Epstein-Barr-virus-specific metylaation ihmisen geenien mahasyövässä cells

Epstein-Barr-virus-specific metylaation ihmisen geenien mahasyövässä soluissa
tiivistelmä
tausta
Epstein-Barrin virus (EBV) on todettu 10 % kaikista mahalaukun adenokarsinooman mutta sen roolia kasvainten kehittymiseen ja ylläpitoon jää epäselväksi. Tavoitteena tätä oli tutkia EBV välittämää dysregulation solutekijöiden osallisina mahasyövän. Tool Menetelmät
geeniekspressiomalleja tutkittiin EBV-negatiivisia ja EBV-positiivisten AGS mahalaukun epiteelisolujen käyttäen alhaisen tiheyden microarray, käänteistranskriptio-PCR, histokemialliset tahroja, ja metylaatiospesifistä DNA-sekvensoinnilla. Expression of PTGS2 (COX2) mitattiin AGS soluissa ja primaarisissa mahalaukun adenokarsinooman kudoksissa.
Tulokset
array tutkimuksissa lähes puolet 96 ihmisen geenien testattu, jotka edustavat 15 eri syöpään liittyvien signaalintransduktioreitteihin, oli väärin säädellystä jälkeen EBV-infektio. Käänteinen transkriptio-PCR vahvisti merkittävä vaikutus tekijöistä, myös eri toimintoihin, kuten solukierron säätelyssä (IGFBP3
, CDKN2A, CCND1, HSP70, ID2, ID4) B, DNA korjaus (BRCA1, TFF1
), soluadheesiota ( ICAM1
), tulehdus (COX2
), ja angiogeneesin (HF1A
). Demetylaatio käyttäen 5-atsa-2'-deoksisytidiinin päinvastaiseksi EBV välittämää säätelyhäiriötä kaikille 11 geenien lueteltu tässä. Joillekin promoottorisekvenssejä, CpG-saarekkeen metylaation ja demetylaatio tapahtui EBV-tietty kuvio, kuten on esitetty bisulfiitti DNA-sekvensoinnilla. Immunohistokemia oli vähemmän herkkä kuin oli western blot havaitsemiseksi downregulation COX2 kun EBV-infektio. Virus liittyviä häiriöstä COX2 tasoja in vitro
ei toisteta vivo
joukossa luonnollisesti tartunnan mahasyövässä kudoksiin.
Johtopäätökset
EBV muuttaa ihmisen geenien ilmentymistä tavalla, joka voisi myötävaikuttaa ainutlaatuinen patobiologian viruksen -associated syöpä. Lisäksi, taajuus ja reversability metylaation liittyvät transkription muutokset viittaavat siihen, että demetyloidaan aineilla on terapeuttista potentiaalia hallintaan EBV-liittyvät karsinooma.
Tausta
Mahalaukun syöpä on neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syöpään kuoleman maailmanlaajuisesti [1]. Erilaisia ​​geneettisiä muutoksia sekä tautien ja muiden ympäristötekijöiden, näyttävät olevan tekijöitä mahasyövän. Epstein-Barr-virus (EBV), joka on kaksisäikeinen DNA gammaherpesvirus, tavataan pahanlaatuisia soluja 10% mahalaukun adenokarsinoomien, ja infektio vaikuttaa ennen pahanlaatuisiksi [2]. Perus- ja kliiniset havainnot viittaavat siihen, että EBV: hen liittyvien syöpien on erilainen patobiologian EBV-negatiivinen mahasyövistä [3-8]. Rationaalisen suunnittelun virus-suunnattu hoito vaatii parempaa ymmärtämistä patogeeninen rooli EBV mahasyövän.
Ennen tutkimukset ovat osoittaneet menetys kolme kriittistä tuumorisuppressorigeenin tuotteet, CDH1 (E-kadheriinin), p73, ja CDKN2A (p16 ), EBV-tartunnan mahasyövistä [9-18]. Virus-liittyvä metylaatio näistä geeneistä, sekä todisteet maailmanlaajuisten DNA: n metylaation EBV-positiivisten syöpiä, viittaa siihen, että EBV liittyvien syöpien ovat osajoukko CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP) syövät [4, 11, 19-26]. Mahdollinen sovittelija on DNA metyylitransferaasi 1 (DNMT1) B, joka on yliaktiivista luonnollisesti tartunnan syöpien ja voisi auttaa luomaan metylaation leviä tytärsoluksi upon solunjakautumisen [21, 27-29]. Käynnissä tutkimuksia pyritään ymmärtämään rooli EBV ja helikobakteeri-infektion tulehduksen ja siihen liittyvien maailmanlaajuisten hypermetylaation aikana mahasyöpä kehitys [22].
Solulinjan malleissa DNMT1 yliekspressio välittyy EBV LMP1 ja lmp2 [21, 28 -31]. EBV näyttää käyttää epigeneettisiä mekanismeja ohjata isäntä transcriptome ja myös ekspression säätelemiseksi omaa viruksen koodaaman geenejä [11, 12, 14, 15, 19, 21, 24, 29, 32, 33]. Kun alkuperäinen infektio solun, metyloitumattomalla viruksen genomi voi tapahtua virusreplikaatiota uuden virionin tuotantoon, kun taas osajoukko infektoitujen solujen hankkia erittäin metyloitua virusgenomin että squelches vieraiden proteiinien ilmentämistä ja välittää pitkän aikavälin viruksen pysyvyys tavalla piilevä infektio [23, 34]. Tartunnan kasvaimet ovat yleensä erittäin metyloitua EBV-DNA ja metylointi liittyvät hiljentäminen virusgeenien auttaa selittämään, kuinka tartunta-kasvaimia kiertää immuunijärjestelmän tuhoa.
Vaikka metylaatio geenin promoottorit on tyypillisesti liittyy transkription downregulation
kautta selektiivinen sitominen repressoriproteiinit , ensimmäinen proteiini koskaan osoitettu sitoa ja aktivoida
metyloitua promoottori oli EBV BZLF1, keskeinen tekijä, joka säätelee siirtymistä piilevä replikatiivisten muotojen virusinfektion [35]. Vaikuttaa siltä, ​​että virus on taitavasti kehittynyt keino voittaa promoottorin metylaation edukseen [34, 35]. Antiviraalinen strategioita tutkitaan niiden antineoplastisten potentiaalia. Mielenkiintoista, yleisimmin käytetty antiviraalisia aineita, asikloviiri ja gansikloviiri, ovat tehokkaita sammuttamista virusreplikaation mutta ne eivät poista ilmaus piilevä ja varhaisen lyyttisiä viruksen geenejä, kuten LMP1, lmp2 ja BZLF1.
Kliininen merkitys EBV- liittyvä metylaatio mahasyövän genomin ovat valtavat. Ensinnäkin kehittyvien todisteet osoittavat mahdollisuudet parantaa diagnoosin mahalaukun syövän testaamalla mahalaukun pesee syöpäspesifisessä metylaatiovyöhykkeiden, ehkä yhteistuumin testien EBV tunnistamaan virus-tartunnan osajoukko syöpien [36-40]. Erilaiset kuviot promoottorin metylaation viruksen-positiivisia verrattuna virus-negatiivisia soluja [11, 21, 24], korostaa tarvetta luonnehtia metylaatiovyöhykkeiden tavalla, joka maksimoi määrityksen herkkyyden syövän havaitsemiseen. Sekä infektio ja muuttuneen DNA: n metylaatio näyttävät olevan aikaisin tapahtumien karsinogeneesissä [2, 41], mahdollisesti helpottaa havaitsemista syövän esiasteita vatsaan mehua.
Toinen kliininen seuraus on mahdollisuudet parantaa hoitoon mahasyövän käyttää lääkkeitä, jotka kääntää vaikutus promoottorin hypermetylaatio [42, 43]. Erityisesti demetyloimalla aineita, jotka estävät DNA metyylitransferaasi ja kääntää tuumorisuppressorigeeniä hiljentäminen tai onkogeeni aktivointi ovat potentiaalisia antineoplastiset strategioita [43]. Huomiota on kiinnitettävä mahdollisiin eroihin vaikutusta demetyloiva aineiden virus-positiivisten vs.
virus-syöpäkasvain [43-45]. Me ja muut ovat osoittaneet, että luontaisesti tartunnan mahasyövistä pienemmät CDKN2A (p16) lauseke [14, 15]. Kliinisessä tutkimuksessa fluorourasiilin (5FU) mahasyövän, CDKN2A
promoottori metylaatiostatuksen oli itsenäinen ennustaja selviytymisen [46]. Perusteet käyttäen demetyloivan aineita, kuten 5-atsa-2'-deoksisytidiini kliinisissä kokeissa perustuu tieteellistä näyttöä siitä demetyloimalla terapia muuttaa kasvaimia ominaisuuksia syöpäsoluja.
Useat tutkijat ovat onnistuneet infektoituneen epiteelisolujen radoilla EBV
vitro
[47, 48]. Esillä olevassa tutkimuksessa, EBV-positiiviset ja EBV-negatiivinen AGS mahasyövän soluja tutkittiin eroja geeniekspressiomalleja käyttäen LD-microarray-analyysi ja RT-PCR (rtPCR). AGS on solulinja, joka oli alun perin kasvanut mahalaukun adenokarsinooman kudoksesta ja nyt on laajalti käytetty mallina mahasyövän. Rooli DNA: n metylaation välittämisessä valittu vaikutuksia tutkittiin bisulfiitti DNA sekvensointi ja testaamalla kyky demetyloivan agentti kääntää vaikutus EBV on geenien. Tulokset paljastivat laajan geeni säätelyhäiriötä upon EBV infektion AGS solujen todisteita siitä, että promoottori metylaatio on vastuussa, ainakin osittain. Käänteinen virus liittyvä transkription vaikutuksia viittaa siihen, että demetyloidaan aineet olisi tutkittava niiden mahdollisuuksia hallita kasvua EBV liittyvien syöpäsairauksia. Tool Menetelmät
mahasyövän Solulinjat
AGS mahasyöpä solulinja (ATCC CRL- 1739) viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (lämpöinaktivoitu 20 minuuttia 65 ° C: ssa) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (10000 yksikköä penisilliiniä, 10000 ug /ml streptomysiiniä, Gibco, Carlsbad, CA) . Solut infektoitiin yhdistelmä-EBV-kannan (lahja tri Henri J. DELECLUSE) [33, 49, 50], joka oli suunniteltu ilmaisemaan vihreää fluoresoivaa proteiinia (GFP) ja hygromysiini B vastus kloonaamalla nämä geenejä prototyyppinä B95 0,8 kanta EBV jossa toinen kopio oriLyt normaalisti asuu. Ennen infektiota, AGS solut transfektoitiin 1 ug: lla ekspressiovektoria, joka koodaa CD21 (EBV-reseptori) ja puromysiiniresistenssigeenin käyttämällä Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN), kuten aiemmin on kuvattu [51]. 48 tuntia transfektion jälkeen, solut, jotka sisältävät CD21 valittiin positiivisesti ja käyttäen 0,5 ug /ml puromysiiniä-HCI: a (Roche). Viruksen varastot rekombinantti EBV syntyi munuaisen 293-solut, ihmisen alkion epiteelisolulinja, indusoimalla lyyttisen replikaation käyttäen 20 ng /ml forboli-12--tetradekanoaatti-13-asetaattia, ja 3 mM butyraattia. Supernatantit kerättiin 3 päivää induktion jälkeen, suodatettiin (0,8 uM), ja jäädytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Puromysiiniresistenttiä AGS solut maljattiin 50% täydestä tiheys 60 mm kudosviljelymaljoille ja co-inkuboitiin 1 ml varastossa virionien. Neljä päivää myöhemmin, EBV-tartunnan AGS soluja (kutsutaan nyt AGS-B95-hygB) valittiin positiivisesti 100 ug /ml hygromysiini B (Roche).
DNA-sormenjälkien vahvisti, että AGS soluja käytetään tässä tutkimuksessa Hyväksytty genotyyppi AGS solut American Type Culture Collection. Sormenjälkien tehtiin käyttäen PowerPlex 1,2 STR kit (Promega), jota seurasi elektroforeesi ABI 310 kapillaari- geelielektroforeesilla väline (Applied Biosystems).
Geenin ekspressio Histochemical Stains
parafiini lohkot valmistettiin AGS ja AGS-B95- hygB solulinjat, ja parafiiniblokit ensisijaisen mahalaukun adenokarsinooman haettiin kliinisen arkistoista. Jäljelle jäänyt kliinisistä näytteistä edustaa kaikkia käytettävissä EBV positiivinen mahasyöpä (n = 9) ja satunnaisessa EBV-negatiivisten syöpien (n = 9). Histokemiallinen tahroja sovellettiin parafiinileikkeillä vahvistaa tartunnan ja arvioida geenien ilmentymisen. Valmistella lohkot, viljellyt solut huuhdeltiin ensin Dulbeccon fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (Gibco, Invitrogen), korjattu 0,25% trypsiiniä (Gibco, Invitrogen), enmeshed hyytymän käyttäen Dade Ci-Trol Coagulation ohjaus (sitratoidussa) Tason 1 (Dade Behring, Marburg, Saksa) ja Trombiini 200 (Pacific Hemostasis, Middletown, VA), kiinnitettiin 10% puskuroituun formaliiniin, valettiin parafiiniin ja leikattiin pinnoitetulle liukuu.
eber
in situ
hybridisointi toteutettiin käyttämällä fluoreskeiinileimattu Eber
koetin ja oligo (d) T kontrollikoettimen on Benchmark in situ
hybridisaatiosysteemiä (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Immunohistokemiallinen värjäys EBV LMP1 ja LMP2 proteiinit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [52] käyttämällä sitraattia antigeenin haku ja CS1-4 cocktail hiiren monoklonaalisia vasta-aineita LMP1 (1: 100, Dako, Capinteria, CA) ja E411 rotan monoklonaalinen vasta-aine lmp2 (1 mg /ml, Asencion, Munich, Saksa). Parafiinisektioista EBV liittyvien Hodgkinin lymfooma ja elinsiirron jälkeinen lymfoproliferatiivinen häiriö toimi positiivisena kontrollina.
Immunohistokemiallinen analyysi EBV replikatiivista proteiinit BMRF1 ja BZLF1 suoritettiin käyttäen anti-BMRF1 klooni G3-E31 ​​(1: 200 laimennus, Research Diagnostics , Inc., Flanders, NJ) ja anti-BZLF1 klooni BZ.1 (1:25 laimennus, Dako, Carpinteria, CA), kun taas ihmisen PTGS2 (puhekielessä nimeltään COX-2, COX2) määritettiin käyttäen anti-COX2 monoklonaalinen vasta-aine ( 1: 200 laimennus, Cayman Chemical). Leikkeitä inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineen 30 minuuttia 37 ° C: ssa EBV tavoitteita, tai 4 ° C yön yli COX2 käyttämällä esto ja havaitseminen protokollat ​​Super-Sensitive Non Biotin HRP Detection Kit (Biogenex). Sitoutunut vasta-aine havaittiin käyttäen diaminobentsidiiniä kromogeenilla (Biogenex) ja solut vastavärjättiin hematoksyliinillä (Dako). Parafiinisektioista suun karvainen leukoplakia toimi positiivisena kontrollina lyyttisen EBV, kun taas reaktiiviset nielurisojen ja nenänielun karsinooma kudosten toimi säätimet COX2 tahroja. Tulokset tulkittiin mikroskoopilla pisteytystä pahanlaatuisten solujen ≥10 kentät 400x suurennuksella jolloin saatiin keskimääräinen osuus pisteet (0 = ei mitään, 1 = < 1%, 2 = 1-10%, 3 = 10-33%, 4 = 33 -66%, 5 = > 66% soluista) ja intensiteetti pisteet (0 = ei mitään, 1 = heikko, 2 = väli, 3 = voimakas värjäytyminen). Yhteensä pisteitä verrattiin EBV positiiviset versus
syöpäkasvain käyttäen Mann-Whitneyn parittomia t-testi.
Havaitseminen EBV genomin
Akku kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR (Q-PCR) määritykset kohdistaminen kuusi hajanaisia alueet EBV-genomin käyttää osoittamaan, että virusinfektio AGS soluissa oli onnistunut. Monistetut tuotteet todettiin käyttäen ABI Prism 7500 Real-Time PCR väline Sequence Detection System ohjelmisto (Applied Biosystems), kuten aiemmin on kuvattu käyttäen alukkeita kohdistaminen BamH1W
, EBNA1
, LMP1
, lmp2
, ja BZLF1
alueiden EBV-genomin [52], tai EBER1
DNA [53]. Voit tarkistaa amplikonin saastuminen, joka ajaa sisälsi vähintään kaksi "no malli" valvontaa, jossa nukleaasitonta H2O korvasi mallia.
Low-Density cDNA Microarray Analysis
RNA eristettiin AGS ja AGS-B95- hygB soluihin käyttäen RNeasy RNA Mini Kit (Qiagen) ensin käyttäen QIAshredder ™ spin-pylvästä (Qiagen) solujen hajottamiseksi. Kun olet vahvistanut RNA eheys käyttäen Agilent Bioanalyzer, ilmentyminen mikrosiruanalyysi suoritti SABiosciences Corporation (Frederick, MD) käyttäen GEArray Q Series Human Signaalinvälittyrnismääritykset Cancer Gene Array. Tämä alhaisen tiheyden microarray koostuu 96 antureista, jotka testataan aktivointi 15 signaalitransduktioreaktioteiden mukana oncogenesis. (Target selostukset on lueteltu tulokset.) Biotiini-leimatun cDNA valmistettiin 10 ug kutakin RNA-näytettä käyttäen AmpoLabeling-LPR menetelmä (SABiosciences) hybridisoitiin array, ja kemiluminesenssiosoitusta suoritettiin käyttäen CCD-kameraa. Integroitu raaka intensiteetti arvot kunkin täplän kertyi GEArray Analysis Suite -ohjelmisto (SABiosciences), ja edelleen analyysi ja normalisointi suoritettiin käyttäen Microsoft Excel. Alimmalla kohdalla voimakkuus arvoon jokaisena array pidettiin tausta ja vähennettiin kustakin raaka voimakkuuden arvo kullekin koetin, ja sitten paikka intensiteetit normalisoitiin kuin taloudenhoito geeni, glyceraldehydephosphate (GAPDH
). Pareittain vertailu geeniekspressiotasot välillä tehtiin EBV-positiiviset solut (AGS-B95-hygB) ja vanhempien EBV-negatiivinen AGS soluissa. Jos suhde on ≥2 tai ≤0.5, geeni katsottiin yliaktiivista tai vaimentua infektoiduissa soluissa.
SYBR Green semikvantitatiivinen rtPCR
Vahvista valittu microarray-geenin ilmentymisen tulokset, rtPCR suoritettiin käyttäen Real-Time RT 2-geenin PCR-alukkeita (SABiosciences). ReactionReady ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (SABiosciences) käytettiin muuntamaan 3 ug RNA: ta cDNA: n, ja cDNA laimennettiin 1:10 ennen PCR-analyysillä. Seuraavat 38 cDNA kohdistettiin: GAPDH, A2M, ABCB1, BCL2L1, BIRC1, BIRC2, BIRC3, EN1, GADD45, HF1A, ID2, IGFBP3, BRCA1, TMEPAI, IRF1, BCL2, BMP4, CDKN2A (p16), FN1, HK1, ICAM1, IL2, CCND1, MDM2, COX2 (PTGS2), TFRC, WISP1, TRAF1, CDK2, VCAM1, CDKN2C (p18), CDKN1A (p21), DUSP1, HSP70, NFKB1, TNFSF10, TRIM25
, ja FOSL1
. Reaktiot suoritettiin kokonaistilavuudessa 25 ui, joka sisälsi 1X TaqMan ® Universal Mix (ABI), RT 2-geenin aluketta set seosta (10 uM kutakin aluketta, SABiosciences), 2,5 ui 5X SYBR vihreä liuos ( Molecular Probes, Eugene, OR), ja 5 ui cDNA-templaattia. Lämpösykli- olosuhteet olivat: 50 ° C 2 minuuttia, 95 ° C: ssa 10 minuuttia, ja 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C: ssa 1 minuutti ABI 7500 väline Sequence Detection System ohjelmisto (Applied Biosystems). Samaa kynnystä käytettiin kutakin geeniä ja levyn arvioinut "suhteellinen kvantitointi Plate" protokolla. Kukin PCR-reaktio suoritettiin kolmena rinnakkaisena kullekin näytteelle on kaksi erillistä 96-kuoppalevyille, ja tulokset laskettiin keskiarvot määrittää suhteelliset erot kunkin geenin ekspressiotaso EBV-positiivisten vs.
EBV-negatiivinen solulinja.
Minor Groove sitovat Probe semikvantitatiivinen rtPCR
arvioimiseksi ilmentymisen viittä geenejä, jotka eivät olleet microarray edellä kuvattujen puolikvantitatiivinen rtPCR määritykset suoritettiin (määritykset-Demand, Applied Biosystems) käyttäen pieneen uraan sitovia antureista kohdistaminen helikaasi kaltainen transkriptio kerroin (Erityistyöryhmä
), apilatekijän-1 (TFF1
), perus-leusiinivetoketjun ATF kaltainen transkriptiotekijä (BATF
), estäjä DNA: ta sitovan proteiinin 4 (ID4
), ja nucleostemin (NU
). Nämä viisi valittiin, koska ne kuulemma väärin säädellystä että huomattavassa osassa mahalaukun adenokarsinooman tai EBV liittyviä syöpiä [32, 54-59]. GAPDH
toimi sisäsyntyinen ohjaus suhteellista kvantifiointia varten. RNA muunnettiin cDNA käyttäen High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems), ja cDNA laimennettiin 1:10 nukleaasitonta vettä. Kukin 50 ui PCR-reaktio sisälsi: 1X TaqMan ® Universal Master Mix, 1X Target Gene Expression määrityksen tai GAPDH
Endogeeniset Ohjaus sekoitus, ja 10 ui cDNA. Voit tarkistaa amplikonin saastuminen, joka ilmentymistestissä joka levy sisälsi vähintään kaksi "no malli" valvontaa, jossa nukleaasitonta vettä korvasi mallia. Lämpösykli- olosuhteet ja data-analyysi olivat kuten edellä on kuvattu SYBR Green rtPCR.
Demetylaatio käsittely ja sekvensointi bisulfiittimodifiointi-muunnetun DNA
vaikutuksen tutkimiseksi ja demetylaation, AGS ja AGS-B95-hygB mahasyövän solulinjoja kasvatettiin 75% konfluenssiin ja sitten kolmen peräkkäisen päivän ajan 1 uM tuoretta 5-atsa-2'-deoksisytidiini (5aza; Sigma) lisättiin päivittäin. Neljäntenä päivänä, RNA: n ja DNA kerättiin käsiteltyjen ja käsittelemättömien viljelmissä. RNA arvioitiin geeniekspressiotasot, ja DNA tutkittiin metylaation jälkeen natriumbisulfiittia hoidon (EZ DNA Metylointi Kit, Zymo Research, Orange, CA) muuntaa metyloitumattomat sytosiinit urasiili pitäen metyloituja sytosiineja ennallaan [60]. Positiivinen kontrolli oli CpGenome Universal metyloitua DNA: ta (Chemicon), suoritetaan samat bisulfiittikonversion, ja valvonta-alukkeet on kohdistettu C8orf4
solun geenin promoottori vahvistettu onnistuneesti bisulfiittikonversion kutakin DNA-näytettä [61]. CpG-saarekkeiden tunnistettiin käyttämällä CpG Tontti kunkin viiden ihmisen genes-- ICAM1
(RefSeq # NM_00201), CDKN2A (p16) B (RefSeq # NM_000077.3), ID4
(RefSeq # NM_001546), COX2
(RefSeq # NM_000963), ja TFF1
(RefSeq225,2), - joiden promoottorisekvenssit (3000 emäsparia ylävirtaan transkription aloituskohdasta kautta eksoni 1) on ladattu GenBank. Seuraavat parametrit CpG-saarekkeen tunnistamiseen käytettiin: minimipituus 200 emäsparia, vähintään keskimääräisen prosenttiosuuden C + G 50%, ja pienin keskimääräinen suhde havaittu odotettua C + G 0,6 [62]. Tunnistaa CpG tiheä alueiden COX2
ja TFF1
, minimipituus parametri aleni 50 bp [61]. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa 1. Kukin 50 ui PCR-reaktio sisälsi 1 x PCR-puskuria, 2 mM MgCI 2, 1 yksikkö Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad CA), 0,2 mM dNTP: itä (ABI), ja 30 pmol kutakin aluketta. Lämpösykli- olosuhteet olivat: 94 ° C 2 minuuttia, 40 sykliä 94 ° C 30 sekuntia, 55 ° C: ssa 30 sekunnin ajan ja 72 ° C 1 minuutti, 72 ° C: ssa 10 minuuttia. Valvomaan amplikonin saastuminen, joka ajaa sisälsi "no malli" ohjaus, jossa nukleaasitonta vettä korvasi templateTable 1 bisulfiittimodifiointi muunnettu geenispesifiseen PCR Primer Jaksot
ICAM1

Forward
5'- TGG GGG TTG TGG TTT TAG TT-3 '

Reverse
5'-CTC CCT CCA CTA AAA AC-3'
Amplicon koko
412 emäsparin
CDKN2A (p16)
Eteenpäin
5'-AGA TGT TTT GTG GTT GTT GTG A-3 '
Reverse
5'-CAA AAA TCT TCC ATT CTT CAA AC -3 '
Amplicon koko
418 emäsparin
ID4
Eteenpäin
5'- TTT TTT GGG TAT ATA TTA GTT TGG-3'
Reverse
5'-TAT CCT AAT CAC TCC CTT C-3 '
Amplicon koko
477 emäsparin
COX2
Eteenpäin
5'-TAT GTG TTG TAT ATA GAG TAG A-3'
Reverse
5'-AAA AAA TAA TCC CCA CTC TC -3 '
Amplicon koko
399 emäsparin
TFF1
Eteenpäin
5'- TTA GGT TGG AGT GTA GTA GG-3'
Käänteinen
5'-CCT ACT CAT ATC TAA AAA ACC C-3 '
Amplicon koko
489 emäsparin
C8orf4 ohjaus
Eteenpäin
5'-GAA TTA AAA TAT AAG GAG AGT TTT-3 '
Reverse
5'-AAC ATT ACC CAA ACA TAA AAC AA-3'
Amplicon koko
328 emäsparin
sekvensointi suoritettiin amplikoneja bisulfiitin käsiteltyä malleja tunnistaa metyloidut ja metyloimattomien CpG: t tai ilman 5aza hoitoa. Ensinnäkin kunkin PCR-tuote kloonattiin pGEM-T-vektoriin käyttäen pGEM-T Easy Vector System II (Promega) ja transformoitiin JM109 korkea hyötysuhde kompetentteja soluja. Valkoiset pesäkkeet, jotka sisältävät inserttejä valittiin ja viljeltiin yön yli, ja plasmidi-DNA uutettiin käyttämällä Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). Sekvensointi tehtiin ABI 3100 Genetic Analyzer käyttäen ABI PRISM ™ BigDye ™ Version 1.1 Terminator Cycle Ready Reaction Kit AmpliTaq DNA Polymerase ja M13R3 pohjamaali. Tulokset ladataan Sequencher ohjelmisto (Gene Codes, Ann Arbor, MI) saamiseksi käänteisen kohteliaisuus kunkin sekvenssin, ja sekä myötä- sekvenssit rinnastettiin ja analysoitiin erottaa metyloitumattomat sytosiinit päässä metyloituja sytosiineja.
Western Blot on AGS solulinja
Koska mahdollisuudet COX2 estäjähoidossa voittamiseksi COX2 vaikutuksia, RNA-pohjainen tulokset COX2 valittiin seurantatutkimus on proteiini tasolla. Konfluentteja AGS solujen kanssa tai ilman EBV kerättiin 0,25% trypsiiniä, pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, ja pelletoitiin sentrifugoimalla. Solut suspendoitiin uudelleen 500 ul NP-40: ä solujen hajotuspuskuria (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 1% NP-40, pH 8,0), inkuboitiin jäissä 30 minuutin ajan, ja sentrifugoitiin 12000 rpm 15 minuutin ajan 4 ° C. Eriä lysaattia (50, 100, 150 ug proteiinia kuoppaa kohden) erotettiin SDS-PAGE: tris-glysiini 4-20% gradienttigeelissä (Invitrogen) ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. COX2 havaittiin 1: 5000 laimennosta monoklonaalinen vasta-aine ja sen jälkeen 1: 10000 laimennos sekundäärinen vasta-aine oli konjugoitu alkaliseen fosfataasiin (Amersham Biosciences), ja visualisointi kanssa Typhoon Phosphorlmager (Molecular Dynamics). Band tiheys mitattiin puolittain määrällisesti ja normalisoidaan beeta aktiini (ACTB) verrattiin välillä tartunnan ja infektoitumattomien AGS soluja.
Tulokset
EBV Infektio AGS Mahalaukun Syöpäsolut
Onnistunut EBV-infektio AGS mahalaukun syöpäsolujen vahvistettiin kuudella Q-PCR-määrityksissä kohdistaminen erilaisia ​​segmenttejä EBV genomin. Eber
in situ
hybridisaatio ei osoittanut eber
ilmaisun vanhempien "EBV-negatiivinen" AGS soluja, kun taas yli 90% AGS-B95-hygB solut olivat Eber
positiivisten ja oli aktivoitu -appearing ydin- morfologia (kuvio 1). Lisääntyminen nostettiin mikä näkyy yhtymäkohdassa viljeltyjen AGS-B95-hygB solut kolme päivää ennen vanhempien AGS soluihin. Infektio kesti vähintään 4 kuukautta osoittavat GFP ja Eber
histokemiallisilla tahroja. EBV piilevä (LMP1 ja LMP2A) ja lyyttiset (BZLF1 ja BMRF1) proteiinit eivät ilmenny tartuttamattomissa AGS soluissa, kun taas ~ 10% tartunnan saaneiden solujen ilmaisi LMP1 puolet solut ilmaisivat LMP2A, ja ~ 35% ilmaistuna BMRF1 ja BZLF1 proteiineja mikä aktiivinen viruksen replikaatioon (kuvio 1). Kuva 1 AGS-B95-hygB solut ilmentävät piilevä ja lyyttisiä viruksen geenejä. A) immunohistokemiallinen värjäys GFP ehdottaa hygromysiini B-käsiteltyjen AGS solut tasaisesti tartunnan suunniteltu B95.8 EBV genomin. B) Eber in situ
-hybridisaatio osoittaa piilevä infektio > 90%: ssa soluista. Nuclear Eber
värjäystä säästää nucleoli, ja laajentunut nucleoli ovat merkkiaine soluaktivaation. Piilevä virusproteiineja LMP1 (C) ja LMP2 (D) ilmennettiin fokaalisesti. Lyyttinen virusproteiineja, BMRF1 (E) ja BZLF1 (F), ilmennettiin huomattava osa AGS-B95-hygB soluja. (GFP ja BMRF1 tahroja, 800x, LMP1, lmp2, Eber
ja BZLF1 tahroja, 1200x) B Cellular Gene Expression Erot EBV-positiiviset versus EBV-negatiivinen AGS Cells
ekspressiotasot 96 solun geenit analysoitiin in AGS ja AGS-B95-hygB soluihin käyttäen pienitiheyksistä mikrosiruanalyysi kanssa kemiluminesenssiosoitusta (kuva 2). Normalisoinnin jälkeen GAPDH
, pareittain vertaamalla geenin ilmentymisen tasojen EBV-positiivisten ja EBV-negatiivinen AGS soluja, osoitti, että 96 geenien microarray, 43 oli väärin säädellystä vähintään kaksinkertainen jälkeen EBV-infektio. Yllättäen EBV-ilmentymisen lisääntyminen havaittiin vain 6 geenien (IGFBP3
, GADD45, IRF1, Grp78 /HSPB1, GLUT1 /SLC2A1, TMEPAI
), kun taas vähentynyt ilmentyminen havaittiin jäljellä 37 säädeltyyn geenien (ABCB1, BCL2L1, BIRC2, BMP2, CDKN2A, DUSP1, HF1A, ICAM1, ID2, NFKB1, COX2, TFRC, VCAM1, WISP1, TRIM25, IL2, BMP4, MDM2, CCND1, CDK2, BAX, p57, p19, Csn2, CXCL9 , IL4, kesäkuu, KLK3, LTA, MMP7, PPARg, TNFRSF10B, WIG1, WNT2, PTCH2
). Kuvio 2 geeniekspressiomalleja muutetaan EBV infektion AGS soluja. Biotiini-leimattu cDNA-koettimien puettu neljänä nailonkalvolle hybridisoituvat RNA eristettiin AGS ja AGS-B95-hygB soluja. Kemiluminesenssiin äänimerkkiä dysregulation valittujen geenien joukossa 96 array verrattuna kontrolli geenien kahdella viimeisellä rivillä.
SYBR Green rtPCR käytettiin tarkistaa mikrosiru havainnot 26 säädeltyyn geenien ja 12 ylimääräisiä geenejä, joissa ei havaittu merkittävää muutosta microarray. Suurempi kuin kaksinkertaiseksi muutoksen mRNA tasolla tartunnan versus
infektoitumattomiin soluihin havaittiin 16/26 geenien (taulukko 2). Geenit vaikuttaa eniten olivat IGFBP3
joka voimistuvan 42-kertaiseksi, ja COX2, BMP4, ja ICAM1
jotka vaimentua mukaan 35-, 32-, ja 22-kertaiseksi. Jäljellä olevat kymmenen microarray-pohjainen muutoksia ei vahvistanut rtPCR, viittaa siihen, että EBV-liittyvät dysregulaatio näistä tekijöistä oli pienempi kuin kaksinkertainen. Yhdessä tapauksessa, oli merkittävä ero: Expression tasot BCL2L1
microarray-analyysi osoitti kahden kertainen pieneneminen
infektoiduissa soluissa, kun taas rtPCR osoitti kuitenkin toistuvasti viisi kertaa enemmän
vuonna BCL2L1
mRNA tasot infektoituneissa soluissa. Vähemmän dramaattinen poikkeamia havaittiin, kun vielä 12 geenit analysoitiin rtPCR, joilla on merkittävää (> 2-kertainen) muutoksia löytyi ilmentymisen 5/12 geenejä, joiden muuttaminen ei havaittu microarray (taulukko 2) .table 2 geenit säädeltyyn EBV-positiivisten AGS Cells
Gene Name
Gene Symbol
kertaluokkamuutos *
vaimentua Genes
perus leusiini-vetoketju transkriptiotekijä, ATF-kaltainen
BATF
-38
COX-2
COX2
-35
luun morfogeeninen proteiini-4
BMP4
-32
solujen välinen adheesiomolekyyli-1
ICAM1
-22
apilatekijän-1
TFF1
-21
estäjä DNA: ta sitovaa-2
ID2
-14
lämpöshokkiproteiini-70
HSP70
-10
sykliiniriippuvaisen kinaasi-2
CDK2
-9
sykliini-D1
CCND1
-9
hypoksian indusoima tekijä-1A
HF1A
-9
rintasyöpä-1
BRCA1
-7
nucleostemin
NU
-7
sykliiniriippuvaisen estäjä-2A
CDKN2A /p16
-6
estäjä DNA: ta sitovaa-4
ID4
-6
engrailed-1
EN1
-5
ATP-sitova kasetti, alaryhmä B, jäsen 1
ABCB1
-3
MDM2 p53 sitova proteiini
MDM2
-3
voimistunut Genes
insuliinin kaltainen kasvutekijää sitova proteiini-3
IGFBP3
+40
tuumorinekroositekijä reseptoriin liittyvän tekijä-1
TRAF1
+20
transmembraani- eturauhasen androgeenin indusoiman proteiinin
TMEPAI
+10
tuumorinekroositekijä, superperheen jäsen-10
TNFSF10
+8
B-solulymfooma-2-like

• Havaitseminen promoottorin hypermetylaatiota CpG saaren E-kadheriinin mahalaukun sydämen adenokarsinoomaa
• Muutokset lipidiprofiileissa jälkeen radikaali gastrektomia potilailla mahalaukun syöpä