Epstein-Barr-virus-spesifikke metylering av humane gener i magekreftcellene

Epstein-Barr virus-spesifikke metylering av menneskets gener i mage kreftceller
Abstract
Bakgrunn
Epstein-Barr-virus (EBV) er funnet i 10% av alle mage adenokarsinomer, men dens rolle i tumorutvikling og vedlikehold restene uklar. Målet med denne studien var å undersøke EBV-mediert feilregulering av cellulære faktorer involvert i magekreftutvikling.
Metoder
genutrykksmønster ble undersøkt i EBV-negative og EBV-positive AGS mage epitelceller ved hjelp av en lav tetthet microarray, revers transkripsjon PCR, histochemical flekker, og metylering-spesifikke DNA-sekvensering. Expression of PTGS2 (COX2) ble målt i AGS celler og i grunnskolen med adenokarsinom i vev.
Resultater
op studier, nesten halvparten av de 96 menneskelige gener testet, som representerer 15 forskjellige kreftrelaterte signaltransduksjonsveier, ble dysregulerte etter EBV infeksjon. Revers transkripsjon PCR bekreftet betydelig innvirkning på faktorer som har forskjellige funksjoner som cellesyklusregulering (IGFBP3
, CDKN2A, CCND1, HSP70, ID2, ID4)
, reparasjon DNA (BRCA1, TFF1
), celle adhesjon ( ICAM1
), betennelse (COX2
), og angiogenese (HIF1A
). Demetylering bruker 5-aza-2'-deoxycytidine reversert EBV-mediert feilregulering for alle 11 gener som er oppført her. For noen promotersekvenser, CpG island metylering og demetylering skjedde i en EBV-spesifikke mønster som vist ved bisulfit DNA-sekvensering. Immunhistokjemi ble mindre sensitiv enn var western blot for detektering av nedregulering av COX2 på EBV-infeksjon. Virus-relaterte feilregulering av COX2 nivåer in vitro
ikke ble rekapitulert in vivo
blant naturlig smittet mage kreft vev.
Konklusjoner
EBV endrer menneskelig genekspresjon på måter som kan bidra til den unike patobiologi av virus -associated kreft. Videre frekvens og reverserbarhet av metylering relaterte transkripsjons endringer foreslå at demethylating agenter ha terapeutisk potensial for å håndtere EBV-relatert kreft.
Bakgrunn
Magekreft er den fjerde vanligste krefttypen og den nest største årsaken til kreft død på verdensbasis [1]. En rekke genetiske forandringer samt infeksjonssykdommer og andre forurensninger synes å være faktorer i magekreftutvikling. Epstein-Barr virus (EBV), et dobbelt-trådet DNA gammaherpesvirus, er funnet innenfor de ondartede cellene i 10% av mage adenokarsinomer, og infeksjon ser ut til å gå forut for malign transformasjon [2]. Grunnleggende og kliniske observasjoner tyder på at EBV-assosiert mage kreftformer har en annen patobiologi fra EBV-negative mage kreft [3-8]. Rasjonell utforming av virus-rettet terapi krever en bedre forståelse av den patogene rolle av EBV i magekreftutvikling.
Tidligere undersøkelser har vist at tapet av tre kritiske tumor suppressor genprodukter, CDH1 (E-cadherin), p73, og CDKN2A (p16 ), i EBV-infiserte gastriske cancere [9-18]. Virus-forbundet metylering av disse genene, sammen med bevis for global DNA metylering i EBV-positive kreft, antyder at EBV-relaterte mage kreft er en undergruppe av CpG island methylator fenotype (CIMP) kreft [4, 11, 19-26]. En potensiell megler er DNA metyltransferase 1 (DNMT1) Hotell som er oppregulert i naturlig smittet mage kreft, og kan bidra til å etablere metylering mønstre overført til dattercellene ved celledeling [21, 27-29]. Pågående studier er rettet mot å forstå hvilken rolle EBV og Helicobacter pylori infeksjon i forårsaker betennelse og tilhørende global hypermethylation under magekreft utvikling [22].
I cellelinje-modeller, DNMT1 overekspresjon medieres av EBV LMP1 og LMP2 [21, 28 -31]. EBV synes å anvende epigenetiske mekanismer for kontroll av verts transcriptome og også til å styre ekspresjon av sine egne viralt kodet gener [11, 12, 14, 15, 19, 21, 24, 29, 32, 33]. Ved første infeksjon av en celle, kan den unmethylated virale genom gjennomgå virusreplikasjon med ny virusproduksjon, mens en undergruppe av infiserte celler skaffe et høyt metylert virale genomet som svupper ekspresjon av fremmede proteiner og medierer langvarig viral persistens i form av latent infeksjon [23, 34]. Infiserte svulster har en tendens til å ha svært denaturert EBV-DNA, og metylering messige stanse av virale gener bidrar til å forklare hvordan infiserte svulster unngå immun ødeleggelse.
Mens metylering av gen-arrangører er vanligvis forbundet med transkripsjonen downregulation
via selektiv binding av repressor proteiner , den første protein noensinne vist å binde og aktivere
en metylert arrangøren var EBV BZLF1, den avgjørende faktoren som styrer overgangen fra latent til replikative former for viral infeksjon [35]. Det ser ut til at viruset har utviklet seg smart et middel til å overvinne promoter metylering til sin fordel [34, 35]. Antiviral strategier blir undersøkt for deres antineoplastiske potensial. Interessant, de mest brukte antivirale midler, acyclovir og ganciklovir, er effektive ved nedleggelse virusreplikasjon, men de har ikke eliminere uttrykk for latente og tidlig lytiske virale gener som LMP1, LMP2 og BZLF1.
De kliniske implikasjonene av EBV- relatert metylering av magekreft genomet er enorm. Først nye bevis viser potensialet for forbedret diagnostisering av magekreft ved å teste mage vasker for kreftspesifikke metylering mønstre, kanskje i samråd med tester for EBV å identifisere virusinfisert undergruppe av kreft [36-40]. Ulike mønstre for promoter-metylering i virus-positive sammenlignet med virus-negative celler [11, 21, 24] understreker behovet for å karakterisere metylering mønstre på en måte som maksimerer det analysesensitiviteten for diagnose av kreft. Både infeksjon og endret DNA metylering ser ut til å være tidlige hendelser i kreftutvikling [2, 41], potensielt tilrettelegging påvisning av forstadier til kreft i magesaft., En annen klinisk implikasjon er potensialet for forbedret behandling av magekreft ved bruk av legemidler som reverserer den effekten av promoteren hypermethylation [42, 43]. Spesielt demethylating legemidler som hemmer DNA metyltransferase og reversere tumor suppressor genet Slå eller onkogen aktivering er potensielle antineoplastiske strategier [43]. Det må tas hensyn til eventuelle forskjeller i effekten av demethylating agenter i virus-positive versus
virus-negative tumorer [43-45]. Vi og andre har vist at naturlig infiserte mage kreftformer har lavere CDKN2A (p16) uttrykk [14, 15]. I en klinisk studie med fluorouracil (5-FU) for magekreft, CDKN2A
promoter metylering status var en uavhengig prediktor for overlevelse [46]. Begrunnelsen for bruk av demethylating midler som 5-aza-2'-deoxycytidine i kliniske studier hviler på vitenskapelig bevis for at demethylating terapi endrer tumorigene egenskaper kreftceller.
Flere forskere har lykkes infiserte epiteliale cellelinjer med EBV i
vitro product: [47, 48]. I denne studien ble EBV-positive og EBV-negative AGS mage kreftceller undersøkt for forskjeller i genuttrykk mønstre ved hjelp av low-density microarray analyse og revers transkripsjon polymerase chain reaction (rtPCR). AGS er en cellelinje som opprinnelig ble dyrket fra adenokarsinom i ventrikkel vev og nå er mye brukt som en modell for magekreft. Rollen av DNA-metylering ved formidling av utvalgte effekter ble undersøkt ved bisulfitt DNA-sekvensering og ved å teste evnen til en demethylating middel for å reversere effekten av EBV på genet demping. Resultatene viste omfattende genet feilregulering på EBV infeksjon i AGS celler med bevis for at arrangøren metylering er ansvarlig, i hvert fall delvis. Reversering av virus-assosiert transkripsjons effekter antyder at demethylating midler bør utforskes for deres potensial til å kontrollere veksten av EBV-relatert malignitet
. Metoder
magekreft cellelinjer
AGS magekreft cellelinje (ATCC CRL- 1739) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium inneholdende 10% føtalt bovint serum (varme-inaktivert i 20 minutter ved 65 ° C) og 1% penicillin-streptomycin (10.000 enheter penicillin, 10 000 pg /ml streptomycin, Gibco, Carlsbad, CA) . Cellene ble infisert med et rekombinant EBV-stamme (en gave fra Dr. Henri J. DELECLUSE) [33, 49, 50] som ble konstruert for å uttrykke grønn fluorescens protein (GFP) og hygromycin B resistens ved å klone disse genene inn i det prototypiske B95 0,8 stamme av EBV hvor den andre kopien av oriLyt normalt ligger. Før infeksjon ble AGS-celler transfektert med 1 ug av en ekspresjonsvektor som koder for CD21 (EBV-reseptoren), og en puromycin resistens-genet ved hjelp av Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN) som tidligere beskrevet [51]. Ved 48 timer etter transfeksjon ble celler inneholdende CD21 positivt utvalgt for anvendelse av 0,5 ug /ml puromycin-HCl (Roche). Virale bestander av rekombinant EBV ble samlet i nyre 293-celler, en human embryonisk epitelial cellelinje, ved å indusere lytisk replikasjon under anvendelse av 20 ng /ml forbol-12-tetradecanoate 13-acetat og 3 mM butyrat. Supernatanter ble høstet 3 dager etter induksjon, filtrert (0,8 um), og frosset ved -80 ° C inntil bruk. Puromycin-resistente AGS-celler ble sådd ut ved 50% av full tetthet i 60 mm vevskulturskåler og ko-inkubert med 1 ml av lager virioner. Fire dager senere, de EBV-infiserte celler (AGS nå kalt AGS-B95-HygB) ble positivt utvalgt med 100 ug /ml hygromycin B (Roche).
DNA fingerprinting bekreftet at AGS cellene som ble brukt i denne studien matchet genotypen av AGS-celler i American Type Culture Collection. Fingeravtrykk ble gjort ved hjelp av PowerPlex 1,2 STR kit (Promega) etterfulgt av elektroforese på en ABI 310 kapillær gel elektroforese instrument (Applied Biosystems).
Gene Expression av histochemical Stains
Parafin blokker ble fremstilt fra AGS og AGS-B95- HygB cellelinjer, og parafinblokker i grunn adenokarsinom i ventrikkel ble hentet fra kliniske arkiver. De resterende kliniske prøver representerer alle ledige EBV-positive mage kreft (n = 9) og et tilfeldig utvalg av EBV-negative mage kreft (n = 9). Histokjemiske flekker ble påført på parafinsnitt for å bekrefte infeksjon og for å evaluere genekspresjon. For å fremstille blokker, ble dyrkede celler først skylt i Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (Gibco, Invitrogen), høstet med 0,25% trypsin (Gibco, Invitrogen), innviklet i en blodpropp ved hjelp Dade Ci-Trol koagulasjon Control (citrat) -nivå 1 (Dade Behring, Marburg, Tyskland) og trombin 200 (Pacific Hemostase, Middletown, VA), fiksert i 10% bufret formalin, innstøpt i parafin, og delt inn belagt lysbilder.
EBER
in situ
hybridisering ble utført ved hjelp av fluorescens-merket EBER
probe og oligo T-kontroll (d) sonde på en Benchmark in situ
hybridisering system (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona). Immunhistokjemiske flekker for EBV lmp1 og lmp2 proteiner ble utført som tidligere beskrevet [52] ved bruk av citrat-antigen gjenfinning og den CS1-4 cocktail av muse-monoklonale antistoffer mot lmp1 (1: 100, Dako, Capinteria, CA) og E411 rotte monoklonalt antistoff mot lMP2 (1 mg /ml, Asencion, München, Tyskland). Parafin deler av EBV-relaterte Hodgkin lymfom og etter transplantasjon lymfoproliferativ lidelse tjente som positive kontroller
Immunhistokjemisk analyse av EBV replikative proteiner BMRF1 og BZLF1 ble utført ved hjelp av anti-BMRF1 klone G3-E31 ​​(1:. 200 fortynning, Forsknings Diagnostics , Inc., Flandern, NJ) og anti-BZLF1 klone BZ.1 (1:25 fortynning, Dako, Carpinteria, CA), mens menneskelig PTGS2 (på folkemunne kalt cyklooksygenase-2, COX2) ble analysert ved hjelp av anti-COX2 monoklonalt antistoff ( 1: 200 fortynning, Cayman Chemical). Seksjoner ble inkubert med primært antistoff i 30 minutter ved 37 ° C for EBV-mål, eller ved 4 ° C over natten for COX2, ved hjelp av sperre og deteksjons protokoller i Super-Sensitive Non Biotin HRP Detection Kit (Biogenex). Bundet antistoff ble påvist ved hjelp av diaminobenzidin kromogen (Biogenex) og cellene ble kontra med hematoksylin (Dako). Parafin deler av oral hårete leukoplaki fungert som en positiv kontroll for lytisk EBV, mens reaktiv mandel og nasofaryngeale karsinom vev tjente som kontroller for COX2 flekker. Resultatene ble tolket ved mikroskopisk scoring av maligne celler i ≥10 felt ved 400x forstørrelse, hvilket ga en gjennomsnittlig andel poengsum (0 = ingen, 1 = mindre enn 1%, 2 = 1-10%, 3 = 10-33% 4 = 33 -66%, 5 = > 66% av cellene) og resultatet intensitet (0 = ingen, 1 = svak, 2 = middels, 3 = sterk farging). Totalt skår ble sammenlignet i EBV positiv versus
negative svulster ved hjelp av en Mann-Whitney uparet t-test.
Påvisning av EBV genomet
Et batteri av kvantitativ real-time PCR (Q-PCR) analyser rettet mot seks uensartet regioner av EBV-genomet ble benyttet for å demonstrere at viral infeksjon av AGS-celler var vellykket. Amplifiserte produkter ble påvist ved hjelp av ABI Prism 7500 Real-Time PCR instrument med Sequence Detection System programvare (Applied Biosystems) som tidligere beskrevet ved hjelp av primere rettet mot BamH1W
, EBNA1
, LMP1
, LMP2
, og BZLF1
regioner av EBV genomet [52] eller EBER1
DNA [53]. For å se etter fragment forurensning, hver run inneholdt minst to "ingen mal" styrer hvor nukleasefritt H2O ble byttet ut med malen.
Low-Density cDNA microarray analyse
RNA ble isolert fra AGS og AGS-B95- HygB celler ved hjelp av RNeasy RNA Mini Kit (Qiagen) etter første gangs bruk av QiaShredder ™ spin-kolonne (Qiagen) for å lysere cellene. Etter å ha bekreftet RNA integritet ved hjelp av en Agilent Bioanalyzer, ble uttrykket microarray analyse utført av SABiosciences Corporation (Frederick, MD) ved hjelp av sine GEArray Q serien Menneskelig signaltransduksjon i Cancer Gene Array. Denne lave tetthet microarray består av 96 sonder som tester aktivering av 15 signaloverføringsveier som er involvert i onkogenesen. (Target transkripsjoner er oppført i resultater.) Biotin-merket cDNA fremstilt fra 10 mikrogram av hver RNA prøve å bruke AmpoLabeling-LPR-metoden (SABiosciences) ble hybridisert til array, og kjemiluminescens deteksjon ble utført ved hjelp av en CCD-kamera. Integrerte rå intensitetsverdiene for hvert sted ble generert av GEArray Analysis Suite-programvaren (SABiosciences), og videre analyse og normalisering ble utført ved hjelp av Microsoft Excel. Det laveste punktet styrkeverdi på hver gruppe ble ansett for å være bakgrunn og ble subtrahert fra hver rå styrkeverdi for hver sonde, og deretter spot-intensiteter ble normalisert til den for husholdningsgenet, glyceraldehydephosphate dehydrogenase (GAPDH
). En parvise sammenligningen av genuttrykk nivåer ble gjort mellom EBV-positive celler (AGS-B95-HygB) og foreldre EBV-negative AGS celler. Hvis forholdet var ≥2 eller ≤0.5 ble genet anses å være oppregulert eller nedregulert i infiserte celler.
SYBR Grønn semikvantitativ rtPCR
å bekrefte valgt microarray genuttrykk resultater, ble rtPCR utført ved hjelp av Real-Time RT <sup>2 gen-spesifikke PCR-primere (SABiosciences). Den ReactionReady ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (SABiosciences) ble benyttet for å omdanne 3 ug av RNA til cDNA, og cDNA ble fortynnet 1:10 før PCR-analyse. Følgende 38 cDNA ble rettet: GAPDH, A2M, ABCB1, BCL2L1, BIRC1, BIRC2, BIRC3, EN1, GADD45, HIF1A, ID2, IGFBP3, BRCA1, TMEPAI, IRF1, BCL2, BMP4, CDKN2A (p16), FN1, Ht1, ICAM1, IL2, CCND1, MDM2, COX2 (PTGS2), TFRC, WISP1, TRAF1, CDK2, VCAM1, CDKN2C (p18), CDKN1A (p21), DUSP1, HSP70, NFKB1, TNFSF10, TRIM25
, og FOSL1
. Reaksjoner ble utført i et totalt volum på 25 ul inneholdende 1 x TaqMan ® Universal Mix (ABI), RT to genspesifikke primer sett blanding (10 mM hver primer, SABiosciences), 2,5 pl 5X SYBR grønn løsning ( Molecular Probes, Eugene, Oregon), og 5 mL av cDNA mal. Termocykling Betingelsene var: 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 10 minutter og 40 sykluser med 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minutt på en ABI 7500-instrument med Sequence Detection System programvare (Applied Biosystems). Den samme terskelen ble brukt for hvert gen og plate evaluert av "relativ Kvantifisering Plate" protokoll. Hver PCR-reaksjon ble kjørt i triplikat for hver prøve på to separate 96-brønners plater, og resultatene ble beregnet for å bestemme relative forskjellene i hvert gen er ekspresjonsnivået i den EBV-positive versus
EBV-negative cellelinje.
Minor Groove Binding Probe semikvantitativ rtPCR
å evaluere uttrykk for fem utvalgte gener som ikke var på microarray beskrevet ovenfor, ble semi-kvantitative rtPCR analyser utført (analyser-on Demand, Applied Biosystems) bruker mindre groove bindende prober rettet mot helicase-lignende transkripsjon faktor (HLTF
), trekløverfaktor-1 (TFF1
), basic-leucine glidelås ATF-lignende transkripsjonsfaktor (BATF
), hemmer DNA-bindende protein-4 (ID4
), og nucleostemin (NU
). Disse fem ble valgt fordi de er velig dysregulerte i en vesentlig del av mage adenocarcinomer eller EBV-relatert kreft [32, 54-59]. GAPDH
servert som en endogen kontroll for relative kvantifisering formål. RNA ble omdannet til cDNA ved hjelp av High Capacity cDNA-arkiv Kit (Applied Biosystems), og cDNA ble fortynnet 1:10 med nuklease-fritt vann. Hver 50 mL PCR reaksjon inneholdt: 1X TaqMan ® Universal Master Mix, 1X Target Gene Expression analyse eller GAPDH
Endogen kontroll mix, og 10 ul cDNA. For å se etter fragment forurensning, hver uttrykk analyse på hver plate inneholdt minst to "ingen mal" styrer hvor nukleasefritt vann ble byttet ut med mal. Termo vilkår og dataanalyse var som beskrevet ovenfor for SYBR Grønn rtPCR.
Demety Behandling og Sekvensering av Bisulfite-modifisert DNA
å studere effekten av demetylering, AGS og AGS-B95-HygB magekreftcellelinjer ble vokst til 75% konfluens og deretter i tre påfølgende dager 1 mikrometer av fersk 5-aza-2'-deoxycytidine (5aza, Sigma) ble lagt til daglig. På den fjerde dag ble RNA og DNA høstet fra behandlede og ubehandlede kulturer. RNA ble evaluert for genuttrykk nivåer, og DNA ble undersøkt for metylering etter natriumbisulfitt behandling (EZ DNA Metylering Kit, Zymo Research, Orange, CA) for å konvertere unmethylated cytosines til uracil, samtidig denaturert cytosines uendret [60]. Den positive kontroll var CpGenome Universal denaturert DNA (Chemicon) utsettes for den samme bisulfitt konvertering, og kontroll primere målrettet mot C8orf4
cellulære genpromoteren bekreftet vellykket bisulfitt konvertering av hver DNA-prøve [61]. CpG øyer ble identifisert ved hjelp av CpG Tomt for hver av fem menneskelig genes-- ICAM1 plakater (RefSeq # NM_00201), CDKN2A (p16) plakater (RefSeq # NM_000077.3), ID4 plakater (RefSeq # NM_001546), COX2 product: (RefSeq # NM_000963), og TFF1 plakater (RefSeq225,2) - som promotersekvenser (3000 basepar oppstrøms for transkripsjonsstartsetet gjennom ekson 1) ble lastet ned fra GenBank. Følgende parametere for CpG island identifikasjon ble brukt: minimum lengde på 200 bp, minimum gjennomsnittlig andel av C + G på 50%, og minimum gjennomsnittlig forholdet mellom observert forventet C + G på 0,6 [62]. Å identifisere CpG tette regioner for COX2 Hotell og TFF1
ble minimumslengden parameter redusert til 50 bp [61]. Primersekvensene er vist i tabell 1. Hver 50 pl PCR-reaksjon inneholdt: 1X PCR-buffer, 2 mM MgCl <sub>2, en enhet platina Taq DNA-polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA), 0,2 mM dNTP (ABI), og 30 pmol av hver primer. Termocykling Betingelsene var: 94 ° C i 2 minutter, 40 sykluser ved 94 ° C i 30 sekunder, 55 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 1 minutt, 72 ° C i 10 minutter. For å overvåke amplicon forurensning, hvert løp inneholdt en "no mal" kontroll der nukleasefritt vann ble byttet ut med templateTable en Bisulfite Omregnet Gene-Specific PCR-primer Sekvenser
ICAM1

Videre
5'-TGG GGG TTG TGG TTT TAG TT-3 '

Omvendt
5'-CTC CCT CCA CTA AAA AC-3'
Amplicon størrelse
412 bp
CDKN2A (p16)
Forward
5'-AGA TGT TTT GTG GTT GTT GTG A-3 '
Omvendt
5'-CAA AAA TCT TCC ATT CTT CAA AC -3 '
Amplicon størrelse
418 bp
ID4
Forward
5'-TTT TTT GGG TAT ATA TTA GTT TGG-3'
Omvendt
5'-TAT CCT AAT CAC TCC CTT C-3 '
Amplicon størrelse
477 bp
COX2
Forward
5'-TAT GTG TTG TAT ATA GAG TAG A-3'
Omvendt
5'-AAA AAA TAA TCC CCA CTC TC -3 '
Amplicon størrelse
399 bp
TFF1
Forward
5'-TTA GGT TGG AGT GTA GTA GG-3'
omvendt
5'-CCT ACT CAT ATC TAA AAA ACC C-3 '
Amplicon størrelse
489 bp
C8orf4 kontroll
Forward
5'-GAA TTA AAA TAT AAG GAG AGT TTT-3 '
Omvendt
5'-AAC ATT ACC CAA ACA TAA AAC AA-3'
Amplicon størrelse
328 bp
Sekvensering ble utført på amplikonene av bisulfitt behandlet maler for å identifisere de denaturert og unmethylated CPGs med eller uten 5aza behandling. Først ble hver PCR-produkt klonet inn i pGEM-T-vektoren ved hjelp av pGEM-T Easy vektor System II (Promega) og transformert i JM109 høyeffektive kompetente celler. Hvite kolonier inneholdende innskudd ble valgt og dyrket natten over og plasmid-DNA ble ekstrahert ved hjelp av QiaPrep Spin Miniprep Kit (Qiagen). Sekvensering ble gjort på en ABI 3100 Genetic Analyzer bruker ABI PRISM ™ BigDye ™ Versjon 1.1 Terminator Cycle Klar Reaction Kit med AmpliTaq DNA Polymerase og en M13R3 primer. Resultatene ble lastet inn Sequencher programvare (genet koder, Ann Arbor, MI) for å oppnå det motsatte kompliment av hver sekvens, og både forover og bakover sekvenser ble justert og analysert for å skille unmethylated cytosines fra denaturert cytosines.
Western Blot på AGS cellelinje
grunn av muligheten for COX2 hemmere for å overvinne COX2 effekter, RNA-baserte resultater for COX2 ble valgt for oppfølgingsstudie på protein-nivå. Konfluent AGS-celler med eller uten EBV ble høstet med 0,25% trypsin, vasket to ganger i fosfat-bufret saltvann, og pelletert ved sentrifugering. Celler ble resuspendert i 500 ul NP-40 cellelyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, pH 8,0), inkubert på is i 30 minutter, og sentrifugert ved 12000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C. Aliquoter av lysat (ved 50, 100, 150 ug protein per brønn) ble løst ved hjelp av SDS-PAGE på en tris-glysin 4-20% gradientgel (Invitrogen) og overført til en nitrocellulosemembran. COX2 ble påvist med en 1: 5000 fortynning av monoklonalt antistoff etterfulgt av en 1: 10000 fortynning av sekundært antistoff konjugert med alkalisk fosfatase (Amersham Biosciences), og visualisering med en tyfon PhosphorImager (Molecular Dynamics). Band tetthet målt semi-kvantitativt og normalisert til beta aktin (ACTB) ble sammenlignet mellom infiserte og uinfiserte AGS celler.
Resultater
EBV infeksjon av AGS Gastric kreftceller
Vellykket EBV infeksjon av AGS magekreftceller ble bekreftet ved hjelp av seks Q-PCR-analyser rettet mot ulike segmenter av EBV genomet. EBER
in situ
hybridisering viste ingen EBER
uttrykk i foreldre "EBV-negative" AGS celler, mens mer enn 90% av AGS-B95-HygB cellene EBER
-positivt og hadde aktivert -appearing kjernemorfologi (figur 1). Utbredelsen sats ble økt som vist ved samløpet av dyrkede AGS-B95-HygB celler tre dager før foreldre AGS celler. Infeksjonen vedvarte i minst 4 måneder, som vist av GFP og EBER
histochemical flekker. EBV latent (LMP1 og LMP2A) og lytisk (BZLF1 og BMRF1) proteiner ble ikke uttrykt i uinfiserte AGS celler, mens ~ 10% av infiserte celler uttrykte LMP1, halvparten av cellene uttrykte LMP2A, og ~ 35% uttrykt BMRF1 og BZLF1 proteiner antyde aktiv virusreplikasjonen (figur 1). Figur 1 AGS-B95-HygB celler uttrykker latente og lytiske virale gener. A) Immunhistokjemisk flekk for GFP antyder hygromycin B-behandlede AGS celler ble jevnt smittet av den konstruerte B95.8 EBV genom. B) EBER in situ
hybridisering indikerer latent infeksjon i > 90% av cellene. Nuclear EBER
flekker skåner nucleoli, og forstørrede nukleoli er en markør for cellulær aktivering. Latent viral proteiner lmp1 (C) og LMP2 (D) ble uttrykt fokalt. Lytiske virale proteiner, BMRF1 (E) og BZLF1 (F), ble uttrykt i en betydelig andel av AGS-B95-HygB celler. (GFP og BMRF1 flekker, 800x, LMP1, LMP2, EBER Kjøpe og BZLF1 flekker, 1200X)
Cellular genuttrykk Forskjeller i EBV-positive versus EBV-negative AGS Cells
Expression nivåer av 96 cellulære gener ble analysert i AGS og AGS-B95-HygB celler ved hjelp av lav tetthet microarray analyse med kjemiluminescens deteksjon (figur 2). Etter normalisering til GAPDH
, parvise sammenligningen av genuttrykk nivåer mellom de EBV-positive og EBV-negative AGS celler viste at de 96 genene på microarray, 43 ble dysregulerte minst to ganger etter EBV infeksjon. Overraskende ble det observert en EBV-assosiert økning i uttrykket for bare seks gener (IGFBP3
, GADD45, IRF1, grp78 /HSPB1, GLUT1 /SLC2A1, TMEPAI
), mens redusert uttrykk ble observert for de resterende 37 feilregulert gener (ABCB1, BCL2L1, BIRC2, BNIP2, CDKN2A, DUSP1, HIF1A, ICAM1, ID2, NFKB1, COX2, TFRC, VCAM1, WISP1, TRIM25, IL2, BMP4, MDM2, CCND1, CDK2, BAX, p57, p19, CSN2, CXCL9 , IL4, juni, KLK3, LTA, MMP7, PPARG, TNFRSF10B, WIG1, WNT2, PTCH2
). Figur 2 genuttrykksmønster er endret av EBV infeksjon av AGS celler. Biotin-merket cDNA prober kledd i fire på en nylonmembran hybridiserer til RNA isolert fra AGS og AGS-B95-HygB celler. Kjemiluminescerende signaler tyder på feilregulering av utvalgte gener blant de 96 på tabellen sammenlignet med kontroll gener i de to siste radene.
SYBR Grønn rtPCR ble brukt til å sjekke microarray funn for 26 av de feilregulert gener og for 12 flere gener som ingen signifikant endring ble observert på microarray. Større enn to gangers endring i mRNA-nivå i infiserte versus
uinfiserte celler ble funnet for 16/26 gener (tabell 2). Genene sterkest berørt var IGFBP3 Hotell som ble oppregulert med 42 ganger, og COX2, BMP4, og ICAM1 Hotell som ble nedregulert av 35-, 32-, og 22-fold, henholdsvis. De resterende ti microarray-baserte endringer ble ikke bekreftet av rtPCR, noe som tyder på at EBV-relaterte feilregulering av disse faktorene var lavere enn todelt. I ett tilfelle var det en stor forskjell: Expression nivåer av BCL2L1
av microarray analyse viste en todelt nedgang
i infiserte celler mens rtPCR gjentatte ganger viste en femdobling
i BCL2L1
mRNA nivåer i infiserte celler. Mindre dramatiske forskjeller ble funnet ved ytterligere 12 gener ble analysert ved rtPCR, med betydelig (mer enn to gangers) forandringer funnet i uttrykket av 5/12 gener som ingen endring ble observert i microarray (tabell 2) .table 2 gener feilregulert i EBV-positive AGS Cells
Gene Navn
Gene Symbol
ganger endring *
downregulated Genes
grunnleggende leucin-glidelås transkripsjonsfaktor, ATF-lignende
BATF
-38
cyklooksygenase-2
COX2
-35
bein morphogenic protein-4
BMP4
-32
inter adhesjonsmolekyl-1
ICAM1
-22
trekløverfaktor-1
TFF1
-21
hemmer av DNA-binding-2
ID2
-14
heat shock protein-70
HSP70
-10
cyclin-avhengig kinase-2
CDK2
-9
cyclin-D1
CCND1
-9
hypoksi induserbar faktor-1A
HIF1A
-9
brystkreft-en
BRCA1
-7
nucleostemin
NU
-7
cyclin-avhengig kinase inhibitor-2A
CDKN2A /p16
-6
hemmer av DNA-binding-4
ID4
-6
engrailed-en
EN1
-5
ATP-bindende kassett, sub-familie B, medlem 1
ABCB1
-3
MDM2 p53 bindende protein
MDM2
-3
oppregulert Gener
insulin-like growth factor binding protein-3
IGFBP3
40
tumor nekrose faktor reseptor-assosiert factor-1
TRAF1
20
trans prostata androgen-indusert protein
TMEPAI
10
tumor nekrose faktor, super medlem-10
TNFSF10
8
B-celle lymfom-to-lignende -1
BCL2L1
7
baculoviral IAP gjenta inneholder-3
BIRC3
5
heksokinaseløsning-en
Ht1</sub></sup>