Epstein-Barr-virus-specifik methylering af humane gener i gastriske cancerceller

Epstein-Barr virus-specifikke methylering af menneskelige gener i gastrisk kræftceller
Abstract
Baggrund
Epstein-Barr virus (EBV) er fundet i 10% af alle gastrisk adenokarcinom, men dens rolle i tumor udvikling og resterne vedligeholdelse uklar. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge EBV-medieret dysregulering af cellulære faktorer impliceret i gastrisk carcinogenese.
Metoder
Genekspression mønstre blev undersøgt i EBV-negative og EBV-positive AGS gastriske epitelceller ved hjælp af en lav microarray tæthed, revers transskription PCR, histokemiske pletter, og methylering-specifik DNA-sekventering. Ekspression af PTGS2 (COX2) blev målt i AGS celler og i primære gastrisk adenocarcinom væv.
Resultater
I array-undersøgelser, næsten halvdelen af ​​de 96 menneskelige gener testet, der repræsenterer 15 forskellige cancer-relaterede signaltransduktionsveje blev dysreguleret efter EBV infektion. Omvendt transskription PCR bekræftede betydelig indvirkning på faktorer af forskellig funktioner såsom cellecyklusregulering (IGFBP3
, CDKN2A, CCND1, HSP70, ID2, ID4)
, DNA-reparation (BRCA1, TFF1
), celleadhæsion ( ICAM1
), inflammation (COX2
), og angiogenese (HIF1A
). Demethylering hjælp 5-aza-2'-deoxycytidin vendt EBV-medieret dysregulering for alle 11 gener, der er anført her. For nogle promotorsekvenser, CpG ø metylering og demethylering forekom i en EBV-specifikke mønster som vist ved bisulfit DNA-sekventering. Immunhistokemi var mindre følsom end var western blot til detektering nedregulering af COX2 upon EBV infektion. Virus-relaterede dysregulering af COX2 niveauer in vitro
blev ikke blive gentaget vivo
blandt naturligt inficeret mavekræft væv.
Konklusioner
EBV ændrer menneskets genekspression på måder, der kan bidrage til den unikke Patobiologi virus -associeret cancer. Desuden hyppigheden og reversability af methylering-relaterede transkriptionelle forandringer tyder på, at demethylering agenter har terapeutisk potentiale til styring EBV-relaterede carcinom.
Baggrund
mavekræft er den fjerde mest almindelige form for kræft og den anden hyppigste årsag til kræft død på verdensplan [1]. En række genetiske ændringer samt infektionssygdomme og andre miljøskadelige stoffer synes at være faktorer i gastrisk carcinogenese. Epstein-Barr virus (EBV), et dobbeltstrenget DNA gammaherpesvirus, findes inden for de maligne celler i 10% af gastriske adenokarcinomer, og infektion synes at gå forud for malign transformation [2]. Grundlæggende og kliniske observationer tyder på, at EBV-associerede gastriske kræftformer har en anden Patobiologi fra EBV-negative gastriske kræft [3-8]. Rationelt design af virus-rettet behandling kræver en bedre forståelse af den patogene rolle EBV i gastrisk carcinogenese. Salg Tidligere undersøgelser har vist tab af tre kritiske tumorsuppressorgen produkter, CDH1 (E-cadherin), p73, og CDKN2A (p16 ), i EBV-inficerede gastriske cancere [9-18]. Virus-associeret methylering af disse gener, sammen med tegn på global DNA-methylering i EBV-positive kræftformer, tyder på, at EBV-relaterede gastriske cancere er en delmængde af CpG island methylator fænotype (CIMP) cancere [4, 11, 19-26]. En potentiel mediator er DNA methyltransferase 1 (DNMT1)
der er opreguleret i naturligt inficeret gastriske cancere og kunne bidrage til at etablere mønstre for methylering opformeres til datterceller ved celledeling [21, 27-29]. Igangværende undersøgelser er rettet mod at forstå den rolle, EBV og Helicobacter pylori infektion i forårsager betændelse og tilhørende globale hypermethylering under gastrisk udvikling af kræft [22].
I cellelinje modeller, DNMT1 overekspression medieres af EBV LMP1 og LMP2 [21, 28 -31]. EBV synes at ansætte epigenetiske mekanismer til styring af værten transkriptom samt at kontrollere ekspression af sine egne viralt kodede gener [11, 12, 14, 15, 19, 21, 24, 29, 32, 33]. Ved første infektion af en celle, kan den umethylerede virale genom undergå viral replikation med nye virion produktion, mens en delmængde af inficerede celler erhverver et stærkt methyleret virale genom, squelches ekspression af fremmede proteiner og medierer langsigtet viral persistens i form af latent infektion [23, 34]. Inficerede tumorer tendens til at have meget methylerede EBV DNA, og methylering-relaterede dæmpning af virale gener hjælper med at forklare, hvordan inficerede tumorer unddrage immun ødelæggelse.
Mens methylering af genpromotorer typisk er forbundet med transkriptionel nedregulering
via selektiv binding af repressorproteiner , den første protein nogensinde vist at binde og aktivere
en methyleret promotor var EBV BZLF1, den afgørende faktor styrer skiftet fra latent til replikative former for viral infektion [35]. Det fremgår, at virusset ødelagde har udviklet et middel til at overvinde promotor methylering til sin fordel [34, 35]. Antivirale strategier udforskes for deres antineoplastiske potentiale. Interessant, de mest almindeligt anvendte antivirale midler, acyclovir og ganciclovir, er effektive til at lukke viral replikation, men de fjerner ikke udtryk for latente og tidlige lytiske virale gener såsom LMP1, LMP2 og BZLF1.
De kliniske implikationer af EBV relaterede methylering af mavekræft genomet er enorme. Først ny dokumentation viser potentialet for forbedret diagnose af gastrisk cancer ved at teste gastriske vaskninger for cancerspecifikke methyleringsmønstre, måske i samråd med test for EBV at identificere virusinficerede delmængde af cancere [36-40]. Afvigende mønstre af promotor-methylering i virus-positive sammenlignet med virus-negative celler [11, 21, 24] understrege behovet for at karakterisere methyleringsmønstre på en måde, der maksimerer assay følsomhed til påvisning af kræft. Både infektion og ændret DNA methylering synes at være tidlige begivenheder i carcinogenese [2, 41], potentielt lette påvisning af forstadier til kræft i mave juice.
En anden klinisk implikation er potentialet for forbedret behandling af mavekræft bruge stoffer, der vende den virkning af promotor-hypermethylering [42, 43]. Især demethylering midler, der inhiberer DNA methyltransferase og reverse tumorsuppressorgen inaktivering eller onkogen aktivering er potentielle antineoplastiske strategier [43]. Der skal tages hensyn til eventuelle forskelle i effekten af ​​demethylere agenter i virus-positive versus
virus-negative tumorer [43-45]. Vi og andre har vist, at naturligt inficerede gastrisk kræft har lavere CDKN2A (p16) udtryk [14, 15]. I et klinisk forsøg med fluorouracil (5FU) for mavekræft, CDKN2A
promotor methylering status var en uafhængig prædiktor for overlevelse [46]. Begrundelsen for at bruge demethylere agenter ligesom 5-aza-2'-deoxycytidin i kliniske forsøg hviler på videnskabelige beviser for, at demethylering terapi ændrer tumorgene egenskaber kræftceller.
Adskillige forskere har med succes inficerede epiteliale cellelinjer med EBV i
vitro
[47, 48]. I den aktuelle undersøgelse blev EBV-positive og EBV-negative AGS gastriske cancerceller undersøgt for forskelle i genekspression mønstre ved hjælp lav massefylde microarray analyse og revers transkription polymerasekædereaktion (rtPCR). AGS er en cellelinie, der oprindeligt blev dyrket fra gastrisk adenocarcinom væv og nu er almindeligt anvendt som en model af gastrisk cancer. Rolle DNA-methylering ved mediering udvalgte effekter blev undersøgt ved bisulfit af DNA-sekventering og ved at teste evnen af ​​en demethyleringsmiddel at vende effekten af ​​EBV på gendæmpning. Resultaterne viste omfattende gen dysregulering ved EBV-infektion i AGS celler med beviser for, at promotor-methylering er ansvarlig, i det mindste delvis. Tilbageførsel af virus-associeret transkriptionelle virkninger tyder på, at demethylering agenter bør undersøges for deres potentiale til at styre væksten af ​​EBV-relaterede maligniteter.
Metoder
mavekræft cellelinjer
AGS mavekræft cellelinje (ATCC EF- referencelaboratoriet 1739) blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium indeholdende 10% føtalt bovint serum (varmeinaktiveret i 20 minutter ved 65 ° C) og 1% penicillin-streptomycin (10.000 enheder penicillin, 10.000 pg /ml streptomycin, Gibco, Carlsbad, CA) . Cellerne blev inficeret med en rekombinant EBV-stamme (en gave fra Dr. Henri J. Delecluse) [33, 49, 50], der blev manipuleret til at udtrykke grønt fluorescerende protein (GFP) og hygromycin B-resistens ved kloning disse gener i det prototypiske B95 0,8 stamme af EBV hvor den anden kopi af oriLyt normalt er bosiddende. Før infektion blev AGS-celler transficeret med 1 ug af en ekspressionsvektor der koder for CD21 (EBV receptor) og en puromycin-resistensgenet ved hjælp af Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN) som tidligere beskrevet [51]. Ved 48 timer efter transfektion blev celler indeholdende CD21 positivt udvælges til anvendelse af 0,5 ug /ml puromycin-HCI (Roche). Virale stamopløsninger af rekombinant EBV blev dannet i 293-celler, en human embryonisk epitelcellelinje, ved at inducere lytiske replikation ved anvendelse af 20 ng /ml phorbol 12-tetradecanoat 13-acetat og 3 mM butyrat. Supernatanter blev høstet 3 dage efter induktion, filtreret (0,8 uM), og nedfrosset ved -80 ° C indtil anvendelse. Puromycin-resistente AGS celler blev udpladet ved 50% af fuld densitet i 60-mm vævskulturskåle og co-inkuberet med 1 ml stock virioner. Fire dage senere blev EBV-inficerede AGS celler (nu kaldet AGS-B95-hygB) positivt selekteret med 100 ug /ml hygromycin B (Roche).
DNA fingeraftryk bekræftede, at AGS celler, der anvendes i denne undersøgelse matches genotype AGS celler i American Type Culture Collection. Fingeraftryk blev udført under anvendelse af PowerPlex 1,2 STR kit (Promega), efterfulgt af elektroforese på en ABI 310 kapillær-elektroforese instrument (Applied Biosystems).
Genekspression ved Histokemiske Stains
paraffinblokke blev fremstillet fra AGS og AGS-B95- hygB cellelinjer og paraffin blokke af primær gastrisk adenocarcinom blev hentet fra kliniske arkiver. De resterende kliniske prøver repræsenterer alle tilgængelige EBV-positive gastriske cancere (n = 9) samt et tilfældigt udvalg af EBV-negative gastriske cancere (n = 9). Histokemiske pletter blev påført på paraffinsnit at bekræfte infektion og vurdere genekspression. Til fremstilling blokke, blev dyrkede celler først skyllet i Dulbeccos phosphatbufret saltvand (Gibco, Invitrogen), høstet med 0,25% trypsin (Gibco, Invitrogen), viklet ind i et koagel ved hjælp Dade Ci-Trol koagulationskontrol (citreret) -Niveau 1 (Dade Behring, Marburg, Tyskland) og trombin 200 (Pacific Hemostasis, Middletown, VA), fikseret i 10% pufret formalin, indlejret i paraffin, og snit på behandlede objektglas.
EBER
in situ
hybridisering blev udført hjælp fluorescein-mærket EBER
sonde og oligo (d) T kontrol sonde på en Benchmark in situ
hybridisering systemet (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Immunohistokemiske pletter for EBV LMP1 og LMP2 proteiner blev udført som tidligere beskrevet [52] ved brug af citrat antigen-genvinding og CS1-4 cocktail af monoklonale museantistoffer mod LMP1 (1: 100, Dako, Capinteria, CA) og det monoklonale E411 rotte antistof mod LMP2 (1 mg /ml, Asencion, München, Tyskland). Paraffin sektioner af EBV-relaterede Hodgkins lymfom og post-transplantation lymfoproliferativ disorder tjente som positive kontroller
immunhistokemisk analyse af EBV replikative proteiner BMRF1 og BZLF1 blev udført ved hjælp af anti-BMRF1 klon G3-E31 ​​(1:. 200 fortynding, Research Diagnostics , Inc., Flanders, NJ) og anti-BZLF1 klon BZ.1 (1:25 fortynding, Dako, Carpinteria, CA), mens humant PTGS2 (i daglig tale navngivet cyclooxygenase-2, COX2) blev analyseret ved anvendelse af anti-COX2 monoklonalt antistof ( 1: 200 fortynding, Cayman Chemical). Snit blev inkuberet med primært antistof i 30 minutter ved 37 ° C til EBV-mål, eller ved 4 ° C natten over for COX2, ved hjælp af blokering og detektion protokollerne i Super-Sensitive Non Biotin HRP Detection Kit (Biogenex). Bundet antistof blev påvist under anvendelse af diaminobenzidin chromogen (Biogenex) og cellerne blev modfarvet med hematoxylin (Dako). Paraffinsnit af oral behåret leukoplakia tjente som en positiv kontrol for lytisk EBV, mens reaktiv tonsil og nasopharyngeale carcinomaceller væv fungerede som kontroller til COX2 pletter. Resultater blev fortolket ved mikroskopisk scoring af maligne celler i ≥10 felter ved 400x forstørrelse hvilket giver en gennemsnitlig andel score (0 = ingen, 1 = < 1%, 2 = 1-10%, 3 = 10-33%, 4 = 33 -66%, 5 = > 66% af celler) og intensitet score (0 = ingen, 1 = svag, 2 = mellemliggende, 3 = stærk farvning). Samlede score blev sammenlignet i EBV positive versus Salg negative tumorer under anvendelse af en Mann-Whitney uparret t-test.
Påvisning af EBV-genomet
Et batteri af kvantitativ real-time PCR (Q-PCR) assays målretning seks uensartede regioner af EBV-genomet, blev anvendt til at demonstrere, at viral infektion af AGS-celler var vellykket. Amplificerede produkter blev påvist ved anvendelse af ABI Prism 7500 Real-Time PCR instrument med Sequence Detection System software (Applied Biosystems) som beskrevet tidligere under anvendelse af primere rettet mod BamH1W
, EBNA1
, LMP1
, LMP2
, og BZLF1
regioner af EBV-genomet [52] eller EBER1
DNA [53]. For at kontrollere for amplikon kontaminering, hver run indeholdt mindst to "ingen skabelon" kontroller, hvor nuklease-fri H2O blev erstattet af skabelon.
Low-Density cDNA microarray analyse
RNA blev isoleret fra AGS og AGS-B95- hygB celler under anvendelse af RNeasy RNA Mini Kit (Qiagen) efter første brug af QiaShredder ™ spin-søjle (Qiagen) for at lysere cellerne. Efter bekræftelse RNA integritet ved hjælp af en Agilent Bioanalyzer blev udtryk microarray analyse udført af SABiosciences Corporation (Frederick, MD) ved hjælp af deres GEArray Q Series Menneskelig Signal transduktion i Cancer Gene Array. Denne lav densitet microarray består af 96 prober, som tester aktivering af 15 signaltransduktionsveje involveret i onkogenese. (Target transkripter er angivet i resultaterne.) Biotin-mærket cDNA fremstillet ud fra 10 ug af hver RNA-prøve ved anvendelse af AmpoLabeling-LPR-metoden (SABiosciences) blev hybridiseret til arrayet, og kemiluminescerende detektion blev udført ved anvendelse af et CCD-kamera. Integrerede rå intensitet værdier for hver plet blev genereret af GEArray Analysis Suite-software (SABiosciences), og yderligere analyse og normalisering blev udført ved hjælp af Microsoft Excel. Den laveste plet intensitetsværdi på hvert array blev betragtet som baggrund og blev trukket fra hvert rå intensitetsværdi for hver probe, og derefter spot intensiteter blev normaliseret til den for husholdning genet, glyceraldehydephosphate (GAPDH
). En parvise sammenligning af genekspression niveauer blev foretaget mellem EBV-positive celler (AGS-B95-hygB) og forældrenes EBV-negative AGS celler. Hvis forholdet var ≥2 eller ≤0.5 blev genet for at være opreguleret eller nedreguleret i inficerede celler.
SYBR Green Semikvantitativ rtPCR
at bekræfte valgte microarray genekspression resultater blev rtPCR udført med Real-Time RT <sup>2 genspecifikke PCR-primere (SABiosciences). Den ReactionReady ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (SABiosciences) blev anvendt til omdannelse af 3 ug af RNA til cDNA, og cDNA'et blev fortyndet 1:10 før PCR-analyse. De følgende 38 cDNA'er blev rettet: GAPDH, A2M, ABCB1, BCL2L1, BIRC1, BIRC2, BIRC3, EN1, GADD45, HIF1A, ID2, IGFBP3, BRCA1, TMEPAI, IRF1, BCL2, BMP4, CDKN2A (p16), FN1, HK1, ICAM1, IL2, CCND1, MDM2, COX2 (PTGS2), TFRC, WISP1, TRAF1, CDK2, VCAM1, CDKN2C (p18), CDKN1A (p21), DUSP1, HSP70, NFKB1, TNFSF10, TRIM25
, og FOSL1
. Reaktioner blev udført i et totalt volumen på 25 pi indeholdende 1X TaqMan ® Universal Mix (ABI), RT 2 genspecifik primer sæt mix (10 pM af hver primer, SABiosciences), 2,5 pi 5X SYBR green opløsning ( Molecular Probes, Eugene, OR) og 5 pi cDNA template. Termocykliseringsbetingelser var: 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 10 minutter, og 40 cykler ved 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minut på en ABI 7500 instrument med Sequence Detection System software (Applied Biosystems). Den samme grænse blev anvendt til hvert gen og plade evalueret af "Relativ Kvantificering Plate" protokol. Hver PCR-reaktion blev kørt tredobbelt for hver prøve på to separate plader med 96 brønde, og resultaterne blev midlet til bestemmelse relative forskelle i hver genets ekspressionsniveau i EBV-positive versus
EBV-negativ cellelinie.
Minor Groove Binding Probe Semikvantitativ rtPCR
at evaluere ekspressionen af ​​fem udvalgte gener, der ikke var på microarray beskrevet ovenfor, blev semikvantitative rtPCR analyser udført (analyser-on Demand, Applied Biosystems) ved hjælp af mindre groove-bindende sonder målrettet helicase-lignende transskription faktor (HLTF
), trefoil-faktor-1 (TFF1
), basisk-leucin-zipper ATF-lignende transskriptionsfaktor (BATF
), inhibitor af DNA-bindende protein-4 (ID4
), og nucleostemin (NU
). Disse fem blev udvalgt, fordi de angiveligt er dysreguleret i en væsentlig del af gastrisk adenokarcinom eller EBV-relaterede kræftformer [32, 54-59]. GAPDH
tjente som en endogen kontrol for relative kvantificering formål. RNA blev omdannet til cDNA under anvendelse af høj kapacitet cDNA Archive Kit (Applied Biosystems), og cDNA'et blev fortyndet 1:10 med nuclease-frit vand. Hver 50 uL PCR-reaktion indeholdt: 1X TaqMan ® Universal Master Mix, 1X Target Gene Expression analyse eller GAPDH
Endogen Kontrol mix, og 10 uL cDNA. For at kontrollere for amplikon forurening, alle udtryk assay på hver plade indeholdt mindst to "ingen skabelon" kontroller, hvor nuklease-frit vand blev erstattet af skabelon. Termocykliseringsbetingelser og dataanalyse var som beskrevet ovenfor for SYBR Green rtPCR.
Demethylering Behandling og Sekventering af bisulfit modificerede DNA
For at undersøge effekten af ​​demethylering, de AGS og AGS-B95-hygB gastrisk cancer cellelinjer var dyrket til 75% konfluens og derefter i tre på hinanden følgende dage 1 uM af frisk 5-aza-2'-deoxycytidin (5aza; Sigma) blev tilsat dagligt. På den fjerde dag blev RNA og DNA høstet fra behandlede og ubehandlede kulturer. RNA blev bedømt for genekspressionsniveauer, og DNA blev undersøgt for methylering efter natriumbisulfit behandling (EZ DNA-methylering Kit, Zymo Research, Orange, CA) til at konvertere ikke-methylerede cytosiner til uracil, og samtidig holde methylerede cytosiner uændret [60]. Den positive kontrol var CpGenome Universal Methyleret DNA (Chemicon) udsat for den samme omdannelse med bisulfit, og kontrol-primere rettet mod C8orf4
cellulære genpromotor bekræftede vellykket omdannelse med bisulfit af hver DNA-prøve [61]. CpG øer blev identificeret ved hjælp af CpG Grund for hver af fem menneskelige genes-- ICAM1
(RefSeq # NM_00201), CDKN2A (p16) Hotel (RefSeq # NM_000077.3), ID4
(RefSeq # NM_001546), COX2
(RefSeq # NM_000963), og TFF1
(RefSeq.225,2) - for hvilke promoter sekvenser (3000 basepar opstrøms for transkriptionsstartsitet gennem exon 1) blev hentet fra GenBank. Følgende parametre for CpG ø identifikation blev anvendt: længde på mindst 200 bp, minimum gennemsnitlige procentdel af C + G på 50%, og den gennemsnitlige forhold mellem observeret minimum forventes C + G på 0,6 [62]. For at identificere CpG tætte områder for COX2
og TFF1
blev den minimale parameter længde reduceret til 50 bp [61]. Primersekvenser er vist i tabel 1. Hver 50 gl PCR reaktion indeholdt: 1X PCR Buffer, 2 mM MgC <sub>2, 1 enhed Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad CA), 0,2 mM dNTP'er (ABI), og 30 pmol af hver primer. Termocykliseringsbetingelser var: 94 ° C i 2 minutter, 40 cykler ved 94 ° C i 30 sekunder, 55 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 1 minut, 72 ° C i 10 minutter. For at overvåge amplicon kontaminering, hver run indeholdt en "ingen skabelon" kontrol, hvor nuklease-frit vand blev erstattet af templateTable en bisulfit Omregnet Gene-specifik PCR Primer sekvenser
ICAM1

Forward
5'-TGG GGG TTG TGG TTT TAG TT-3 'myHotelVideo.com: Reverse
5'-CTC CCT CCA CTA AAA AC-3'
amplikonstørrelse
412 bp
CDKN2A (p16)
Forward
5'-AGA TGT TTT GTG GTT GTT GTG A-3 '
Reverse
5'-CAA AAA TCT TCC ATT CTT CAA AC -3 '
amplikonstørrelse
418 bp
ID4
Forward
5'-TTT TTT GGG TAT ATA TTA GTT TGG-3'
Reverse
5'-TAT CCT AAT CAC TCC CTT C-3 '
amplikonstørrelse
477 bp
COX2
Forward
5'-TAT GTG TTG TAT ATA GAG TAG A-3'
Reverse
5'-AAA AAA TAA TCC CCA CTC TC -3 '
amplikonstørrelse
399 bp
TFF1
Forward
5'-TTA GGT TGG AGT GTA GTA GG-3'
reverse
5'-CCT ACT CAT ATC TAA AAA ACC C-3 '
amplikonstørrelse
489 bp
C8orf4 kontrol
Forward
5'-GAA TTA AAA TAT AAG GAG AGT TTT-3 '
Reverse
5'-AAC ATT ACC CAA ACA TAA AAC AA-3'
amplikonstørrelse
328 bp
Sekventering blev udført på amplikoner af bisulfit-behandlet skabeloner til at identificere de methylerede og umethylerede CpG'er med eller uden 5aza behandling. Først blev hvert PCR-produkt klones ind i pGEM-T-vektor ved anvendelse af pGEM-T Easy Vector System II (Promega) og transformeret i JM109 højeffektive kompetente celler. Hvide kolonier indeholdende insertioner blev selekteret og dyrket natten over, og plasmid-DNA blev ekstraheret under anvendelse af Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). Sekventering blev udført på en ABI 3100 Genetic Analyzer ved hjælp af ABI PRISM ™ BigDye ™ Version 1.1 Terminator Cycle Ready Reaction Kit med AmpliTaq DNA Polymerase og en M13R3 primer. Resultaterne blev hentet ind Sequencher software (Gene Codes, Ann Arbor, MI) for at opnå den omvendte kompliment af hver sekvens, og fremadgående og tilbagegående sekvenser blev justeret og analyseret for at skelne umethylerede cytosiner fra methylerede cytosiner.
Western Blot på AGS cellelinje
på grund af risikoen for COX2-hæmmer til at overvinde COX2 effekter, RNA-baserede resultater for COX2 blev udvalgt til opfølgende undersøgelse på protein-niveau. Konfluente AGS-celler med eller uden EBV blev høstet med 0,25% trypsin, vasket to gange i phosphatbufret saltvand, og pelleteret ved centrifugering. Celler blev resuspenderet i 500 ul NP-40 cellelyse-buffer (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, 1% NP-40, pH 8,0), inkuberet på is i 30 minutter, og centrifugeret ved 12.000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C. Alikvoter af lysat (ved 50, 100, 150 ug protein pr brønd) blev løst under anvendelse af SDS-PAGE på en Tris-glycin 4-20% gradient gel (Invitrogen) og overført til en nitrocellulosemembran. COX2 blev påvist med et 1: 5000 fortynding af det monoklonale antistof efterfulgt af en 1: 10.000 fortynding af sekundært antistof konjugeret med alkalisk phosphatase (Amersham Biosciences), og visualisering med en Typhoon Phosphorlmager (Molecular Dynamics). Band tæthed målt semi-kvantitativt og normaliseret til beta actin (ACTB) blev sammenlignet mellem inficerede og ikke-inficerede AGS celler.
Resultater
EBV infektion af AGS mavekræft Cells
Vellykket EBV infektion af AGS gastrisk cancerceller blev bekræftet anvendelse af seks Q-PCR-assays rettet mod forskellige segmenter af EBV-genomet. EBER
in situ
hybridisering viste ingen EBER
udtryk i forældrenes "EBV-negative" AGS celler, mens mere end 90% af AGS-B95-hygB celler EBER
-positive og havde aktiveret -appearing cellekernemorfologi (figur 1). Spredningen blev forøget som vist ved sammenløbet af dyrkede AGS-B95-hygB celler tre dage før forældrenes AGS celler. Infektionen varet i mindst 4 måneder som vist ved GFP og EBER
histokemiske pletter. EBV latent (LMP1 og LMP2A) og lytiske (BZLF1 og BMRF1) proteiner blev ikke udtrykkes i ikke-inficerede AGS celler, mens ~ 10% af inficerede celler udtrykte LMP1, halvdelen af ​​cellerne udtrykte LMP2A, og ~ 35% udtrykt BMRF1 og BZLF1 proteiner indebærer aktiv viral replikation (figur 1). Figur 1 AGS-B95-hygB celler udtrykker latente og lytiske virale gener. A) Immunohistokemisk farvning for GFP antyder hygromycin B-behandlede AGS-celler blev ensartet inficeret af det konstruerede B95.8 EBV-genomet. B) EBER in situ
hybridisering indikerer latent infektion i > 90% af cellerne. Nuclear EBER
farvning skåner nucleoli, og forstørrede nukleoler er en markør for cellulær aktivering. Latent virusproteiner LMP1 (C) og LMP2 (D) blev udtrykt fokalt. Lytiske virale proteiner, BMRF1 (E) og BZLF1 (F), blev udtrykt i en betydelig del af AGS-B95-hygB celler. (GFP og BMRF1 pletter, 800X, LMP1, LMP2, EBER
og BZLF1 pletter, 1200X)
Cellular genekspression Forskelle i EBV-positive versus EBV-negative AGS Cells
Expression niveauer af 96 cellulære gener blev analyseret i AGS og AGS-B95-hygB celler under anvendelse lav densitet microarray analyse med kemiluminescerende detektion (figur 2). Efter normalisering til GAPDH
, parvise sammenligning af genekspressionsniveauer mellem EBV-positive og EBV-negative AGS celler viste, at af de 96 gener på microarray var 43 dysreguleret mindst to gange efter EBV infektion. Overraskende blev en EBV-associeret stigning i udtryk observeret for kun 6 gener (IGFBP3
, GADD45, IRF1, Grp78 /HSPB1, GLUT1 /SLC2A1, TMEPAI
), mens reduceret ekspression blev observeret for de resterende 37 dysregulerede gener (ABCB1, BCL2L1, BIRC2, BMP-2, CDKN2A, DUSP1, HIF1A, ICAM1, ID2, NFKB1, COX2, TFRC, VCAM1, WISP1, TRIM25, IL2, BMP4, MDM2, CCND1, CDK2, BAX, p57, p19, CSN2, CXCL9 , IL4, jun, KLK3, LTA, MMP7, PPARG, TNFRSF10B, WIG1, WNT2, PTCH2
). Figur 2 genekspressionsmønstre ændres med EBV infektion af AGS-celler. Biotin-mærket cDNA-prober array i fire eksemplarer på en nylonmembran hybridisere til RNA isoleret fra AGS og AGS-B95-hygB celler. Kemiluminescerende signaler indikerer dysregulering af udvalgte gener blandt de 96 på array'et sammenlignet med kontroldyr gener i de sidste to rækker.
SYBR Green rtPCR blev anvendt til at kontrollere resultaterne microarray for 26 af de dysregulerede gener og for 12 yderligere gener, hvor ingen blev observeret signifikant ændring på mikroarrayet. Større end to gange ændring i mRNA-niveauet i inficerede versus Salg uinficerede celler blev fundet for 16/26 gener (tabel 2). Generne stærkest berørte var IGFBP3 Hoteller, som blev opreguleret med 42-fold, og COX2, BMP4, og ICAM1 Hoteller, som blev nedreguleret ved 35-, 32-, og 22-gange. De resterende ti microarray-baserede ændringer blev ikke bekræftet af rtPCR, hvilket antyder, at EBV-relateret dysregulering af disse faktorer var lavere end to gange. I ét tilfælde var der en stor forskel: Ekspressionsniveauer af BCL2L1
ved microarray analyse viste en dobbelt nedgang
i inficerede celler, mens rtPCR gentagne gange viste en femdobling
i BCL2L1
mRNA niveauer i inficerede celler. Mindre dramatiske forskelle blev fundet, når yderligere 12 gener blev analyseret ved rtPCR, med signifikant (> 2-fold) ændringer fundet i ekspressionen af ​​5/12 gener ved hvilken der skete nogen ændring på mikroarrayet (tabel 2) .table 2 Gener dysreguleret i EBV-positive AGS celler
Gene Navn
Gene Symbol
Fold Skift *
nedreguleres Genes
grundlæggende leucin-zipper transskription faktor, ATF-lignende
BATF
-38
cyclooxygenase-2
COX2
-35
knoglemorfogent protein-4
BMP4
-32
intercellulært adhæsionsmolekyle-1
ICAM1
-22
trefoil faktor-1
TFF1
-21
hæmmer af DNA-binding-2
ID2
-14
varmeshockprotein-70
HSP70
-10
cyklin-afhængige kinase-2
CDK2
-9
cyklin-D1
CCND1
-9
hypoxi inducerbare faktor-1A
HIF1A
-9
brystkræft-1
BRCA1
-7
nucleostemin
NU
-7
cyklin-afhængige kinase inhibitor-2A
CDKN2A /P16
-6
hæmmer af DNA-binding-4
ID4
-6
Engrailed-1
EN1
-5
ATP-bindende kassette, sub-familie B, medlem 1
ABCB1
-3
MDM2 p53 protein
MDM2
-3
opreguleret Gener
insulin-lignende vækstfaktor bindende protein-3
IGFBP3
40
tumornekrosefaktorreceptor-associeret faktor-1
TRAF1
20
transmembrane prostata androgen-induceret protein
TMEPAI
10
tumornekrosefaktor, superfamilien medlem-10
TNFSF10
8
B-celle lymfom-2-lignende -1
BCL2L1
7
baculovirale IAP gentagelse indeholder-3
BIRC3
5
hexokinase-1
HK1</sub></sup>