De Epstein-Barr metilação de genes humanos em células de cancro gástrico específico do vírus

De Epstein-Barr de metilação específico do vírus de genes humanos em células de cancro gástrico
Resumo
fundo
vírus de Epstein-Barr (EBV) é encontrado em 10% de todos os adenocarcinomas gástricos, mas o seu papel no desenvolvimento tumoral e restos de manutenção claro. O objetivo deste estudo foi examinar a desregulação mediada por EBV de factores celulares implicados na carcinogênese gástrica.
Métodos
padrões de expressão gênica foram examinados em células gástricas AGS EBV positivos epiteliais utilizando um microarray de baixa densidade EBV-negativo e, PCR de transcrição reversa, manchas histoquímica, e sequenciamento de DNA específicos de metilação. Expressão de PTGS2 (COX2) foi medida em células AGS e em tecidos de adenocarcinoma gástrico primários.
Resultados
Em estudos de matriz, quase a metade dos 96 genes humanos testados, representando 15 diferentes vias de transdução de sinal relacionadas com o cancro, foram desregulados após a infecção por EBV. A transcrição reversa PCR confirmou impacto significativo sobre os fatores que têm diversas funções, tais como a regulação do ciclo celular (IGFBP3
, CDKN2A, CCND1, HSP70, ID2, ID4)
, reparo do DNA (BRCA1, TFF1
), adesão celular ( ICAM1
), inflamação (COX2
), e angiogênese (HIF1A
). A desmetilação utilizando 5-aza-2'-desoxicitidina inverteu a desregulação mediada por EBV para todos os 11 genes listados aqui. Para algumas sequências promotoras, CpG island methylation e desmetilação ocorreu num padrão específico do EBV como mostrado pela sequenciação do ADN com bissulfito. A imuno-histoquímica foi menos sensível do que foi western blot para detectar regulação negativa da COX2 sobre infecção por EBV. desregulação relacionadas com o vírus de níveis de COX2 in vitro
não foi retomados in vivo
entre os tecidos com cancro gástrico naturalmente infectados.
Conclusões
EBV altera a expressão do gene humano de formas que possam contribuir para o pathobiology única de vírus cancer -associated. Além disso, a frequência ea reversibilidade das alterações de transcrição relacionados com a metilação sugerem que os agentes Desmetilantes tem potencial terapêutico para o gerenciamento de carcinoma relacionadas com EBV.
Fundo
O câncer gástrico é o quarto tipo de câncer mais comum ea segunda principal causa de câncer morte em todo o mundo [1]. Uma variedade de alterações genéticas, bem como agentes ambientais infecciosas e outros parecem ser factores na carcinogénese gástrica. vírus de Epstein-Barr (EBV), um gammaherpesvirus ADN de cadeia dupla, é encontrado no interior das células malignas em 10% de adenocarcinomas gástricos, e infecção parece preceder a transformação maligna [2]. observações básicas e clínicas sugerem que os cancros gástricos associadas a EBV têm um pathobiology diferente de cancros gástricos EBV-negativos [3-8]. desenho racional de terapia dirigida por vírus requer uma melhor compreensão do papel patogênico do EBV na carcinogênese gástrica.
estudos anteriores mostraram perda de três produtos críticos gene supressor de tumor, CDH1 (caderina-E), p73, e CDKN2A (p16 ), em cancros gástricos infectadas com EBV [9-18]. metilação desses genes, juntamente com provas de metilação global do DNA em cancros EBV-positiva associada ao vírus, sugere que os cancros gástricos relacionados com o EBV é um subconjunto de (CIMP) cancros ilha CpG methylator fenótipo [4, 11, 19-26]. Um mediador potencial é DNA metiltransferase 1 (DNMT1)
que é regulada positivamente em cancros gástricos naturalmente infectados e poderia ajudar a estabelecer padrões de metilação propagadas para as células filhas sobre a divisão celular [21, 27-29]. Estudos em andamento visam a compreensão do papel da infecção por EBV e Helicobacter pylori em causar inflamação e hipermetilação globais associados durante o desenvolvimento do câncer gástrico [22].
Em modelos da linha celular, DNMT1 superexpressão é mediada por EBV LMP1 e LMP2 [21, 28 -31]. EBV parece empregar mecanismos epigenética para controlar o transcriptoma do hospedeiro e também para controlar a expressão das suas próprias genes codificadas viralmente [11, 12, 14, 15, 19, 21, 24, 29, 32, 33]. Após a infecção inicial de uma célula, o genoma virai não metilado pode sofrer replicação viral com a nova produção do virião, enquanto que um subconjunto de células infectadas adquirir um genoma viral altamente metilada que silencia a expressão de proteínas estranhas e medeia a persistência virai a longo prazo por meio da infecção latente [23, 34]. tumores infectadas tendem a ter DNA de EBV altamente metilada, e silenciamento relacionada-metilação de genes virais ajuda a explicar como tumores infectados evadir destruição imunitária.
Enquanto metilação de promotores de genes é tipicamente associada com regulação negativa da transcrição
através de ligação selectiva das proteínas repressoras , a primeira proteína já mostrou ligar-se e activar
um promotor metilado foi EBV BZLF1, o fator chave controlando a passagem de latente para formas replicativas de infecção viral [35]. Parece que o vírus tem evoluído inteligentemente um meio de superar metilação do promotor para a sua vantagem [34, 35]. estratégias antivirais estão a ser explorados para a sua potencial antineoplásico. Curiosamente, os agentes antivirais mais comumente usados, aciclovir e ganciclovir, são eficazes para desligar a replicação viral, mas não eliminam a expressão de genes virais líticas latentes e precoces, como LMP1, LMP2 e BZLF1.
As implicações clínicas de EBV metilação relacionados do genoma do câncer gástrico são imensas. Em primeiro lugar, a evidência emergente mostra o potencial para melhorar o diagnóstico de cancro gástrico, testando lavagens gástricas para padrões de metilação específico do cancerosas, talvez em conjunto com ensaios para o EBV para identificar o subconjunto infectadas com vírus de cancros [36-40]. Diferentes padrões de metilação do promotor de vírus-positivos em comparação com as células do vírus-negativo [11, 21, 24] enfatizam a necessidade de caracterizar os padrões de metilação de uma forma que que maximiza a sensibilidade do ensaio para a detecção de câncer. Tanto a infecção e metilação do DNA alterado parecem ser os primeiros eventos na carcinogênese [2, 41], a detecção potencialmente facilitando das lesões pré-cancerosas no suco gástrico.
Uma segunda implicação clínica é o potencial para melhorar o tratamento de câncer de usar drogas gástricos que reverter a efeito da hipermetilação do promotor [42, 43]. Em particular, os agentes que inibem, de desmetilação metiltransferase de ADN e supressora de tumores reverter o silenciamento do gene ou de activação de oncogenes são estratégias antineoplásicos potenciais [43]. Deve-se considerar a possíveis diferenças no efeito de agentes demetilantes no vírus-positivos contra tumores de vírus-negativo
[43-45]. Nós e outros mostraram que o câncer gástrico naturalmente infectados têm CDKN2A inferior (p16) expressão [14, 15]. Em um ensaio clínico de fluorouracil (5-FU) para câncer gástrico, CDKN2A
estado de metilação do promotor foi um preditor independente de sobrevivência [46]. A lógica para a utilização de agentes demetilantes como 5-aza-2'-desoxicitidina em ensaios clínicos repousa sobre evidências científicas que desmetilação terapia modifica as propriedades tumorigénicas das células cancerosas.
Vários investigadores têm linhas de células epiteliais com sucesso infectados com EBV em
vitro
[47, 48]. No presente estudo, as células cancerosas gástricas AGS EBV-negativo EBV-positivo e foram examinadas as diferenças de padrões de expressão gênica usando análise de microarray de baixa densidade e transcrição reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) reversa. AGS é uma linha celular que foi originalmente cultivado a partir de tecido de adenocarcinoma gástrico e agora é amplamente usado como um modelo do cancro gástrico. O papel da metilação do DNA na mediação de efeitos seleccionados foram examinados por sequenciação de ADN com bissulfito e testando a capacidade de um agente de desmetilação para reverter o efeito de EBV no silenciamento do gene. Os resultados revelaram extensa desregulação gênica após infecção EBV nas células AGS com evidências de que a metilação do promotor é responsável, pelo menos em parte. Reversão dos efeitos de transcrição associados a vírus sugere que os agentes Desmetilantes devem ser explorados por seu potencial para controlar o crescimento de tumores malignos relacionados com EBV.
Métodos
linhas celulares de cancro gástrico
A linhagem de células de câncer gástrico AGS (ATCC CRL- 1739) foi cultivada em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco contendo 10% de soro fetal de bovino (inactivado pelo calor durante 20 minutos a 65 ° C) e 1% de penicilina-estreptomicina (10.000 unidades de penicilina, 10.000 ug /ml de estreptomicina, Gibco, Carlsbad, CA) . As células foram infectadas com uma estirpe recombinante de EBV (uma oferta do Dr. J. Henri Delecluse) [33, 49, 50] que foi manipulada para expressar a proteína de fluorescência verde (GFP) e de resistência à higromicina B, clonando os genes em B95 prototípico 0,8 estirpe de EBV, onde a segunda cópia do oriLyt normalmente reside. Antes da infecção, as células foram transfectadas com AGS 1 ug de um vector de expressão que codifica CD21 (o receptor de EBV) e um gene de resistência à puromicina, utilizando Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN), como descrito anteriormente [51]. Às 48 horas pós-transfecção, as células contendo o CD21 foram seleccionadas positivamente para utilizando 0,5 ug /mL de puromicina-HCl (Roche). estoques virais de EBV recombinante foram gerados em células de rim 293, uma linha celular epitelial humana embrionária, através da indução de replicação lítica utilizando 20 ng /mL de forbol 12-tetradecanoato de etilo e 13-butirato de 3 mm. Os sobrenadantes foram recolhidos 3 dias depois da indução, filtrado (0,8 um), e congeladas a -80 ° C até à sua utilização. células AGS puromicina-resistentes foram plaqueadas a 50% de densidade total em pratos de cultura de tecidos de 60 mm e co-incubados com 1 ml de viriões de banco. Quatro dias mais tarde, as células infectadas com EBV AGS (agora chamado de AGS-B95-HygB) foram seleccionadas positivamente com 100 ug /ml de higromicina B (Roche). DNA fingerprinting
confirmou que as células AGS utilizados neste estudo correspondeu ao genótipo de células AGS na American Type Culture Collection. Fingerprinting foi feito utilizando o kit de STR PowerPlex 1,2 (Promega) seguido por electroforese num instrumento 310 capilar de electroforese em gel ABI (Applied Biosystems).
Gene Expression por histoquímicos Stains
Os blocos de parafina foram preparados a partir de AGS e AGS-B95- linhas celulares HygB e blocos de parafina de adenocarcinoma gástrico primário foram recuperados a partir de arquivos clínicos. As amostras clínicas residuais representam todos os cânceres disponíveis EBV positivos gástricas (n = 9) e uma selecção de cancros gástricos EBV-negativo (n = 9). manchas histoquímica foram aplicadas a secções de parafina para confirmar a infecção e avaliar a expressão gênica. Para preparar blocos, as células cultivadas foram lavadas primeiro em fosfato salino de Dulbecco tamponado (Gibco, Invitrogen), colhidas com tripsina a 0,25% (Gibco, Invitrogen), enredados em um coágulo utilizando Dade Ci-Trol controle da coagulação (citratado) -Level 1 (Dade Behring, Marburg, Alemanha) e trombina 200 (Pacific Hemostasis, Middletown, VA), fixado em 10% de formalina tamponada, embebidos em parafina, seccionados e em lâminas revestidas.
EBER
in situ
hibridação foi realizada usando EBER
sonda marcada com fluoresceína e sonda oligo (d) de controlo T em um benchmark in situ
sistema de hibridação (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). manchas de imuno-histoquímica para as proteínas EBV LMP1 e LMP2 foram realizados como previamente descrito [52] usando a recuperação citrato de antigénio e o cocktail CS1-4 de anticorpos monoclonais de ratinho contra LMP1 (1: 100, Dako, capinteria, CA) e o anticorpo monoclonal de rato contra E411 LMP2 (1 mg /ml, Asencion, Munique, Alemanha). As secções de parafina de linfoma Hodgkin relacionados com EBV e doença linfoproliferativa pós-transplante serviram como controlos positivos
análise imuno-histoquímica das proteínas replicativas EBV BMRF1 e BZLF1 foi realizada utilizando-E31 G3 clone anti-BMRF1 (1:. diluição 200, Research Diagnostics , Inc., Flanders, NJ) e anti-BZLF1 BZ.1 clone (diluição 1:25, DAKO, Carpinteria, CA), enquanto PTGS2 humano (coloquialmente chamada ciclooxigenase-2, COX2) foi ensaiada utilizando anticorpo monoclonal anti-COX2 ( 1: 200 de diluição, Cayman Chemical). As secções foram incubadas com anticorpo primário durante 30 minutos a 37 ° C durante os alvos EBV, ou a 4 ° C durante a noite para COX2, usando os protocolos de bloqueio e de detecção da biotina com HRP de Detecção Kit super-sensíveis não (Biogenex). O anticorpo ligado foi detectado usando o cromogénio diaminobenzidina (Biogenex) e as células foram contrastadas com hematoxilina (DAKO). As secções de parafina de leucoplasia pilosa oral serviu como um controle positivo para EBV lítico, enquanto amígdalas reativa e tecidos de carcinoma da nasofaringe serviram como controle de manchas COX2. Os resultados foram interpretados por pontuação microscópica de células malignas em ≥10 campos com aumento de 400x produzindo uma pontuação média proporção (0 = nenhum, 1 = < 1%, 2 = 1-10%, 3 = 10-33%, 4 = 33 -66%, 5 = > 66% das células) e escore de intensidade (0 = nenhum, 1 = fraco, 2 = intermediária, 3 = forte coloração). Os escores totais foram comparados em EBV positiva em relação
tumores negativos utilizando um teste t não pareado Mann-Whitney.
Detecção do genoma EBV
Uma bateria de PCR ensaios quantitativa em tempo real (Q-PCR) visando seis díspares regiões do genoma do EBV foi utilizado para demonstrar que a infecção virai de células AGS foi bem-sucedida. Os produtos amplificados foram detectados utilizando o instrumento ABI Prism 7500 Real-Time PCR com o software Sistema de Detecção de Sequência (Applied Biosystems), como descrito anteriormente usando primers visando o BamH1W
, EBNA1
, LMP1
, LMP2
, e BZLF1
regiões do genoma do EBV [52] ou EBER1
ADN [53]. Para verificar se há contaminação amplicon, cada corrida continha pelo menos dois "nenhum modelo" controles em que H2O livre de nuclease foi substituído por modelo.
Low-Density cDNA Microarray Analysis
RNA foi isolado a partir AGS e AGS-B95- HygB células utilizando o RNeasy Mini Kit RNA (Qiagen), após a primeira utilização da coluna de spin QiaShredder ™ (Qiagen) para lisar as células. Após a confirmação de integridade do RNA usando um Agilent Bioanalyzer, análise de expressão microarray foi realizada por SABiosciences Corporation (Frederick, MD) usando sua GEArray Q Series Transdução de Sinais humana na Cancer Gene Matriz. Este microarray de baixa densidade é constituída por 96 sondas que testam a activação das vias de transdução de sinal de 15 envolvidas na oncogênese. (transcritos alvo são listados nos resultados.) de cDNA marcado com biotina preparados a partir de 10 ug de cada amostra de RNA usando o método AmpoLabeling-LPR (SABiosciences) foi hibridado com a matriz, e a detecção de quimioluminescência foi realizada utilizando uma câmara CCD. valores de intensidade de matérias integradas para cada local foram gerados pelo software GEArray Análise Suite (SABiosciences), e análise posterior e normalização foi realizada usando o Microsoft Excel. O valor mais baixo de intensidade da mancha em cada matriz foi considerado como plano de fundo e foi subtraída de cada valor de intensidade para cada matéria-sonda, e em seguida, no local intensidades foram normalizadas para que o gene de arrumação, desidrogenase glyceraldehydephosphate (GAPDH
). Foi efectuada uma comparação par a par de níveis de expressão do gene entre as células EBV-positiva (AGS-B95-HygB) e células negativas para EBV AGS parentais. Se a proporção era de ≥2 ou ≤0.5, o gene foi considerado para ser regulada positivamente ou regulados negativamente em células infectadas.
SYBR Green semiquantitativa RT-PCR
Para confirmar os resultados de microarray seleccionado de expressão de genes, utilizando RT-PCR foi realizada em tempo real de RT 2 iniciadores de PCR específico do gene (SABiosciences). O Kit ™ ReactionReady First Strand cDNA Synthesis (SABiosciences) foi utilizado para converter 3 ug de ARN em ADNc, e o ADNc foi diluída 1:10, antes de análise por PCR. Os 38 cDNAs seguintes foram alvo: GAPDH, A2M, ABCB1, BCL2L1, BIRC1, BIRC2, BIRC3, EN1, GADD45, HIF1A, ID2, IGFBP3, BRCA1, TMEPAI, IRF1, BCL2, BMP4, CDKN2A (p16), FN1, HK1, ICAM1, IL2, CCND1, MDM2, COX2 (PTGS2), TFRC, WISP1, TRAF1, CDK2, VCAM1, CDKN2C (p18), CDKN1A (p21), DUSP1, HSP70, NFKB1, TNFSF10, TRIM25
e FOSL1
. As reacções foram realizadas num volume total de 25 uL contendo 1X TaqMan ® Universal Mix (ABI), RT 2 mistura conjunto de iniciadores específicos do gene (10

• Detecção de hipermetilação do promotor da ilha CpG de E-caderina em Detecção adenocarcinoma
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