Вирус Эпштейна-Барр специфических метилирование генов человека в клетках рака желудка

Вирус Эпштейна-Барр специфических метилирование генов человека в клетках рака желудка
Аннотация
Справочная информация
вирус Эпштейна-Барр (EBV) встречается в 10% всех желудочных аденокарцином, но его роль в развитии опухоли и остается на техническое обслуживание не понятно. Целью данного исследования было изучение EBV-опосредованной дисрегуляцию клеточных факторов, замешанных в желудочном канцерогенезе.
Методы
Экспрессия генов структуры были рассмотрены в EBV-отрицательных и EBV-позитивных AGS эпителиальных клеток желудка с использованием микрочипов низкой плотности, ПЦР с обратной транскрипцией, гистохимические пятна, и метилирование специфических секвенирования ДНК. Выражение PTGS2 (COX2) измеряли в AGS клетках и в первичных тканей желудка аденокарциномы.
Результаты
В исследованиях массива, почти половина из 96 человеческих генов испытанных, представляющих 15 различных связанных с раком пути передачи сигнала, были дизрегуляции после того, как EBV инфекции. Обратную транскрипцию PCR подтвердили значительное влияние на факторы, имеющие различные функции, такие как регулирование клеточного цикла (IGFBP3
, CDKN2A, CCND1, HSP70, ID2, ID4)
, репарации ДНК (BRCA1, TFF1
), клеточной адгезии ( ICAM1
), воспаление (COX2
) и ангиогенез (HIF1A
). Деметилированием с использованием 5-аза-2'-дезоксицитидин отменил EBV-опосредованной дисрегуляцию для всех 11 генов, перечисленных здесь. Для некоторых промоторных последовательностей, CpG острова метилирование и деметилирование произошло в EBV-определенной схеме, как показано на бисульфита секвенирования ДНК. Иммуногистохимия был менее чувствительным, чем был вестерн-блот для обнаружения понижающей регуляции СОХ2 при EBV-инфекции. Вирус связанных с дисрегуляция уровней COX2 в пробирке
не воспроизводятся в естественных условиях
среди естественно инфицированных желудка раковых тканей.
Выводы
EBV изменяет экспрессию генов человека способами, которые могли бы способствовать уникальному патобиологии вируса -associated рак. Кроме того, частота и reversability метилирования связанных с транскрипционных изменений предполагают, что деметилирующий агенты обладают терапевтическим потенциалом для управления EBV, связанных с карциномой.
Фон
рака желудка является четвертым наиболее распространенным типом рака и второй ведущей причиной развития рака смерти во всем мире [1]. Разнообразие генетических изменений, а также инфекционных и других факторов окружающей среды, как представляется, факторами желудочного канцерогенеза. Вирус Эпштейна-Барр (EBV), двухцепочечной ДНК gammaherpesvirus, обнаруживается в злокачественных клетках в 10% желудка аденокарциномы, и инфекция, кажется, предшествует злокачественной трансформации [2]. Основные и клинические наблюдения указывают на то, что EBV-ассоциированных видов рака желудка имеют различный патобиологии от EBV-отрицательных рака желудка [3-8]. Рациональный дизайн вируса направленной терапии требует более глубокого понимания патогенетической роли EBV в желудочном канцерогенезе.
Предшествующие исследования показали потерю трех критических ген-супрессор опухолей продуктов, CDH1 (Е-кадгерина), р73 и р16 (CDKN2A ), в EBV-инфицированных рака желудка [9-18]. Вирус-ассоциированные метилирование этих генов, наряду с признаками глобального метилирования ДНК в EBV-позитивных видов рака, позволяет предположить, что EBV раковых заболеваний, связанных желудка являются подмножеством CpG острова methylator фенотип (CIMP) раковых заболеваний [4, 11, 19-26]. Потенциальный посредник ДНК метилтрансферазы 1 (DNMT1)
который усиливается в естественно зараженных раком желудка и может помочь установить закономерности метилирования, распространяющихся дочерним клеткам при делении клеток [21, 27-29]. Текущие исследования направлены на понимание роли инфекции EBV и хеликобактерной в вызывая воспаление и связанный с ним глобальный гиперметилирование во время развития рака желудка [22].
В моделях клеточной линии, DNMT1 избыточная экспрессия опосредуется EBV LMP1 и LMP2 [21, 28 -31]. EBV-видимому, используют эпигенетические механизмы управления хост-транскриптом, а также контролировать экспрессию своих собственных генов, кодируемых вирусно [11, 12, 14, 15, 19, 21, 24, 29, 32, 33]. После первоначального инфицирования клетки, то неметилированным вирусный геном может подвергнуться вирусной репликации с новым производством вирионов, в то время как подмножество инфицированных клеток приобретают весьма денатурат вирусный геном, который squelches экспрессию чужеродных белков и посредничает долгосрочной персистенции вирусов путем скрытой инфекции [23, 34]. Зараженные опухоли, как правило, имеют высокую денатурат ДНК EBV и метилирования связанных с глушителей вирусных генов помогает объяснить, как инфицированный опухоли уйти от иммунного разрушения.
В то время как метилирование промоторов генов обычно связан с транскрипционной понижающей
с помощью селективного связывания репрессора белков , первый белок никогда не показал связывать и активировать
метилированный промотор был EBV BZLF1, ключевым фактором, определяющим переход от латентной к репликативному форм вирусной инфекции [35]. Оказывается, что вирус эволюционировал ловко средство преодоления метилирования промотора в свою пользу [34, 35]. Противовирусные стратегии в настоящее время изучаются для их противоопухолевого потенциала. Интересно отметить, что наиболее часто используемые противовирусные средства, ацикловир и ганцикловир, эффективны при закрытии репликации вируса, но они не исключают экспрессию латентных и ранних литических вирусных генов, таких как LMP1, LMP2 и BZLF1.
Клинические последствия EBV- связанных с метилирования генома рака желудка огромны. Во-первых, появляются доказательства показывает потенциал для улучшения диагностики рака желудка путем тестирования желудка промывок для рака специфических паттернов метилирования, возможно, совместно с тестами для EBV, чтобы идентифицировать зараженный вирусом подмножество раковых заболеваний [36-40]. Отличаясь паттерны метилирования промотора в вирусе-положительной по сравнению с вирус-отрицательных клеток [11, 21, 24] подчеркивают необходимость характеристики моделей метилирования таким образом, что обеспечивает максимальную чувствительность анализа для обнаружения рака. Обе инфекции и метилирование Измененная ДНК, как представляется, ранние события в канцерогенез [2, 41], потенциально способствуя обнаружения предраковых поражений в желудочном соке.
Второе клиническое проявление потенциал для улучшения лечения рака желудка с помощью лекарственных препаратов, передачи заднего хода эффект гиперметилированием промотора [42, 43]. В частности, деметилирующий агенты, которые ингибируют метилтрансферазы ДНК и обратной супрессоров опухолей ген глушителей или активации онкогенов являются потенциальными противоопухолевых стратегий [43]. Необходимо учитывать возможных различий в эффекте деметилирующий агентов в вирус-положительной по сравнению с
вирус-отрицательных опухолей [43-45]. Мы и другие показали, что, естественно, инфицированных рака желудка имеют более низкую CDKN2A (P16) выражение [14, 15]. В клиническом испытании фторурацила (5ФУ) для рака желудка, CDKN2A
статус метилирования промотора был независимым предиктором выживаемости [46]. Обоснованием для использования деметилирующий агентов, как 5-аза-2'-деоксицитидина в клинических исследованиях опирается на научные доказательства, что деметилирование терапия модифицирует онкогенными свойствами раковых клеток.
Некоторые исследователи успешно зараженные эпителиальные клеточные линии с EBV в
витро
[47, 48]. В текущем исследовании, EBV-позитивных и EBV-негативных AGS рака желудка клетки исследовали различия в характере экспрессии генов с использованием анализа микрочипов низкой плотности и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (rtPCR). АГС является клеточная линия, которая была первоначально выращены из аденокарциномы желудка ткани и в настоящее время широко используется в качестве модели рака желудка. Роль метилирования ДНК в опосредовании выбранные эффекты исследовали с помощью бисульфита секвенирования ДНК и путем тестирования способности деметилирующим агента обратный эффект EBV на молчанием генов. Результаты показали обширную дисрегуляцию генов при EBV-инфекции в клетках AGS доказательства того, что промотор метилирование отвечает, по крайней мере частично. Восстановление вируса-ассоциированных транскрипционных эффектов позволяет предположить, что деметилирующий агенты должны быть изучены на предмет их способности контролировать рост EBV-связанных злокачественных опухолей.
Методы
рака желудка клеточных линий
АГС желудка линии раковых клеток (АТСС CRL- 1739) культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (инактивированную нагреванием в течение 20 минут при 65 ° с) и 1% пенициллина-стрептомицина (10000 единиц пенициллина, 10000 мкг /мл стрептомицина, Гибко, Карлсбад, Калифорния) , Клетки были инфицированы рекомбинантного штамма EBV (подарок от доктора Генри Дж Delecluse) [33, 49, 50], который был разработан, чтобы выразить зеленый флуоресцирующий белок (GFP) и резистентность к гигромицину B клонированием этих генов в прототипных B95 +0,8 штамм EBV, где вторая копия oriLyt обычно проживает. Перед тем как инфекции, AGS клетки трансфицировали 1 мкг кодирующего CD21 векторе экспрессии (рецептор EBV) и ген устойчивости к пуромицин с помощью Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN), как описано ранее [51]. Через 48 часов после трансфекции, клетки, содержащие CD21, были положительно выбраны для использования 0,5 мкг /мл пуромицин-HCl (Roche). Вирусные запасы рекомбинантного EBV генерировались в почке клеток 293, человеческий эмбриональный эпителиальную клеточную линию, путем индукции литического репликации с использованием 20 нг /мл форболовыми 12-tetradecanoate-13-ацетата и 3 мМ бутирата. Супернатанты собирали через 3 дня после индукции, фильтровали (0,8 мкМ), и замораживают при температуре -80 ° С до использования. Пуромицин устойчивостью AGS клетки высевали на 50% от полной плотности в 60-мм чашки с культурой ткани и совместно инкубировали с 1 мл исходного вирионов. Через четыре дня спустя, EBV-инфицированных AGS клетки (называемые теперь АГС-В95-HygB) были положительно выбраны с 100 мкг /мл гигромицина (Roche).
ДНК-дактилоскопии подтвердили, что AGS клетки, используемые в данном исследовании, соответствовали генотип AGS клетки в американской коллекции типовых культур. Отпечатки было сделано с помощью PowerPlex 1.2 STR комплект (Promega), а затем с помощью электрофореза на ABI 310 капиллярного гель-электрофореза инструмента (Applied Biosystems).
Экспрессии генов с помощью гистологических Пятна
готовили парафиновые блоки из AGS и AGS-B95- клеточные линии HygB и парафиновые блоки первичной аденокарциномы желудка были получены из клинических архивов. Остаточные клинические образцы представляют все имеющиеся EBV положительные рак желудка (n = 9) и случайный выбор EBV-отрицательных рака желудка (п = 9). Гистохимические пятна были применены к парафиновых срезах для подтверждения инфекции и оценить экспрессию генов. Для подготовки блоков, культивированные клетки сначала промывали в фосфатно-буферном солевом растворе Дульбекко (Gibco, Invitrogen), заготовленной с 0,25% трипсина (Gibco, Invitrogen), замешанным в сгустка с использованием Дейд Ки-Trol коагуляции Control (цитратной) -Level 1 (Dade Behring, Марбург, Германия) и Тромбин 200 (Тихий гемостаза, Миддлтон, VA), фиксировали в 10% забуференном формалине, заливали в парафин и делали срезы на предметные стекла с покрытием.
EBER
Ситу
гибридизации была выполнена в используя флуоресцентную метку Eber
зонд и олиго (d) контроль T зонд на Benchmark на месте
системы гибридизации (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Иммуногистохимическое пятна для ЭБВ LMP1 и LMP2 белков проводили, как описано ранее [52] с использованием цитрата извлечения антигена и CS1-4 коктейль из мышиных моноклональных антител против LMP1 (1: 100, Dako, Capinteria, CA) и E411 крысиных моноклональных антител против LMP2 (1 мг /мл, Asencion, Мюнхен, Германия). Парафиновые секции EBV, связанных с лимфомой Ходжкина и постпересадки расстройства лимфопролиферативных служил в качестве положительного контроля изображения иммуногистохимического анализа репликативной белков EBV BMRF1 и BZLF1 проводили с использованием анти-BMRF1 клон G3-E31 ​​(1:. 200 разбавления, научные исследования Диагностика , Inc., Фландрия, штат Нью-Джерси) и анти-BZLF1 клон BZ.1 (1:25 разбавление, Dako, Carpinteria, CA), в то время как человеческий PTGS2 (в просторечии под названием циклооксигеназы-2, СОХ2) анализировали с использованием анти-COX2 моноклональные антитела ( 1: 200 разбавление, Cayman Chemical). Срезы инкубировали с первичными антителами в течение 30 минут при 37 ° C для целей EBV, или при температуре 4 ° С в течение ночи для COX2, с помощью блокирующего и обнаружения протоколов в супер-нечувствительных биотин HRP Detection Kit (BioGenex). Связанное антитело детектировали с использованием диаминобензидина хромоген (BioGenex) и клетки подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином (Dako). Парафиновых срезах оральной волосистой лейкоплакии служил в качестве положительного контроля для лизиса EBV, в то время как реактивная миндалин и носоглотки ткани карциномы служили в качестве контроля для COX2 пятен. Результаты были интерпретированы микроскопическом озвучивания злокачественных клеток в полях при ≥ 10 400x увеличении получают средний балл пропорции (0 = нет, 1 = &лт; 1%, 2 = 1-10%, 3 = 10-33%, 4 = 33 -66%, 5 = > 66% клеток) и оценка интенсивности (0 = нет, 1 = слабый, 2 = средний, 3 = сильное окрашивание). Всего баллы по сравнению с EBV положительных и отрицательных
опухолей с использованием непарного критерия Стьюдента Манна-Уитни.
Обнаружение EBV генома
Батарея количественной ПЦР в реальном времени (Q-PCR) анализов ориентации шесть несопоставимые районы генома EBV использовали для демонстрации, что вирусная инфекция клеток AGS была успешной. Усиленные продукты были обнаружены с использованием ABI Prism 7500 ПЦР в реальном времени прибор с программным обеспечением Последовательность Detection System (Applied Biosystems), как описано ранее с использованием праймеров с таргетингом на BamH1W
, EBNA1
, LMP1
, LMP2
, и BZLF1
регионы EBV генома [52] или EBER1
ДНК [53]. Чтобы проверить наличие загрязнения ампликона, каждый прогон содержал по крайней мере, два "нет шаблона" управления, в которой нуклеазы без H2O заменяли шаблона.
Низкоплотностных кДНК-микрочипов анализа
РНК выделяли из AGS и AGS-B95- клетки HygB с использованием набора RNeasy РНК Mini Kit (Qiagen) после того, как первый, используя ротационную колонку QiaShredder ™ (Qiagen), чтобы лизировать клетки. После подтверждения целостности РНК с использованием Agilent Bioanalyzer, анализ экспрессии микрочипов проводили SABiosciences Corporation (Frederick, MD) с использованием их GEArray серии Q Human трансдукции сигнала в Cancer Gene Array. Это микрочипов низкой плотности состоит из 96 зондов, которые проверяют активацию путей передачи 15 сигналов, участвующих в онкогенеза. (Target транскрипты перечислены в результатах поиска.) меченных биотином кДНК, полученные из 10 мкг каждого образца РНК с использованием метода AmpoLabeling-LPR (SABiosciences) гибридизовали в массив, и хемилюминесцентной детекции проводили с помощью ПЗС-камеры. Интегрированные значения сырые интенсивности для каждого пятна были получены с помощью программного обеспечения GEArray Analysis Suite (SABiosciences), и дальнейший анализ и нормализация проводили с использованием Microsoft Excel. Самое низкое значение интенсивности пятна на каждом массиве рассматривалось как фон и вычитали из каждого значения сырой интенсивности для каждого зонда, а затем пятна интенсивности были нормированы на что гена домашнего хозяйства, glyceraldehydephosphate-дегидрогеназы (GAPDH
). Попарное сравнение уровней экспрессии генов было сделано между EBV-позитивных клеток (АГС-B95-HygB) и родительских EBV-негативных клетках AGS. Если отношение было ≥2 или ≤0.5, ген считается повышающей регуляции или подавляются в инфицированных клетках.
SYBR Green полуколичественного rtPCR
Для подтверждения результатов экспрессии генов выбран микрочипов, rtPCR проводили с использованием в режиме реального времени RT 2 Гено-специфические ПЦР-праймеры (SABiosciences). Комплект ReactionReady ™ первой цепи кДНК Синтез (SABiosciences) был использован для преобразования 3 мкг РНК в кДНК и кДНК разводили в соотношении 1:10 перед ПЦР-анализа. были направлены следующие 38 кДНК: GAPDH, A2M, ABCB1, BCL2L1, BIRC1, BIRC2, BIRC3, EN1, GADD45, HIF1A, ID2, IGFBP3, BRCA1, TMEPAI, irf1, BCL2, BMP4, CDKN2A (p16), FN1, HK1, ICAM1, IL2, CCND1, MDM2, COX2 (PTGS2), TFRC, WISP1, TRAF1, CDK2, VCAM-1, CDKN2C (p18), CDKN1A (p21), DUSP1, HSP70, nfkb1, TNFSF10, TRIM25
и FOSL1 <бр>. Реакции осуществл ют в общем объеме 25 мкл, содержащем 1X TaqMan ® Универсальный Mix (ABI), R T 2 ген-специфический набор праймеров смесь (10 мкМ каждого праймера, SABiosciences), 2,5-зеленый раствор мкл 5X SYBR ( Molecular Probes, Eugene, OR), и 5 мкл матрицы кДНК. Термоциклирования условия были: 50 ° С в течение 2 мин, 95 ° С в течение 10 минут и 40 циклов при 95 ° С в течение 15 секунд и 60 ° C в течение 1 минуты на качестве ABI 7500 инструмента с программным обеспечением Последовательность Detection System (Applied Biosystems). Тот же порог был использован для каждого гена и пластины оценивали по протоколу "Относительная Количественное Plate". Каждую реакцию ПЦР проводили в трех повторностях для каждого образца на двух отдельных 96-луночные планшеты, и результаты были усреднены для определения относительных различий в уровне экспрессии каждого гена в EBV-позитивных против
EBV-отрицательной клеточной линии.
Малую Groove Связывание зонда полуколичественного rtPCR
Для оценки экспрессии пяти выбранных генов, которые не были на микрочипе, описанной выше, полуколичественного анализов rtPCR проводили (аНАЛИЗЫ-по требованию, Applied Biosystems) с использованием малой бороздкой связывания зондов с таргетингом хеликазную типа транскрипции фактор (ЦГВУ
), трилистник фактор-1 (TFF1
), основные лейцин молнии ATF-подобный фактор транскрипции (BATF
), ингибитор ДНК-связывающий белок-4 (ID4
), и nucleostemin (NU
). Эти пять были выбраны потому, что они, как сообщается, дизрегуляции в значительной части желудка аденокарциномы или EBV онкологических заболеваний, связанных [32, 54-59]. GAPDH
служил в качестве эндогенного контроля для относительных целей количественной оценки. РНК превращают в кДНК с использованием большой емкости кДНК Archive Kit (Applied Biosystems), и кДНК разводили в соотношении 1:10 с нуклеазы без воды. Каждую реакцию 50 мкл ПЦР содержала: 1X TaqMan ® Универсальный Master Mix, 1X ген-мишень анализа экспрессии или GAPDH
смеси эндогенного контроля и 10 мкл кДНК. Чтобы проверить наличие загрязнения ампликона, каждое выражение для анализа на каждой пластине содержится по меньшей мере, два "нет шаблона" управления, в которой нуклеазы без воды был заменен на шаблон. Термоциклирования условия и анализ данных были, как описано выше для.
Деметилирования Лечение и секвенирование бисульфит-модифицированной ДНК
Для изучения влияния деметилирования SYBR Green rtPCR, АГС и АГС-B95-HygB линии рака желудка клеток были выросла до 75% сплошности, а затем в течение трех последовательных дней 1 мкМ свежего 5-аза-2'-дезоксицитидин (5aza; Sigma) добавляли ежедневно. На четвертый день, РНК и ДНК собирали из обработанных и необработанных культур. РНК оценивали на уровни экспрессии генов, и ДНК исследовали на метилирование после того, как натрий бисульфит обработка (EZ метилирование ДНК комплект, Zymo исследований, Оранж, Калифорния), чтобы преобразовать неметилированные цитозина в урацил, сохраняя при этом метилированных цитозина без изменений [60]. Положительный контроль был CpGenome Универсальный метилированной ДНК (Chemicon) подвергали такой же бисульфита преобразования и управления праймеры с таргетингом на C8orf4
клеточный промотор гена подтвердил успешное превращение бисульфит каждого образца ДНК [61]. CpG острова были идентифицированы с использованием CpG Участок для каждого из пяти человеческих genes-- ICAM1
(RefSeq # NM_00201), CDKN2A (p16)
(RefSeq # NM_000077.3), ИД4
(RefSeq # NM_001546), СОХ2
(RefSeq # NM_000963), и TFF1
(RefSeq225,2) - для которых последовательности промотора (3000 пар оснований против хода транскрипции от сайта инициации транскрипции через экзон 1), были загружены из базы данных GenBank. Были использованы следующие параметры для идентификации острова CpG: минимальная длина 200 б.п., минимальный средний процент C + G 50%, а минимальное среднее отношение наблюдается к ожидаемому C + G 0,6 [62]. Для идентификации CpG плотные области для COX2
и TFF1
, минимальный параметр длины был уменьшен до 50 б.п. [61]. Последовательности праймеров приведены в таблице 1. Каждая содержала 50 мкл ПЦР-реакции: 1X буфер для ПЦР, 2 мМ MgCl <суб> 2, 1 единица Платиновый Taq ДНК-полимеразы (Invitrogen, Carlsbad CA), 0,2 мМ дНТФ (ABI), и 30 пмоль каждого праймера. Термоциклирования условия были: 94 ° С в течение 2 минут, 40 циклов при 94 ° С в течение 30 секунд, 55 ° С в течение 30 секунд и затем 72 ° С в течение 1 минуты, 72 ° С в течение 10 минут. Для контроля загрязнения ампликона, каждый прогон содержал "нет шаблона" контроль, в котором нуклеазы без воды был заменен на templateTable 1 бисульфит Преобразо Gene-специфической ПЦР праймеров
ICAM1

Форвард

5'-TGG GGG TTG TGG ТТТ TAG TT-3 '

Обратный
5'-CTC CCT CCA CTA AAA AC-3'
размер ампликона
412 п.н.
CDKN2A (p16)
Форвард
5'-AGA TGT ТТТ GTG GTT GTT GTG A-3 '
Обратный
5'-CAA AAA TCT TCC ATT CAA СТТ AC -3 '
Amplicon размер
418 п.н.
ID4
Форвард
5'-ТТТ ТТТ GGG ТАТ ATA TTA GTT TGG-3'
Обратный
5'-TAT CCT AAT CAC ТСС СТТ C-3 '
размер ампликона
477 п.н.
СОХ2
Форвард
5'-TAT GTG TTG ТАТ ATA GAG TAG A-3'
Обратный
5'-AAA AAA ТАА TCC CCA CTC TC -3 '
размер ампликона
399 п.н.
TFF1
Форвард
5'-TTA ГГТ TGG AGT GTA GTA GG-3'
Обратный
5'-CCT ACT CAT TAA AAA ATC ACC C-3 '
Amplicon размер
489 п.н.
управления C8orf4
Форвард
5'-GAA TTA AAA TAT AAG GAG AGT ТТТ-3 '
Обратный
5'-AAC ATT ACC CAA ACA ТАА AAC AA-3'
размер ампликона
была выполнена 328 п.н.
секвенирования на ампликонов бисульфита обработанных шаблонов для идентификации метилированные и неметилированные CpGs с или без 5aza лечения. Во-первых, каждый продукт ПЦР клонировали в pGEM-T вектора с использованием pGEM-T Easy векторной системы II (Promega) и трансформировали в JM109 высокоэффективных компетентных клеток. Белые колонии, содержащие вставки, отбирали и культивировали в течение ночи, и плазмидную ДНК экстрагировали с использованием Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). Секвенирование было сделано на ABI 3100 Genetic Analyzer с использованием Terminator Cycle Ready Reaction Kit ABI PRISM ™ BigDye ™ версии 1.1 с AmpliTaq ДНК-полимеразы и праймера M13R3. Результаты были загружены в Sequencher программного обеспечения (Gene коды, Ann Arbor, MI), чтобы получить обратный комплимент каждой последовательности, а также вперед и назад последовательности были выровнены и проанализированы, чтобы отличить неметилированные цитозина от метилированных цитозина.
Вестерн-блот на АГС клеточная линия
из-за потенциала для ингибитора COX2 терапии для преодоления последствий COX2, были выбраны результаты РНК на основе для СОХ2 для последующих исследований на белковом уровне. Сливной AGS клетки с добавлением или без EBV собирали с помощью 0,25% трипсина, дважды отмывали в фосфатно-буферном солевом растворе, и осаждают центрифугированием. Клетки ресуспендировали в 500 мкл NP-40 буфера для лизиса клеток (50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, рН 8,0), инкубировали на льду в течение 30 минут, и центрифугировали при 12000 оборотах в минуту в течение 15 минут при 4 ° С. Аликвоты лизатов (на 50, 100, 150 мкг белка на лунку) были решены с помощью SDS-PAGE на 4-20% -ном градиентном трис-глицин (Invitrogen) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. СОХ2 был обнаружен с 1: 5000 разбавление моноклональных антител с последующим 1: 10000 разбавления вторичных антител, конъюгированных с щелочной фосфатазы (Amersham Biosciences) и визуализация с помощью тайфуна Phosphorimager (Molecular Dynamics). Плотность полосы измеряется полуколичественно и нормированы на бета-актина (ACTB) сравнивали между инфицированных и неинфицированных клеток AGS.

Результаты EBV инфицирование клеток AGS рака желудка
Успешное EBV инфекции AGS рака желудка клеток было подтверждено с использованием шести Q-ПЦР с таргетингом разнородные сегменты генома EBV. EBER
Ситу
гибридизации в настоящее время не показала Eber
выражение в клетках родительских "EBV-негативных" AGS, в то время как более 90% клеток АГС-B95-HygB были EBER
-положительным и активировала -appearing ядерная морфология (Рисунок 1). Скорость пролиферации была увеличена, как показано слиянием культивируемых клеток АГС-B95-HygB за три дня до родительских AGS клеток. Инфекция сохраняется в течение не менее 4 месяцев, как показано GFP и EBER
гистохимических пятна. EBV латентный (LMP1 и LMP2A) и литические (BZLF1 и BMRF1) белки не были выражены в неинфицированных AGS клеток, в то время как ~ 10% инфицированных клеток выражается LMP1, половина клеток выражается LMP2A, и ~ 35% выразили BMRF1 и BZLF1 белки, подразумевающих активные вирусной репликации (Рисунок 1). Рисунок 1 АГС-B95-HygB клетки экспрессируют латентные и литические вирусные гены. А) иммуногистохимическое пятно для GFP предлагает гигромицина обработанных AGS клетки были равномерно заражены сконструированной B95.8 EBV генома. Б) EBER Ситу
гибридизации в указывает на скрытую инфекцию в &GТ; 90% клеток. Nuclear Eber
окрашивание запасных частей ядрышек, а также увеличенные ядрышки являются маркером клеточной активации. выражались Скрытое вирусные белки LMP1, (С) и LMP2 (D), очаговым. Литические вирусные белки, BMRF1 (Е) и BZLF1 (F), были выражены в значительной части клеток АГС-B95-HygB. Были проанализированы
клеточного гена Expression Различия в EBV-позитивных по сравнению с EBV-негативных AGS клеток
уровней экспрессии 96 клеточных генов; (LMP1, LMP2, EBER
и BZLF1 пятна, 1200x и BMRF1 GFP пятна, 800x) в клетках AGS и AGS-B95-HygB с использованием низкой плотности микрочипов анализа с хемилюминесцентной детекции (Рисунок 2). После нормализации к GAPDH
, парного сравнения уровней экспрессии генов между EBV-положительными и отрицательными EBV-AGS клеток показало, что из 96 генов на микрочипе, 43 были дизрегуляции по крайней мере в два раза после того, как EBV инфекции. Удивительно, но наблюдалось ЭБВ-связанное с этим увеличение экспрессии только 6 генов (IGFBP3
, GADD45, irf1, grp78 /HSPB1, GLUT1 /SLC2A1, TMEPAI
), в то время как снижение экспрессии наблюдалось для остальных 37 дизрегуляции генов (ABCB1, BCL2L1, BIRC2, BMP2, CDKN2A, DUSP1, HIF1A, ICAM1, ID2, nfkb1, COX2, TFRC, VCAM-1, WISP1, TRIM25, IL2, BMP4, MDM2, CCND1, CDK2, БАКСА, p57, p19, CSN2, CXCL9 , IL-4, Цзюнь, KLK3, LTA, MMP7, PPARG, TNFRSF10B, WIG1, WNT2, PTCH2
). Рисунок паттерны экспрессии генов 2 изменяются при EBV инфекции клеток AGS. Биотин-меченные зонды кДНК выстроенных в четырех повторах на нейлоновую мембрану гибридизоваться с РНК, выделенной из AGS и АГС-В95-HygB клеток. Хемилюминесцентные сигналы указывают на нарушение регуляции генов, выбранных среди 96 на массиве по сравнению с генами контроля в двух последних строках.
SYBR Green rtPCR был использован для проверки выводов микрочипов для 26 из дизрегуляции генов и 12 дополнительных генов, в которых никаких существенных изменений наблюдалось на микрочипе. Более чем двукратное изменение уровня мРНК в инфицированных по сравнению с
неинфицированных клеток было найдено 16/26 генов (таблица 2). Гены наиболее сильно пострадавшие были IGFBP3
что было активируемых 42 раза, и COX2, BMP4 и ICAM1
которые подавляются на 35-, 32-, и 22 раз, соответственно. Остальные десять микрочипов изменения не были подтверждены rtPCR, предполагая, что ЭБВ связанных с дисрегуляция этих факторов была ниже, чем в два раза. В одном случае, было значительное несоответствие: Уровни экспрессии BCL2L1 Ру по микрочипов анализа показали двукратное уменьшение
в инфицированных клетках в то время как rtPCR неоднократно показали пятикратное увеличение
в BCL2L1
мРНК уровни в инфицированных клетках. Менее резкие расхождения были обнаружены, когда еще 12 генов, были проанализированы с помощью rtPCR, со значительным (> 2 раза) изменения найдены в экспрессии генов 5/12, для которых не наблюдалось никаких изменений на микрочипе (Таблица 2) .table 2 Гены дизрегуляции в EBV-инфицированных AGS клеток
<СОР> <СОР> <СОР> Gene Имя

Генные Symbol

Повязку меняют *

подавляются Genes
Основная лейцин-молния транскрипционный фактор, ATF типа
BATF

-38
циклооксигеназы-2
COX2

-35
костного морфогенетического белка-4 <бр> BMP4

-32
межклеточной адгезии-1
ICAM1

-22
трилистник фактор-1
TFF1

-21
ингибитор связывания ДНК-2
ID2

-14
белок теплового шока-70
HSP70

-10
циклин-зависимой киназы-2
CDK2

-9
циклин-D1
CCND1

-9
индуцируемого гипоксией фактор-1A
HIF1A

-9 <бр> рак молочной железы-1
BRCA1

-7
nucleostemin
NU

-7
циклин-зависимой киназы ингибитор-2A
CDKN2A /p16

-6
ингибитор связывания ДНК-4
ИД4

-6
engrailed-1
EN1

-5
АТФ-связывающего кассетного, подсемейство B, член 1
ABCB1

-3
MDM2 p53-связывающий белок
MDM2

-3
активируемых Гены <бр> инсулин-подобный фактор роста связывающий белок-3
IGFBP3

+40
фактор некроза опухоли-рецептор, связанный фактор-1
TRAF1

+20
трансмембранный андроген-индуцированной простаты протеин
TMEPAI

+10
фактор некроза опухоли, надсемейство член-10
TNFSF10

+8
B-клеточная лимфома 2 типа -1
BCL2L1

+7
бакуловирусную IAP повтор, содержащий 3-
BIRC3

+5
Гексокиназный-1
HK1
<бр

• Обнаружение гиперметилированием промотора острова CpG Е-кадгерина в желудочном сердца adenocarcinoma
• Изменения липидного профиля после радикальной резекции желудка у больных с желудочными cancer