor gena utišavanje ili aktivacija onkogena su potencijalni antineoplastična strategije [43]. Razmatranje mora dati mogućim razlikama u učinku demethylating agenata u virus-pozitivnom odnosu
virus-negativnih tumora [43-45]. Mi i drugi pokazali su da se prirodno inficirane želučani karcinom imaju niži lokusu CDKN2A (P16) izraza [14, 15]. U kliničkom ispitivanju fluorouracil (5FU) za rak želuca, lokusu CDKN2A pregled promotor metilacije status bio neovisan prediktor preživljenja [46]. Razlozi za korištenje demethylating sredstva kao 5-aza-2'-deoksicitidina u kliničkim ispitivanjima počiva na znanstvenim dokazima da demethylating terapija mijenjaju tumorogene svojstva stanica raka.
Neka istraživanja su uspješno zaražene epitelne stanične linije s EBV u Netlogu vitro pregled [47, 48]. U trenutnoj studiji, EBV-pozitivnih i EBV-negativne AGS želučane stanice raka su ispitane razlike u Gene Expression uzoraka pomoću analize microarray niske gustoće i unazad lančane reakcije polimeraze transkripcije (rtPCR). AGS je stanična linija koja je izvorno izrastao iz želuca adenokarcinom tkiva, a sada se naširoko koristi kao model raka želuca. Uloga metilacije DNA u posredovanje učinaka odabranih ispitana je bisulfita sekvenciranjem DNA i ispitivanjem sposobnosti sredstva demethylating poništavanja učinka EBV na utišavanja gena. Rezultati su pokazali veliko gena deregulacija nakon EBV infekcije u AGS stanica s dokazima da je promotor metilacije je odgovoran, barem djelomično. Ukidanje virusa povezanog transkripcijskih efekata upućuje na to da demethylating sredstva treba istražiti njihova potencijala za kontrolu rasta EBV vezanih malignih bolesti. Pregled Metode
želudac staničnim linijama karcinoma
AGS rak želuca stanične linije (ATCC CRL 1739.) bila uzgajane su u Dulbeccovom modificiranom Eagleovom mediju koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (inaktiviranog toplinom 20 min na 65 ° C) i 1% penicilin-streptomicin (10.000 jedinica penicilina, 10.000 ug /ml streptomicina, Gibco, Carlsbad, CA) , Stanice su zaražene s rekombinantnog EBV soja (poklon od Dr. Henri J. Delecluse) [33, 49, 50] koja je projektirana kako bi izrazili zeleni fluorescentni protein (GFP) i otpornost na higromicin B kloniranjem te gene u prototipskih B95 0,8 soj EBV, gdje je drugi primjerak oriLyt normalno živi. Prije infekcije, stanice su transfektirane AGS s 1 ug koji kodira CD21 ekspresije vektor (EBV receptor) i gen za rezistenciju na puromicinom pomoću Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN), kao što je prethodno opisano [51]. 48 sati nakon transfekcije, stanice koje sadrže CD21 pozitivnim odabrani su za korištenje 0,5 ug /ml puromicina-HCl (Roche). Virusne zalihe rekombinantnog EBV i su generirani u bubregu 293 stanice, humane embrionalne linije epitelnih stanica, inducirajući lize replikacije 20 ng /mL forbol-12-tetradekanoat 13-acetatom i 3 mM butirat. Supernatanti su 3 dana nakon indukcije, filtriran (0,8 uM), i zamrznute na -80 ° C do upotrebe. Puromicin otporni AGS stanice su smještene na 50% pune gustoće u posudama za kulturu tkiva od 60 mm i koinkubirana sa 1 ml stock viriona. Četiri dana kasnije, EBV-om AGS stanice (sada se zove AGS-B95-HygB) pozitivno su izabrani sa 100 ug /ml higromicina B (Roche). Pregled, DNA otiska potvrdio da AGS stanice korištene u ovom istraživanju podudaraju sa genotipom AGS stanice u American Type Culture Collection. Otiska je bilo učinjeno pomoću PowerPlex 1.2 STR kit (Promega) a potom slijedi elektroforeza na ABI 310 kapilarnom elektroforezom na gelu instrumenta (Applied Biosystems). Pregled Gene Expression je histokemijskim mrlje
parafinske blokove su pripravljeni od AGS i AGS-B95- HygB stanične linije i parafinske blokove primarne želučanog adenokarcinoma dobivene su iz kliničkih arhiva. Ostatni klinički uzorci predstavljaju sve dostupne EBV pozitivnih karcinome želuca (n = 9) i nasumični odabir EBV-negativnih želučanih tumora (n = 9). Histokemijske mrlje su se primjenjivali na parafinskim rezovima kako bi potvrdili infekcije i procijeniti ekspresiju gena. Pripremiti blokova, uzgojene stanice su prvo isprane u Dulbecco-vog fosfatnog pufera (Gibco, Invitrogen), ubrane s 0,25% tripsina (Gibco, Invitrogen), isprepleteni ugruška pomoću Dade Ci-trol zgrušavanja Control (citrat) razine tla 1 (Dade Behring, Marburg, Njemačka) i trombin 200 (Pacific Hemostaza, Middletown, VA), fiksirane u 10% ublaživač formalin, uklopljena u parafin i reže na obložene slajdova. pregled, Eber pregled in situ hibridizacija provedena pregled pomoću fluoresceinom označeni Eber pregled sondom i oligo (d) T kontrolnu probu na testu in situ pregled sustava hibridizacije (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Imunohistokemijske boje za EBV LMP1 i LMP2 proteina izvedeni su kao što je prethodno opisano [52] pomoću citratnog pronalaženje antigena i CS1-4 koktel mišjim monoklonskim protutijelima protiv LMP1 (1: 100, DAKO, Capinteria, CA) i e411 štakora monoklonalno antitijelo protiv LMP2 (1 mg /ml, Asencion, München, Njemačka). Parafinskim rezovima EBV vezane Hodgkinovog limfoma i post-transplantacijske limfoproliferacijsku poremećaja služio kao pozitivna kontrola
imunohistokemijsku analizu EBV repliciranih proteina BMRF1 i BZLF1 provedena je pomoću anti-BMRF1 klon G3-E31 ​​(1:. 200 razrjeđenje, istraživanje Diagnostics Inc., Flanders, NJ) i anti-BZLF1 klon BZ.1 (1:25 razrjeđenje, Dako, Carpinteria, CA), a ljudske PTGS2 (kolokvijalno nazvan ciklooksigenaze-2, coX2) ispitana je pomoću anti-cOX2 monoklonalno antitijelo ( razrjeđenje 1: 200, Cayman Chemical). Sekcije su inkubirane s primarnim protutijelom tijekom 30 minuta na 37 ° C za ciljeve EBV, ili na 4 ° C preko noći za COX-2, koristeći blokiranja i otkrivanje protokola u vrlo osjetljivo Non biotina Detection Kit HRP (Biogenex). Vezani antitijelo detektirano je upotrebom diaminobenzidin kromogen (Biogenex) i stanice su prebrojane s hematoksilinom (Dako). Parafinskim rezovima oralna dlakava leukoplakija je poslužio kao pozitivna kontrola za litičke EBV, a reaktivna tonzila i nazofaringealni tkiva karcinoma služio kao kontrola za COX-2 mrlje. Rezultati su interpretirani mikroskopskom bodovanje malignih stanica u ≥10 poljima na 400X uvećanja čime je prosječni udio bodova (0 = nema, 1 = < 1%, 2 = 1-10%, 3 = 10-33%, 4 = 33 -66%, 5 = > 66% stanica) i ocjenu intenziteta (0 = nema, 1 = slabo, 2 = srednji, 3 = jaka bojanje). Ukupno rezultati su uspoređeni u EBV pozitivna u odnosu na
negativnih tumora pomoću Mann-Whitney neparni t testom. Pregled Otkrivanje EBV genoma
bateriju PCR (Q-PCR) analizama kvantitativna realnom vremenu ciljanje šest nejednako regije EBV genoma je korišten pokazati da virusna infekcija AGS stanica bila je uspješna. Prošireni produkti su detektirani pomoću ABI Prism 7500 Real-Time PCR instrument s Detection System Sequence programa (Applied Biosystems), kako je prethodno opisan korištenjem primera koji ciljaju BamH1W
, EBNA1
, LMP1
, LMP2
, i BZLF1
regije EBV genoma [52] ili EBER1 pregled, DNA [53]. Za provjeru onečišćenja produkt amplifikacije, svaki run sadržavala najmanje dvije "nema predloška" kontrole u kojoj nukleazna bez H2O zamjenjuje predložak.
Niske gustoće cDNA Microarray Analiza pregled, RNA je izolirana iz AGS i AGS-B95- HygB stanicama koristeći RNeasy RNA Mini kita (Qiagen) poslije prvog korištenja QiaShredder ™ centrifuge kolone (Qiagen) za razgradnju stanica. Nakon potvrde integritet RNA pomoću Agilent Bioanalyzer, analiza ekspresije mikropostrojima obavljena je SABiosciences Corporation (Frederick, MD) koristeći njihove GEArray Q serije transdukcije Human signala u Cancer Gene Array. Ovaj mikropostrojima niske gustoće sastoji se od 96 sondi koje testirati aktivaciju 15 putevima prijenosa signala koji su uključeni u onkogcnczom. (Ciljane transkripti su prikazani u rezultatima). označenim biotinom cDNA pripravljene od 10 ug svakog RNA uzorka pomoću AmpoLabeling-LPR metodom (SABiosciences) hibridizira u polje, kemiluminescentnom detekcija je provedena korištenjem CCD kamere. Integrirani sirovo vrijednosti intenziteta za svaku točku generirani su GEArray analiza Suite (SABiosciences), a daljnje analize i normalizacija provedena je pomoću programa Microsoft Excel. Najniža vrijednost točka intenzitet na svakom nizu je smatra se pozadinom i oduzeta je od svakog sirovog vrijednosti intenziteta za svaku sondu, zatim uočiti intenziteti su normalizirani da gena domaćinstva, glyceraldehydephosphate dehidrogenaze (GAPDH
). Parnom usporedba razine ekspresije gena je napravljen između EBV-pozitivnih stanica (AGS-B95-HygB) i roditeljskim EBV-negativne AGS stanica. Ako je odnos bio ≥2 ili ≤0.5, gen se smatra da se regulira prema gore ili regulirani u inficiranim stanicama.
SYBR Green semikvantitativnih rtPCR
Za potvrdu odabrane Microarray rezultata ekspresije gena, rtPCR provedena je pomoću Real-Time RT 2 gena specifičnih klica za PCR (SABiosciences). ReactionReady ™ prvom Strand cDNA Synthesis Kit (SABiosciences) se koristi za pretvaranje 3 ug RNA u cDNA, i cDNA je razrijeđen 1:10 prije PCR analizom. Sljedeće 38 cDNA ciljano su: GAPDH, A2M, ABCB1, BCL2L1, BIRC1, BIRC2, BIRC3, EN1, GADD45, HIF1A, ID2, IGFBP3, BRCA1, TMEPAI, IRF1, BCL2, BMP4, lokusu CDKN2A (p16), fn1, HK1, ICAM1, IL2, CCND1, MDM2, CoX2 (PTGS2), TFRC, WISP1, TRAF1, CDK2, VCAM1, CDKN2C (P18), CDKN1A (p21), DUSP1, HSP70, NFKB1, TNFSF10, TRIM25 pregled i FOSL1
. Reakcije su provedene u ukupnom volumenu od 25 ul sadrže 1X TaqMan ® Univerzalni Mix (ABI), RT 2 gena specifičnih prajmera smjesa (10 uM svakog primera SABiosciences), 2.5 ul 5x SYBR zelena otopina ( Molecular Probes, Eugene, OR), i 5 ul cDNA šablone. Termocikliranja uvjeti su: 50 ° C tijekom 2 minute, 95 ° C tijekom 10 minuta i 40 ciklusa 95 ° C 15 sekundi i 60 ° C tijekom 1 minute na ABI 7500 instrumentu s Sequence Detection Svstem softverom (Applied Biosystems). Isti prag je bio korišten za svakog gena i ploče ocijenjen od strane "Relativno kvantificiranje Plate" protokola. Svaki PCR reakciju provodi se u tri primjerka za svaki uzorak na dva odvojena 96 jažica, a rezultati su u prosjeku za određivanje relativne razlike u svaki gen u razini ekspresije u EBV-pozitivne u odnosu na Netlogu stanične linije EBV-negativna.
Male Groove Uvez probe semikvantitativnih rtPCR pregled procijeniti ekspresiju pet odabranih gena koji nisu bili na microarray je gore opisano, polu-kvantitativna rtPCR testovi se izvode (pokusi-na zahtjev, Applied Biosystems) koristeći manja utora obvezujućih sondi koje ciljaju helikazna nalik transkripciju faktor (HLTF pregled), trolist faktor-1 (TFF1 pregled), osnovni-leucin zatvarač ATF-kao transkripcijski faktor (BATF pregled), inhibitor DNA vezujući protein-4 (ID4 pregled) i nucleostemin (NU pregled). Tih pet su izabrani jer su navodno dereguliran u značajnom udjelu želučanog adenokarcinoma ili raka EBV povezanih [32, 54-59]. GAPDH pregled služio kao endogeni kontrola za relativne potrebe kvantifikacije. RNA se prevodi u cDNA pomoću velikog kapaciteta cDNA Archive Kit (Applied Biosystems) i cDNA je razrijeđen 1:10 s nuclease-free water. Svaka od 50 ul PCR reakcija je sadržavala: 1X TaqMan ® Universal Master Mix, 1x Target Gene Expression testu ili GAPDH pregled mix Endogeni kontrole, i 10 ul cDNA. Za provjeru onečišćenja produkt amplifikacije, svaki izraz test na svakom tanjuru sadržavala najmanje dvije "nema predloška" kontrole u kojem je nukleazna bez vode supstituiranih za predložak. Termocikliranja uvjeta i analiza podataka bili su kako je gore opisano za SYBR Green rtPCR. Pregled demetilacija liječenje i sekvenciranje bisulfita modificiranog DNA
Za proučavanje učinaka demetilacije, u AGS i AGS-B95-HygB rak želuca stanične linije uzgajaju do 75% konfluencije, a zatim se u tri uzastopna dana, 1 uM svježeg 5-aza 2'-deoksicitidin-(5aza Sigma) dodaje se svaki dan. Četvrtog dana, RNA i DNA su sakupljene iz tretiranih i netretiranih kultura. RNA je određena razina ekspresije gena i DNA je ispitana metilacije nakon natrij bisulfit liječenje (EZ metilacije DNA Kit, Zymo istraživanja, Orange, CA) pretvoriti nemetilirane citozini za uracil, a imajući metilirani citozini nepromijenjena [60]. Pozitivna kontrola je bila CpGenome Universal Metilirani DNA (Chemicon) podvrgnuti istom bisulfitnog pretvorbe i kontrolu početnice koje ciljaju C8orf4 pregled staničnog promotora gena potvrđena uspješno bisulfite pretvaranje svakog uzorka DNA [61]. CpG otoci su identificirani korištenjem CpG zemljište za svaku od pet ljudskih genes-- ICAM1 Netlogu (RefSeq # NM_00201), lokusu CDKN2A (P16) pregled (RefSeq # NM_000077.3), ID4 pregled (RefSeq # NM_001546), CoX2 pregled (RefSeq # NM_000963) i TFF1 pregled (RefSeq.225,2) - za koje promotorske sekvence (3000 basepairs uzvodno od početka transkripcije putem eksona 1) su preuzete od GenBank. Korišteni su sljedeći parametri za CpG otoku identifikacije: minimalnu duljinu od 200 bp, minimalni prosječni postotak C + G od 50%, a minimalni prosječni omjer primijetio da očekuje C + G 0.6 [62]. Za identifikaciju CpG guste regije za COX-2 Netlogu i TFF1 Netlogu, minimalna parametar duljina smanjena je na 50 bp [61]. Nizovi primera su prikazani u tablici 1. Svaka PCR reakcija sadržavala 50 ul 1 x PCR pufera, 2 mM MgCh 2, 1 jedinicu Platinum Taq DNA polimeraze (Invitrogen, Carlsbad CA), 0,2 mM dNTPs (ABI) i 30 pmol svakog primera. Termocikliranja uvjeti su: 94 ° C tijekom 2 minute, 40 ciklusa na 94 ° C u trajanju od 30 sekundi, 55 ° C kroz 30 sekundi i 72 ° C tijekom 1 minute, 72 ° C tijekom 10 minuta. Za praćenje kontaminacije produkta amplifikacije, svaki run sadržavao "nema predloška" kontrolu u kojoj je nukleazna bez vode zamjenjiv templateTable 1 bisulfita konvertirana Gene-Specific PCR Nizovi pregled ICAM1 pregled
Naprijed
5'-TGG GGG tTG TGG TTT TAG TT-3 'pregled
preokrenuti pregled 5'-CTC CCT CCA CTA AAA AC-3' pregled produkt amplifikacije veličini
412 bp pregled lokusu CDKN2A (p16)
Naprijed
5'-aga TGT TTT GTG GTT GTT GTG A-3 '
Obrnut pregled 5'-CAA AAA TCT TCC ATT CTT CAA AC -3 'pregled produkt amplifikacije veličina pregled 418 bp pregled ID4
Naprijed
5'-TTT TTT GGG TAT ATA TTA GTT TGG-3'
Obrnut pregled 5'-TAT CCT AAT CAC TCC CTT C-3 'pregled veličina produkta amplifikacije pregled 477 bp pregled COX-2 pregled, Naprijed pregled 5'-TAT GTG tTG TAT ATA GAG TAG A-3'
preokrenuti pregled 5'-AAA AAA TAA TCC CCA CTC TC -3 'pregled veličina produkta amplifikacije pregled 399 bp pregled TFF1 pregled Forward pregled 5'-TTA GGT TGG AGT GTA GTA GG-3'
obrnuti pregled 5'-CCT ACT MAČKA ATC TAA AAA ACC C-3 'pregled produkt amplifikacije veličina pregled 489 bp pregled C8orf4 kontrole
Naprijed
5'-GAA TTA AAA TAT AAG GAG AGT TTT-3 '
preokrenuti pregled 5'-AAC ATT ACC CAA ACA TAA AAC AA-3' pregled produkt amplifikacije veličine pregled 328 bp pregled sekvencioniranje se obavlja na amplikonima bisulfita liječenih predloške kako bi se utvrdile metiliranog i unmethylated CpGs sa ili bez 5aza liječenja. Prvo, svaki PCR produkt je kloniran u pGEM-T vektor pomoću opreme za pGEM-T Easy vektor II (Promega) i transformiran u komponenta JM109 stanica visoke učinkovitosti. Bijele kolonije koje sadrže umetke se selekcionira i kultivira se preko noći, a plazmid DNA je ekstrahiran korištenjem garniture Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen). Sekvencioniranje se vrši na ABI 3100 Genetic Analyzer pomoću ABI PRISM ™ BigDye ™ Version 1.1 Terminator ciklusa za brzi odgovor Kit s AmpliTaq DNA polimeraze i M13R3 primer. Rezultati su bili preuzeti u sekvencera softvera (Gene Codes, Ann Arbor, MI) za dobivanje obrnuti kompliment od svake sekvence te naprijed i natrag Sekvence su poravnate i analizirani razlikovati nemetilirane citozini od metilnog citozini.
Western blot na AGS stanična linija
zbog mogućih inhibitora coX2 terapiju da prevladaju COX-2 učinke, rezultati RNA-based za COX-2 su izabrani za praćenje studija na proteinskoj razini. Konfluentne AGS stanice s ili bez EBV su sakupljene sa 0.25% tripsina, ispere dva puta u fiziološkoj otopini puferiranoj fosfatom, i peletirane centrifugiranjem. Stanice su resuspendirane u 500 ul NP-40 pufera za lizu stanica (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, pH 8,0) i inkubira na ledu 30 minuta i centrifugira na 12.000 okretaja u minuti tijekom 15 minuta na 4 ° C ° C. Alikvoti lizata (na 50, 100, 150 ug proteina po jažici) su razdvojeni pomoću SDS-PAGE na 4-20% gradijentu gela tris-glicin (Invitrogen) i prenesu na nitroceluloznu membranu. CoX2 je detektirano omjeru 1: monoklonalnog antitijela 5000 slijedi 1: razrjeđivanje sa sekundarnim protutijelom konjugiranim s alkalnom fosfatazom (Amersham Biosciences) i vizualizaciju s tajfuna fosfoimageru (Molecular Dynamics) 10,000. Gustoća Band mjeriti polu-kvantitativno i normalizira na beta aktin (ACTB) je u odnosu između zaraženih i nezaraženih AGS stanica.

• Detekcija promotora Hipermetilacija od CpG otoka E-kadherina u želučanom srčane adenocarcinoma
• Promjene lipidnog profila nakon radikalne gastrektomije kod pacijenata sa želučanim cancer